一种实现核酸物质递送的纳米递送系统、其制备方法及应用与流程

1.本发明涉及核酸递送系统，特别涉及一种具有阳离子-超分子结构的纳米递送系统，还涉及其制备方法与药物领域中的应用。


背景技术：

2.基因疗法是通过基因转移技术将外源基因导入受体细胞以治疗由基因缺陷引起的疾病，基因疗法包括寡核苷酸的药物，如dna、rna、crispr及其组合。
3.然而，核酸药物想要进入体内主要面临3大难关：1)包括dna和rna在内的核酸的分子量和负电荷及其柔性链段结构，导致其很难通过生物膜进入细胞中发挥作用，如何有效将其递送进入细胞核仍旧是制约其药物发展的难题。2)rna容易被血浆和组织中rnase降解，同时长链rna自身稳定性较差，dna和rna进入人体血液后易被肝脏和肾脏快速清除和被免疫系统识别。3)进入细胞后，dna和rna易被滞留在内涵体中直至被细胞内各类水解酶进行降解，从而无法发挥作用。对核酸物质进行高效稳定的递送是克服核酸类药物发展所面临的技术障碍的关键。
4.近些年，以lnp和lpp为代表的非病毒类载体在核酸递送方面的实现备受瞩目，其中lnp的结构组成为阳离子脂、胆固醇、磷脂和聚乙二醇脂质，lpp的结构组成则为阳离子聚合物、胆固醇、磷脂和聚乙二醇脂质，另外研究者们又开发出基于聚合物的递送体系，其分子组成通常为阳离子脂、聚合物、聚乙二醇衍生物。
5.但是这些递送体系的表面都需要用聚乙二醇衍生物进行稳定，而聚乙二醇化的表面会影响细胞对于纳米颗粒的摄取能力。此外，多次注射peg化脂质可诱发免疫反应，从而影响药物的体内效力。除此之外，传统的脂质纳米粒系统包含至少四种成分，其成分的复杂性对于递送系统性能的优化、质控和cmc方法均有着较大的挑战性。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种新的能够实现核酸物质递送的纳米递送系统，期望其具有较简单的成分，且表面无需经聚乙二醇衍生物进行稳定，而且具备更好的稳定性和核酸素质包封率。
7.为了实现上述目的，本发明提供一种纳米递送系统，其特征在于所述纳米递送系统包括核酸物质、阳离子物质成分和超分子物质，其中，阳离子脂物质与核酸物质通过静电作用形成阳离子分子-核酸物质复合纳米颗粒，所述复合纳米颗粒再与超分子物质通过分子间作用力结合完成对核酸物质的有效包封；所述超分子物质是吲哚箐绿、吲哚箐绿衍生物或吲哚箐绿结构类似物；所述阳离子物质成分是阳离子脂质、可电离脂质、氨分子衍生物、铵盐及其衍生物、正电蛋白质或正电多肽物质。
8.在本发明中，所述核酸物质是dna和/或rna，其中，dna是双链dna和/或单链dna，rna是双链rna和/或单链rna。
9.进一步地，所述rna是反义核酸(aso)、小干扰rna(sirna)、小向导rna(sgrna)、微
小rna(mirna)、小激活rna(sarna)、信使rna(mrna)、环状mrna和/或自复制mrna。
10.在本发明中，术语“超分子物质”可以是一种分子通过分子间作用力形成的物质，也可以是多种分子通过分子间作用力形成的物质。其中，同一种分子通过分子间作用力形成有序的分子聚集体，即超分子结构，其分子间作用力可以是静电作用、氢键、π-π堆积作用和疏水作用或范德华力中的至少一种作用力。而由多个分子间作用力形成的超分子结构，其选自环状配体组成的主客体体系，或者是由两个或两个以上基团用柔性链或刚性链连接而成的超分子物质，其稳定分子结构的分子间作用力是静电作用、氢键、π-π堆积作用和疏水作用或范德华力中的至少一种作用力。
11.作为一种优选的实施方式，所述超分子物质可以采用的物质包括：所述吲哚箐绿衍生物选自吲哚菁绿-羧酸、吲哚菁绿-琥珀酰亚胺酯或吲哚菁绿-氨基，所述吲哚菁绿结构类似物选自染料ir-820、ir-780碘、ir-806、cy3、cy5或cy7及它们的衍生物。或者至少其中一种与其他具备与其发生静电作用、氢键、π-π堆积作用和疏水作用和范德华力作用的分子中至少其中一种的分子，如携带碳链长度为6
–
24个碳原子的疏水烷烃链结构的物质、存在如单双键交替或者苯环结构在内的共轭结构的物质和带正电的分子，其作用为稳定超分子结构、增强分散性和/或增强自组装能力。
12.在本发明中，所述阳离子物质成分可以采用的物质包括：阳离子脂质，选自dotap(cas：132172-61-3)、dodap(cas：127512-29-2)、dotma(cas：104872-42-6)或dodma(cas：104162-47-2)；可电离脂质，选自alc-0315(cas：2036272-55-4)、sm-102(cas：2089251-47-6)、dlin-mc3-dma(cas：1224606-06-7)及其类似物；氨分子衍生物，聚乙烯亚胺(pei)、聚酰胺树枝型分子(pamam dendrimer)、壳聚糖和脱乙酰化壳聚糖及其衍生物等；铵盐及其衍生物，如具备季铵盐结构的两亲性化合物等；正电蛋白质，如组蛋白、鱼精蛋白及富含赖氨酸、精氨酸或组氨酸的蛋白质等；正电多肽，如细胞穿膜肽、细胞穿透肽等富含赖氨酸、精氨酸或组氨酸的多肽及基于这些多肽做共价修饰的两亲性化合物中的至少一种。
