一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的方法。


背景技术：

2.褐飞虱是水稻重大害虫之一，不仅可以刺吸汁液为害，还可以传播病毒病为害。准确的虫情预测预报是害虫防治的关键，测报灯下褐飞虱的始见日、迁入量、迁入峰是预测预报的关键依据，也是褐飞虱防治策略制定的关键信息依据。伪褐飞虱和拟褐飞虱是褐飞虱的同属近似种，并不取食水稻，但也具有扑灯习性。褐飞虱(nilaparvata lugens，n1)、伪褐飞虱(nilaparvata muiri，nm)和拟褐飞虱(nilaparvata bakeri，nb)形态、体色和外部特征均非常相似，肉眼难以区分，需专业人员借助显微镜根据颜面和生殖器特征才能鉴别。人工进行褐飞虱属近似种鉴定耗时费力，对人员专业技能要求高，且不能鉴别残缺的飞虱个体。
3.基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)技术的核酸检测为物种的鉴定提供了新的手段，弥补了传统形态学鉴定的诸多不足。文献报道(崔亚丽.褐飞虱及其两近似种的生物学及分子标记的研究[d].北京：中国农业科学院，2012，pp：26-39.)，利用核糖体间隔区基因(internal transcribed spacer，its)设计引物，初步建立了褐飞虱、拟褐飞虱和伪褐飞虱的多重pcr检测技术(需pcr仪+电泳仪+凝胶成像仪)，由于是以纯基因组dna为模板，具有耗时长、耗费大等缺点。liu等(liu s h，luo j，liu r，et al.identification of nilaparvata lugens and its two sibling species(n.bakeri and n.muiri)by direct multiplex pcr[j].journal of economic entomology，2018，111(6)：2869-2875.)在此基础上，重新设计引物对，以加水研磨的粗组织液为模板建立了三种飞虱的直接多重pcr检测方法(需pcr仪+电泳仪+凝胶成像仪)，该方法不需要提取dna，将检测时间大大缩短。这两种方法虽然都能准确的鉴定褐飞虱，但都依赖于昂贵的仪器设备，不易推广应用。罗举等(罗举，唐健，王爱英，等.基于重组酶介导扩增-侧流层析试纸条的褐飞虱快速鉴定方法.中国水稻科学，2022，36：96-104.)建立了基于重组聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)和侧流层析试纸条(lateral flow dipstick，lfd)的褐飞虱快速鉴定技术，可在不借助任何仪器的情况下12分钟内完成检测。rpa-lfd方法可以实现褐飞虱的快速精准鉴定，且摆脱了对精密仪器的依赖，但因需要结合试纸条才能实现肉眼检测，成本较高。而且，该方法只能区分褐飞虱与非褐飞虱，并不能准确鉴定是伪褐飞虱或拟褐飞虱。
[0004]
因此，有必要进一步开发可以准确鉴定褐飞虱、伪褐飞虱和拟褐飞虱的经济快速的快速检测技术。


技术实现要素：

[0005]
本发明针对诱虫灯下褐飞虱与其近似种难以快速区分鉴定的难题，提供一种操作简单、快速、可视化鉴定褐飞虱及其近似种所需的现场即时检测方法及试剂盒。
[0006]
为了达成上述目的，本发明的解决方案是：
[0007]
一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的靶标，所述靶标为三条序列组成的靶标组合，核苷酸序列具体如下：
[0008]
(1)nl：序列如seq id no.1所示；
[0009]
(2)nm：序列如seq id no.2所示；
[0010]
(3)nb：序列如seq id no.3所示。
[0011]
本发明还提供了所述的靶标在鉴别褐飞虱属飞虱物种中的应用。
[0012]
优选的，所述褐飞虱属飞虱物种为褐飞虱(nilaparvata lugens)、伪褐飞虱(nilaparvata muiri)和拟褐飞虱(nilaparvata bakeri)。
[0013]
本发明还提供了一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的引物组合，包括以下3组，其外引物和内引物的核苷酸序列具体如下：
[0014]
(1)nl：外引物序列如seq id no.4～5所示，内引物序列如seq id no.6～7所示；
[0015]
(2)nm：外引物序列如seq id no.8～9所示，内引物序列如seq id no.10～11所示；
[0016]
(3)nb：外引物序列如seq id no.12～13所示，内引物序列如seq id no.14～15所示。
[0017]
本发明还提供了一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的试剂盒，包括所述的引物组合。
[0018]
本发明还提供了一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的方法，包括以下步骤：
[0019]
(1)制备待测样本粗组织液；
[0020]
取单头待测飞虱，放入离心管中，加入蒸馏水，用研磨棒或枪头轻轻研磨；研磨液无需离心即为粗组织液；
[0021]
(2)制备用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的引物反应单元；其中，褐飞虱引物反应单元检测使用的外引物的核苷酸序列如seq id no.4～5所示，内引物的核苷酸序列如seq id no.6～7所示；伪褐飞虱引物反应单元检测使用的外引物的核苷酸序列如seq id no.8～9所示，内引物的核苷酸序列如seq id no.10～11所示；拟褐飞虱引物反应单元检测使用的外引物的核苷酸序列如seq id no.12～13所示，内引物的核苷酸序列如seq id no.14～15所示；
[0022]
(3)使用hnb变色法进行检测，若褐飞虱引物反应单元呈现天蓝色，说明待测样品为褐飞虱；若伪褐飞虱引物反应单元呈现天蓝色，说明待测样品为伪褐飞虱；若拟褐飞虱引物反应单元呈现天蓝色，说明待测样品为拟褐飞虱；若各反应单元均呈现紫色，说明待测样本不是褐飞虱、伪褐飞虱或拟褐飞虱中的一种。
[0023]
具体的，hnb变色法反应体系为：100mm硫酸镁1μl，无镁离子的10
×
buffer 2.5μl，10mm的dntp 3.5μl，5m的betaine 3μl，10μm内引物4μl，5μm外引物1μl，1.25mm羟基萘酚蓝1μl，8u/μl的bst 2.0 1μl，待测样本粗组织液1μl，ddh2o补充至25μl。
[0024]
所述hnb变色法反应体系中的内引物和外引物均为混合物，其中所述内引物为两条内引物的混合物，体积比例为1∶1，所述外引物为两条外引物的混合物，体积比例为1∶1。
[0025]
hnb变色法反应条件为：65℃恒温扩增30～50分钟。
[0026]
用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的方法中，还包括阴性对照和阳性标准品的测定；当
阴性对照为紫色、阳性标准品为天蓝色条件下，结果判读有效。
[0027]
本发明的有益效果：
[0028]
本发明是在生物信息学分析的基础上，筛选三种飞虱的物种特异性基因并设计引物开发的试剂盒，具有高度的物种特异性。本方法采用环介导恒温扩增技术进行靶标基因的恒温扩增，采用羟基萘酚蓝(hnb)变色法，实现扩增产物的可视化检测，降低了对仪器设备的要求，降低了操作难度，摆脱了对专业分类技能的依赖。综上所述，本发明的飞虱快速检测和鉴定方法具有准确、操作简便、快速，对操作人员要求不高等优点，较传统的形态学鉴定方法具有更高的可重复性，易操作性和时效性。
附图说明
[0029]
图1为实施例1中物种特异性引物筛选结果图，其中样本模板包括超纯水、褐