13.其中，一种优选的方案采用烷基改性聚氨基树枝状分子g0-c14(cas：1510653-27-6)。该物质可以通过第0代pamam dendrimer(cas：155773-72-1，分子量：516.68)和1,2-环氧十四烷共价反应制备得到，也可以商业购买获得。
14.根据另一种优选的实施方式，本发明的纳米递送系统通过微生物纳米薄膜、peg化脂质、蛋白质或者多肽进行修饰。
15.其中，聚乙二醇衍生物是磷脂peg聚合物，所述磷脂peg聚合物选自dspe-peg或dope-peg，所述peg脂质化合物选自alc-0159或m-dmg-2000，所述多肽选自靶向性多肽rgd或细胞穿膜肽，所述蛋白质选自人血清白蛋白、鱼精蛋白、组蛋白或抗体，所述抗体是her2抗体。
16.基于此，本发明还提供上述纳米递送系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：
17.(1)制备超分子物质溶液
18.配置浓度为0.01-100mg/ml的吲哚菁绿水溶液，经充分震荡和超滤后，重新分散在超纯水中得到浓度为1mg/ml的经过纯化的超分子物质溶液；
19.(2)制备阳离子物质成分
20.取1mmol的pamam树枝状聚合物和9mmol的1,2-环氧十四烷在在油浴60-120℃和300-2000rpm的搅拌速度下反应12-72h，反应结束后，向体系中加入50ml甲醇以稀释反应产
物，然后将反应产物转移至截留分子量为1000da的透析袋中，透析后的产物经冷冻干燥得到阳离子物质成分g0-c14；
21.(3)制备阳离子-核酸复合物溶液
22.配制浓度为2.5mg/ml g0-c14的dmf溶液，取5μl g0-c14的dmf溶液与2.5μl浓度为1mg/ml的核酸物质的水溶液混合均匀，静置30s-15min得到阳离子-核酸复合物溶液；
23.(4)制备负载核酸物质的纳米递送系统
24.取25μl经过纯化的超分子物质溶液与7.5μl阳离子-核酸复合物溶液混合均匀，充分搅拌后进行超滤，得到负载核酸物质的纳米递送系统。
25.其中，步骤(1)的充分震荡是指在70℃、300-800rpm条件下5-10h。超滤所用的超滤膜的截留分子量优选为10000da。
26.而步骤(4)的超滤所用的超滤膜的截留分子量优选为100kda。
27.根据一种优选的实施方式，所述制备方法还包括步骤：
28.(5)分散性修饰
29.将负载核酸物质的纳米递送系统与分散性修饰溶液进行反应，所述分散性修饰溶液是含有聚乙二醇衍生物、peg脂质化合物、多肽、或蛋白质的溶液，负载核酸物质的纳米递送系统中，核酸物质与分散性修饰溶液中溶质的质量比为100:1
–
1:10。
30.可选地，所述制备方法还包括步骤：
31.(6)纳米薄膜修饰
32.首先制备纳米薄膜溶液制备：取乳酸菌发酵液，经离心获得乳酸菌菌体，所得菌体在探头超声条件下进行kmno4氧化处理10min，kmno4浓度为0.1
–
10mg/ml，所得产物经离心和超滤纯化即得到纳米薄膜溶液；
33.取步骤(4)或步骤(5)所得纳米递送系统，配制为以核酸物质浓度计0.1mg/ml的溶液，取10μl该溶液与10μl浓度为1mg/ml的纳米薄膜溶液混合均匀，充分搅拌后得到经过纳米薄膜修饰的纳米递送系统。
34.优选地，步骤(5)中，聚乙二醇衍生物是磷脂peg聚合物，所述磷脂peg聚合物选自dspe-peg或dope-peg，所述peg脂质化合物选自alc-0159或m-dmg-2000，所述多肽选自靶向性多肽rgd或细胞穿膜肽，所述蛋白质选自人血清白蛋白、鱼精蛋白、组蛋白或抗体，所述抗体是her2抗体。
35.步骤(6)中的探头超声条件是指采用超声波细胞破碎仪，在功率6.5-650w下超声处理10min。
36.基于此，本发明还提供上述纳米递送系统在制备药物和或疫苗中的应用。
37.本发明通过实验验证了超分子结构与阳离子物质成分可以成功包封核酸物质以形成球状纳米颗粒，也验证了经过修饰后，纳米薄膜成功地实现了对mrna递送系统的修饰。
38.本发明的纳米递送系统在水溶液中具有良好的溶液稳定性，其粒径和zeta电位在72h内无明显变化。
39.此外，以负载luciferase mrna的递送系统为例，实验证明icg-luc在各浓度对细胞的损伤很小，证明了该递送策略良好的生物相容性，而负载可编译抑癌基因p53蛋白的mrna的icg-p53对癌细胞随浓度提升而提高的细胞毒性，证明了p53mrna成功递送进入细胞并表达出可引起细胞死亡的p53蛋白。以上结果均证明了该递送系统在制备药物和疫苗方
面的巨大应用潜力。
附图说明
40.图1为实施例1的icg水溶液和dicg溶液在500-1000nm处的吸收光谱；
41.图2为实施例1的dicg溶液tem表征和粒径统计结果；
42.图3为实施例1的dicg、g0-c14以及mrna通过分子间作用形成的纳米材料tem表征和粒径统计结果；
43.图4为实施例1的纳米薄膜溶液tem表征；
44.图5为实施例1的经过纳米薄膜修饰的纳米递送系统tem表征和粒径统计结果；
45.图6为实施例1的经过修饰的纳米递送系统的水溶液的水和动力学直径随着4℃存放时间延长的变化；
46.图7为实施例1的经过修饰的纳米递送系统在水溶液分散中的zeta电位随着4℃存放时间延长的变化；
47.图8为通过实施例1制备的负载luciferase mrna和p53 mrna纳米材料的体外细胞毒性测试结果；
48.图9egfp荧光成像及流式细胞仪检测实验结果；
49.图10为通过luciferase mrna评价实验优化配方中icg含量的实验结果。
具体实施方式
50.以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
51.在本发明中，如无特殊说明，用于解释浓度的“％”为质量百分比，“：”为质量比。
52.本发明涉及以下试剂，均为市场上可以购买获得的产品：
53.mrna选用renila luciferase mrna，采购自trilink公司；sirna来自trilink公司，dna来自实验室自产；超分子物质单体选用吲哚菁绿分子(icg)，采购自sigma公司；pamam树枝状聚合物(cas号:155773-72-1)购自上海瀚香生物科技有限公司；1,2-环氧十四烷(cas号:3234-28-4)购自广州和为医药科技有限公司。
54.实施例1制备纳米递送系统
55.制备超分子物质溶液
56.称取并配制浓度为1mg/ml的icg水溶液，于避光、70℃环境中静置处理7h，所得溶液再经超滤(截留分子量为10000da，三次，离心条件为：4000rpm，室温，15min)，然后重新分散在超纯水中得到1mg/ml的dicg超分子结构纳米材料溶液。
57.icg水溶液和dicg超分子结构纳米材料溶液分别经紫外分光光度计测试500-1000nm处的吸收光谱结果，如图1所示。图1显示与icg的吸收光谱相比，dicg的吸收光谱发生了红移，造成这一结果的原因是icg在处理过程中发生了分子间聚集。
58.dicg超分子结构纳米材料溶液经透射电镜进行表征，如图2所示。其中，透射电镜采用jeol-2100型透射电子显微镜；测试条件：200kv，101μa；且待测纳米粒子分散于水中进行测试。结果显示，聚集后形成的dicg纳米结构大小在21nm，进一步佐证了经加热处理后游离的icg分子通过分子间作用力堆叠形成了粒径分布均一的纳米片超分子结构。
59.制备阳离子脂质
60.将10mmol的pamam树枝状聚合物(cas号：155773-72-1)和90mmol的1,2-环氧辛烷(cas号：2984-50-1)加入200ml玻璃样品瓶中得到混合反应液，在油浴90℃和800rpm的搅拌速度下敞开玻璃样品瓶口反应5小时，让甲醇挥发。然后拧紧玻璃样品瓶瓶塞，继续在油浴90℃和800rpm的搅拌速度下反应48小时。反应结束后，玻璃样品瓶中加入50ml甲醇，稀释反应产物，将反应产物转移至截留分子量为1kda的透析袋中。上述溶液透析2天，第1天用透析溶液透析(透析溶液为以体积比计8:2的为n,n-二甲基甲酰胺和乙醇的混合溶液)以移除未反应的1,2-环氧辛烷，第2天用水透析以移除有机溶剂，得到阳离子脂质g0-c14。
61.制备阳离子-核酸复合物溶液
62.配制含2.5mg/ml g0-c14的dmf溶液，取5μl该溶液与2.5μlmrna水溶液(1mg/ml)混合均匀，静置5min即得到阳离子-核酸复合物溶液，其中g0-c14与mrna物质的质量比为5:1。
63.制备负载mrna的纳米递送系统
64.取7.5μl阳离子-核酸复合物溶液(其中含核酸物质为2.5μg)与25μl浓度为1mg/ml的dicg超分子结构纳米材料溶液轻混均匀(核酸物质与dicg的质量比为1:10)，室温下持续搅拌15min后进行3次超滤(截留分子量为100kda)，得到经过纯化的负载mrna的纳米递送系统。
65.所得纳米材料溶液经透射电镜进行表征，如图3所示。其中，透射电镜采用jeol-2100型透射电子显微镜；测试条件：200kv，101μa；且待测纳米粒子分散于水中进行测试。结果显示，超分子结构dicg与阳离子分子g0-c14可以成功将mrna进行包封形成球状纳米颗粒，其平均大小为130nm，证明了二者在实现mrna递送方面的巨大潜力。
66.基于此方法，制备负载不同mrna的纳米递送系统用于后续实验：用表达luciferase的mrna制备得到的纳米系统命名为g0c14-luci-icg或者luc-icg，用表达绿色荧光蛋白的mrna制备得到的纳米系统命名为g0c14-egfp-icg，用表达p53蛋白的mrna制备得到的纳米系统命名为p53-icg，用不表达任何蛋白的mrna制备得到的纳米系统命名为空载纳米系统(即blank)。
67.纳米薄膜修饰
68.从市场购买获得yakult乳酸菌饮料，经离心处理取得乳酸菌菌体，所得菌体在探头超声条件(超声波细胞破碎仪，功率：6.5-650w，超声时间：10min)下进行kmno4氧化处理10min(kmno4浓度为1mg/ml)，所得产物经离心和超滤纯化得到纳米薄膜溶液。
69.所得纳米薄膜溶液经透射电镜进行表征，如图4所示。其中，透射电镜采用jeol-2100型透射电子显微镜；测试条件：200kv，101μa；且待测纳米粒子分散于水中进行测试。
70.结果表明纳米材料呈薄膜状，但因为tem样品制备过程中的脱水作用导致薄膜发生了一定的空间折叠，经对折叠后的纳米薄膜进行粒径大小统计，其平均大小为50nm。
71.将经过纯化的负载mrna的纳米递送系统g0c14-luci-icg(mrna浓度0.1mg/ml)10μl与10μl纳米薄膜溶液(浓度为1mg/ml)混合均匀，500rpm下搅拌15min，得到经过修饰的纳米递送系统g0c14-luci-icg。
72.所得经过修饰的纳米递送系统g0c14-luci-icg经透射电镜进行表征，如图5所示。其中，透射电镜采用jeol-2100型透射电子显微镜；测试条件：200kv，101μa；且待测纳米粒子分散于水中进行测试。
73.结果显示，纳米薄膜修饰不改变修饰前的球形颗粒的形貌，但其颗粒大小由修饰
前的130nm增大至170nm，证明了纳米薄膜成功地实现了对mrna递送系统的修饰。
74.测试所得经过修饰的纳米递送系统g0c14-luci-icg递送系统的稳定性。将该纳米递送系统的水溶液在室温中避光放置，检测粒径和zeta电位随时间的变化关系，结果如图6-7所示。该结果由动态光散射仪测得。
75.其结果表明，修饰后的纳米颗粒水溶液在72小时放置后，其粒径和zeta无明显变化，证明了修饰后纳米材料的溶液稳定性和良好水相稳定性。
76.实施例2采用不同吲哚菁氯衍生物制备超分子物质溶液
77.称取并配制浓度为1mg/ml的icg吲哚菁氯衍生物的水溶液，吲哚菁氯衍生物分别为吲哚菁绿-羧酸、吲哚菁绿-琥珀酰亚胺酯和吲哚菁绿-氨基(本领域技术人员也可以采用其他吲哚菁氯衍生物)，于避光、4℃环境中静置处理30d，所得溶液再经超滤(截留分子量为10000da，三次，离心条件为：4000rpm，室温，15min)，然后重新分散在超纯水中得到1mg/ml的超分子结构纳米材料溶液，分别命名为：dicg-羧酸、dicg-琥珀酰亚胺酯和dicg-氨基(或根据吲哚菁氯衍生物的具体选择命名为dicg-xxx，其中xxx为icg修饰基团，下同)
78.实施例3制备超分子物质溶液
79.称取并配制浓度为100mg/ml的icg吲哚菁氯衍生物的水溶液，icg吲哚菁氯衍生物分别采用吲哚菁绿-羧酸、吲哚菁绿-琥珀酰亚胺酯和吲哚菁绿-氨基(本领域技术人员也可以采用其他吲哚菁氯衍生物)，于避光、90℃环境中静置处理1h，所得溶液再经超滤(截留分子量为10000da，三次，离心条件为：4000rpm，室温，15min)，然后重新分散在超纯水中得到1mg/ml的超分子结构纳米材料溶液，分别命名为：dicg-羧酸、dicg-琥珀酰亚胺酯和dicg-氨基。
80.实施例4采用不同icg结构类似物制备超分子物质溶液
81.称取并配制浓度为1mg/ml的icg结构类似物水溶液，icg结构类似物分别为ir-820、ir-780碘、ir-806、cy3、cy5及cy7染料，于避光、4℃环境中静置处理30d，所得溶液再经超滤(截留分子量为10000da，三次，离心条件为：4000rpm，室温，15min)，然后重新分散在超纯水中得到1mg/ml的超分子结构纳米材料溶液，分别命名为dir-820、dir-780碘、dir-806、dcy3、dcy5和dcy7。
82.实施例5制备超分子物质溶液
83.称取并配制浓度为100mg/ml的icg结构类似物水溶液，icg结构类似物分别为ir-820、ir-780碘、ir-806、cy3、cy5及cy7染料，于避光、90℃环境中静置处理30d，所得溶液再经超滤(截留分子量为10000da，三次，离心条件为：4000rpm，室温，15min)，然后重新分散在超纯水中得到1mg/ml的超分子结构纳米材料溶液，
84.分别命名为dir-820、dir-780碘、dir-806、dcy3、dcy5和dcy7。
85.实施例6采用不同可电离脂质制备阳离子-核酸复合物溶液
86.通常，配制含0.1-25mg/ml含阳离子物质的水、dmf或者乙醇溶液，取5μl该溶液与2.5μl mrna水溶液(1mg/ml)混合均匀，静置2-60min即得到阳离子-核酸复合物溶液，其中阳离子物质与mrna物质的质量比为0.2-50:1。
87.具体地，在本实施例中，分别配制三种含2.5mg/ml含可电离脂质(分别为alc-0315、sm-102或dlin-mc3-dma)的乙醇溶液，取5μl该溶液与2.5μl mrna水溶液(1mg/ml)混合均匀，静置10min即得到可电离脂质-核酸复合物溶液，其中可电离脂质与mrna物质的质
量比为5:1。
88.实施例7采用不同阳离子脂质制备阳离子脂质-核酸复合物溶液
89.分别配制四种含2.5mg/ml含有阳离子脂质的乙醇溶液，阳离子脂质分别选用dotap、dodap、dotma和dodma，取5μl所得溶液与2.5μl mrna水溶液(1mg/ml，采用luciferase mrna)混合均匀，静置10min即得到阳离子脂质-核酸复合物溶液，其中阳离子脂质与mrna物质的质量比为5:1。
90.实施例8采用不同多氨基物质制备多氨基物质-核酸复合物溶液
91.分别配制四种含2.5mg/ml多氨基物质的水溶液，其中多氨基物质分别选用聚乙烯亚胺(pei)、聚酰胺树枝型分子(pamam dendrimer)、壳聚糖和脱乙酰化壳聚糖(本领域技术人员也可以选用其衍生物)。取5μl所得溶液与2.5μl mrna水溶液(1mg/ml)混合均匀，静置10min即得到多氨基物质-核酸复合物溶液，其中多氨基物质与mrna物质的质量比为5:1。
92.实施例9采用不同正电蛋白质制备正电蛋白质-核酸复合物溶液
93.分别配制两种含2.5mg/ml带正电蛋白质(分别采用组蛋白和鱼精蛋白)的水溶液，取5μl该溶液与2.5μl mrna水溶液(1mg/ml)混合均匀，静置10min即得到正电蛋白质-核酸复合物溶液，其中正电蛋白质与mrna物质的质量比为5:1。
94.实施例10采用正电多肽制备阳离子-核酸复合物溶液
95.分别配制含2.5mg/ml带正电多肽(结构通式km-rn-hp-xq中的一种，其中m,n,p,q为0-12的整数，x为除k/r/h之外的氨基酸，k、r、h和x的排列不分先后顺序)及其多肽衍生物的水溶液，取5μl该溶液与2.5μl mrna水溶液(1mg/ml)混合均匀，静置10min即得到阳离子-核酸复合物溶液，其中阳离子物质与mrna物质的质量比为5:1。
96.实施例11采用阳离子-核酸复合物溶液制备负载mrna的纳米递送系统
97.取2.5μl实施例1中制备的浓度为1mg/ml的超分子结构纳米材料溶液(dicg)7.5μl与实施例1所制备的阳离子-核酸复合物溶液(g0c14-mrna，其中含核酸物质为2.5μg)轻混均匀(核酸物质与dicg的质量比为1:1)，室温下持续搅拌24h后进行3次超滤(截留分子量为100kda)，得到经过纯化的负载mrna的纳米递送系统。
98.实施例12采用可电离脂质-核酸复合物溶液制备负载mrna的纳米递送系统
99.取100μl实施例1中所制备的浓度为1mg/ml的超分子结构纳米材料溶液轻混均匀与7.5μl实施例6所制备的任意一种可电离脂质-核酸复合物溶液(其中含核酸物质为2.5μg)，室温下持续搅拌24h后进行3次超滤(截留分子量为100kda)，得到经过纯化的负载mrna的纳米递送系统。
100.实施例13采用阳离子脂质-核酸复合物溶液制备负载mrna的纳米递送系统
101.取2.5μl实施例1中所制备的浓度为1mg/ml的超分子结构纳米材料溶液轻混均匀与7.5μl实施例7所制备的任意一种阳离子脂质-核酸复合物溶液(其中含核酸物质为2.5μg)，室温下持续搅拌24h后进行3次超滤(截留分子量为100kda)，得到经过纯化的负载mrna的纳米递送系统。
102.实施例14采用多氨基物质-核酸复合物溶液制备负载mrna的纳米递送系统
103.取2.5μl实施例1中所制备的浓度为1mg/ml的超分子结构纳米材料溶液轻混均匀与7.5μl实施例8所制备的任意一种多氨基物质-核酸复合物溶液(其中含核酸物质为2.5μg)，室温下持续搅拌24h后进行3次超滤(截留分子量为100kda)，得到经过纯化的负载mrna
的纳米递送系统。
104.实施例15采用正电蛋白质-核酸复合物溶液制备负载mrna的纳米递送系统
105.取2.5μl实施例1中所制备的浓度为1mg/ml的超分子结构纳米材料溶液轻混均匀与7.5μl实施例10所制备的任意一种正电蛋白质-核酸复合物溶液(其中含核酸物质为2.5μg)，室温下持续搅拌24h后进行3次超滤(截留分子量为100kda)，得到经过纯化的负载mrna的纳米递送系统。
106.实施例16采用不同浓度超分子结构纳米材料溶液制备负载mrna的纳米递送系统
107.取25μl实施例1中所制备的浓度为1mg/ml的超分子结构纳米材料溶液轻混均匀与7.5μl实施例7所制备的任意一种可电离脂质-核酸复合物溶液(其中含核酸物质为2.5μg)，室温下持续搅拌0.5h后进行3次超滤(截留分子量为100kda)，得到经过纯化的负载mrna的纳米递送系统。
108.实施例17采用不同浓度超分子结构纳米材料溶液制备负载mrna的纳米递送系统
109.取250μl实施例1中所制备的浓度为1mg/ml的超分子结构纳米材料溶液轻混均匀与7.5μl实施例7所制备的任意一种可电离脂质-核酸复合物溶液(其中含核酸物质为2.5μg)，室温下持续搅10min后进行3次超滤(截留分子量为100kda)，得到经过纯化的负载mrna的纳米递送系统。
110.实施例18在不同反应温度下制备负载mrna的纳米递送系统
111.取2.5μl实施例1中所制备的浓度为1mg/ml的超分子结构纳米材料溶液轻混均匀与7.5μl实施例7所制备的任意一种可电离脂质-核酸复合物溶液(其中含核酸物质为2.5μg)，4℃条件下持续搅拌24h后进行3次超滤(截留分子量为100kda)，得到经过纯化的负载mrna的纳米递送系统。
112.实施例19制备负载sirna的纳米递送系统
113.制备阳离子脂质-sirna溶液
114.配制含2.5mg/ml g0-c14的dmf溶液，取10μl该溶液与2.5μlsirna水溶液(sirna序列长度为20nt，浓度为1mg/ml)混合均匀，静置5min即得到g0c14-sirna复合物溶液，其中g0-c14与sirna物质的质量比为10:1。
115.制备负载sirna的纳米递送系统
116.取7.5μl g0c14-sirna(其中sirna含量为2.5μg)与25μl浓度为1mg/ml的dicg超分子结构纳米材料溶液轻混均匀(sirna与dicg的质量比为1:10)，室温下持续搅拌15min后进行3次超滤(截留分子量为10kda)，得到经过纯化的负载sirna的纳米递送系统。
117.实施例20制备负载dna的纳米递送系统
118.制备阳离子脂质-sirna溶液
119.配制含2.5mg/ml g0-c14的dmf溶液，取20μl该溶液与2.5μldna水溶液(dna为一段长度为14000bp的片段，浓度为1mg/ml)混合均匀，静置5min即得到g0c14-dna复合物溶液，其中g0-c14与dna物质的质量比为20:1。
120.制备负载dna的纳米递送系统
121.取7.5μl g0c14-dna(其中dna含量为5μg)与25μl浓度为1mg/ml的dicg超分子结构纳米材料溶液轻混均匀(dna与dicg的质量比为1:5)，室温下持续搅拌30min后进行3次超滤(截留分子量为100kda)，得到经过纯化的负载dna的纳米递送系统。
122.实施例21mrna递送系统稳定性修饰
123.依照实施例1的方法，配制浓度为以mrna浓度计0.1mg/ml负载mrna的纳米递送系统溶液，取10μl该溶液与10μl浓度为1mg/ml的鱼精蛋白水溶液混合均匀后，于500rpm下搅拌15min完成稳定性修饰。修饰过程中，蛋白质与核酸物质的质量比为10:1。
124.实施例22以人血清白蛋白对mrna递送系统进行稳定性修饰
125.取实施例11得到的负载mrna的纳米递送系统，配制浓度为以mrna浓度计0.1mg/ml负载mrna的纳米递送系统溶液，取10μl该溶液与10μl浓度为1mg/ml的人血清白蛋白水溶液混合均匀后，于500rpm下搅拌15min完成稳定性修饰。修饰过程中，蛋白质与核酸物质的质量比为10:1。
126.实施例23以组蛋白对mrna递送系统进行稳定性修饰
127.取实施例11得到的负载mrna的纳米递送系统，配制浓度为以mrna浓度计0.1mg/ml负载mrna的纳米递送系统溶液，取10μl该溶液与10μl浓度为1mg/ml的组蛋白水溶液混合均匀后，于500rpm下搅拌15min完成稳定性修饰。修饰过程中，蛋白质与核酸物质的质量比为10:1。
128.实施例24以peg脂质对mrna递送系统进行稳定性修饰
129.依照实施例1的方法，配制浓度为以mrna浓度计0.1mg/ml负载mrna的纳米递送系统溶液，取10μl该溶液与10μl浓度为1mg/ml的peg脂质(分别采用alc-0159、dmg-peg和dspe-peg)水溶液混合均匀后，于500rpm下搅拌15min完成稳定性修饰。修饰过程中，peg脂质与核酸物质的质量比为10:1。
130.实施例25以多氨基物质对mrna递送系统进行稳定性修饰
131.依照实施例1的方法，配制浓度为以mrna浓度计0.1mg/ml负载mrna的纳米递送系统溶液，取10μl该溶液与10μl浓度为1mg/ml的多氨基物质(分别采用壳聚糖、pei、pamam dendrimer)水溶液混合均匀后，于500rpm下搅拌15min完成稳定性修饰。修饰过程中，多氨基物质与核酸物质的质量比为10:1。
132.实施例26体外细胞评价实验
133.1、细胞毒性试验
134.将100μl的hepg2细胞(1
×
105个细胞/毫升)按照常规方法接种在96孔板中，培养24小时。再将培养基替换为经dmem培养基稀释的不同浓度(以mrna浓度计)的实施例1得到的经过修饰的纳米递送系统(分别使用luc-icg和p53-icg。其中，icg-luc为基于icg超结构的递送系统递送luciferase mrna，icg-p53则是基于icg超解雇的递送系统递送可编译抑癌基因p53蛋白的mrna)的100μl培养基，再孵育24小时。然后将10μl的alamar blue溶液添加到每个孔中，再孵育1小时。
135.用酶标仪测定荧光强度(激发光：540nm，发射光：590nm)，并计算细胞存活率，结果如图8所示。
136.由图中结果，可以看出icg-luc在各浓度对细胞的损伤很小，证明了该递送策略良好的生物相容性，而icg-p53对癌细胞随浓度提升而提高的细胞毒性，证明了p53mrna成功递送进入细胞并表达出可引起细胞死亡的p53蛋白，证明了该递送系统在制备药物方面的巨大应用潜力
137.2、egfp荧光成像及流式细胞仪检测实验
138.将hepg2细胞接种在共聚焦皿上，37℃、5％co2培养箱中培养24小时。然后培养基替换为经dmem培养基稀释的含有实施例1得到的空载递送系统纳米材料或g0c14-egfp-icg递送系统纳米材料的100μl培养基，再孵育24小时。然后用pbs洗涤两次后，通过荧光成像仪成像(488nm激发)。最后，pbs洗涤细胞后经胰酶处理并收集孔中细胞，用流式细胞仪测定细胞在488nm光激发下的荧光强度。
139.结果如图9所示，其中lipo-egfp所指为用lipofectamine基因转染试剂盒转染egfp mrna作为对照组，g0c14-egfp-icg所指为用基于icg和g0-c14的递送系统包封并递送egfp mrna(实施例1中的制备方法)。结果表明所指为用基于icg和g0-c14的递送系统可成功递送egfp mrna进入细胞中并表达egfp蛋白，且可释放出与试剂盒转染组相当的荧光强度，证明了该递送策略不弱于商品化试剂盒转染mrna的能力。
140.3、luciferase mrna的细胞表达实验
141.将100μl的hepg2细胞(1
×
105个细胞/毫升)接种在全黑透明底96孔板中，培养24小时。然后将培养基替换为包含空载递送系统纳米材料或luciferase mrna递送系统纳米材料的100μl的dmem培养基，再孵育24小时。去除培养基，加入荧光素酶底物，5-10分钟后，用酶标仪进行自发光强度测量。
142.结果如图10所示，其中0.5μg/ml与1.0μg/ml分别指与细胞作用的mrna浓度为0.5μg/ml与1.0μg/ml。m(icg)/m(mrna)所指为依照实施例1方法制备luciferase mrna递送系统的icg与mrna的质量比，该实验目的是优化递送系统中icg的占比。
143.图10表明当icg的质量是mrna质量的9倍时，所检测到的luciferase化学发光信号最高，说明在该递送系统中，icg的最优用量为所载mrna质量的9倍质量。而且随着icg占比逐渐升高，最终细胞的化学发光信号整体呈现出先升高后下降的规律，说明过低或者过高的icg含量均不利于mrna的包载。
144.综上所述，本发明成功利用超分子物质与阳离子物质成分包封核酸物质以获得球状纳米颗粒，并验证了纳米薄膜能够成功实现对mrna递送系统的修饰，该纳米递送系统在水溶液中具有良好的溶液稳定性。
145.本发明还验证了该递送系统对细胞的损伤小，具有良好的生物相容性，能够成功递送进入细胞并表达出所负载的蛋白，证明了该递送系统在制备药物和疫苗方面的巨大应用潜力。

技术特征：
1.一种纳米递送系统，其特征在于所述纳米递送系统包括核酸物质、阳离子物质成分和超分子物质，其中，阳离子脂物质与核酸物质通过静电作用形成阳离子分子-核酸物质复合纳米颗粒，所述复合纳米颗粒再与超分子物质通过分子间作用力结合完成对核酸物质的有效包封；所述超分子物质是吲哚箐绿、吲哚箐绿衍生物或吲哚箐绿结构类似物；所述阳离子物质成分是阳离子脂质、可电离脂质、氨分子衍生物、铵盐及其衍生物、正电蛋白质或正电多肽物质。2.根据权利要求1所述的纳米递送系统，其特征在于所述纳米递送系统中，阳离子物质、超分子物质和核酸物质的质量比为阳离子物质：核酸物质＝0.2-50:1，超分子物质：核酸物质＝1-40:1，所述核酸物质是dna和/或rna，其中，dna是双链dna和/或单链dna，rna是双链rna和/或单链rna；所述rna是反义核酸、小干扰rna、小向导rna、微小rna、小激活rna、信使rna、环状mrna和/或自复制mrna。3.根据权利要求1所述的纳米递送系统，其特征在于所述吲哚箐绿衍生物选自吲哚菁绿-羧酸、吲哚菁绿-琥珀酰亚胺酯或吲哚菁绿-氨基，所述吲哚菁绿结构类似物选自染料ir-820、ir-780碘、ir-806、cy3、cy5或cy7及它们的衍生物。4.根据权利要求1所述的纳米递送系统，其特征在于所述阳离子脂质选自dotap、dodap、dotma、dodma及其类似物，所述可电离脂质选自alc-0315、sm-102、dlin-mc3-dma及其类似物，所述氨分子衍生物选自聚乙烯亚胺、聚酰胺树枝型分子、壳聚糖和脱乙酰化壳聚糖及其衍生物，包括铵盐及其衍生物选自具备季铵盐结构的两亲性化合物，所述正电蛋白质选自组蛋白、鱼精蛋白及富含赖氨酸、精氨酸或组氨酸的蛋白质，所述正电多肽选自细胞穿膜肽、细胞穿透肽或富含赖氨酸、精氨酸或组氨酸的多肽及基于这些多肽做共价修饰的两亲性化合物。5.根据权利要求1所述的纳米递送系统，其特征在于所述阳离子物质成分是烷基改性聚氨基树枝状分子g0-c14分子。6.根据权利要求1所述的纳米递送系统，其特征在于所述纳米递送系统通过微生物纳米薄膜、peg化脂质、蛋白质或者多肽进行修饰。7.权利要求1-6中任一项权利要求所述的纳米递送系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)制备超分子物质溶液配置浓度为0.01-100mg/ml的吲哚菁绿水溶液，经充分震荡和超滤后，重新分散在超纯水中得到浓度为1mg/ml的经过纯化的超分子物质溶液；(2)制备阳离子物质成分取1mmol的pamam树枝状聚合物和9mmol的1,2-环氧十四烷在在油浴90℃和800rpm的搅拌速度下反应48h，反应结束后，向体系中加入甲醇以稀释反应产物，然后将反应产物转移至截留分子量为1000da的透析袋中，透析后的产物经冷冻干燥得到阳离子物质成分g0-c14；(3)制备阳离子-核酸复合物溶液配制浓度为2.5mg/ml g0-c14的dmf溶液，取5μl g0-c14的dmf溶液与2.5μl浓度为1mg/ml的核酸物质的水溶液混合均匀，静置30s-15min得到阳离子-核酸复合物溶液；(4)制备负载核酸物质的纳米递送系统
取25μl经过纯化的超分子物质溶液与7.5μl步骤(3)所得阳离子-核酸复合物溶液混合均匀，充分搅拌后进行超滤，得到负载核酸物质的纳米递送系统。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述制备方法还包括步骤：(5)分散性修饰将负载核酸物质的纳米递送系统与分散性修饰溶液进行反应，所述分散性修饰溶液是含有聚乙二醇衍生物、peg脂质化合物、多肽、或蛋白质的溶液，负载核酸物质的纳米递送系统中，核酸物质与分散性修饰溶液中溶质的质量比为100:1
–
1:10；所述聚乙二醇衍生物是磷脂peg聚合物，所述磷脂peg聚合物选自dspe-peg或dope-peg，所述peg脂质化合物选自alc-0159或m-dmg-2000，所述多肽选自靶向性多肽rgd或细胞穿膜肽，所述蛋白质选自人血清白蛋白、鱼精蛋白、组蛋白或抗体，所述抗体是her2抗体。9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于所述制备方法还包括步骤：(6)纳米薄膜修饰首先制备纳米薄膜溶液制备：取乳酸菌发酵液，经离心获得乳酸菌菌体，所得菌体在探头超声条件下进行kmno4氧化处理10min，kmno4浓度为0.1
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10mg/ml，所得产物经离心和超滤纯化即得到纳米薄膜溶液；取步骤(4)或步骤(5)所得纳米递送系统，配制为以核酸物质浓度计0.1mg/ml的溶液，取10μl该溶液与10μl浓度为1mg/ml的纳米薄膜溶液混合均匀，充分搅拌后得到经过纳米薄膜修饰的纳米递送系统。10.权利要求1-9中任一项权利要求所述的纳米递送系统在制备疫苗和/或药物中的应用。

技术总结
本发明提供一种纳米递送系统，所述纳米递送系统包括核酸物质、阳离子物质成分和超分子物质，其中，阳离子脂物质与核酸物质通过静电作用形成阳离子分子-核酸物质复合纳米颗粒，所述复合纳米颗粒再与超分子物质通过分子间作用力结合完成对核酸物质的有效包封；所述超分子物质是吲哚箐绿、吲哚箐绿衍生物或吲哚箐绿结构类似物。本发明还提供上述纳米递送系统在制备药物和或疫苗中的应用。本发明验证了超分子结构与阳离子物质成分可以成功包封核酸物质以形成球状纳米颗粒，经过修饰后，纳米薄膜成功地实现对mRNA递送系统的修饰。该纳米递送系统在水溶液中具有良好的溶液稳定性，并在制备药物和疫苗方面的巨大应用潜力。制备药物和疫苗方面的巨大应用潜力。


技术研发人员：华先武
受保护的技术使用者：华先武
技术研发日：2023.05.16
技术公布日：2023/8/2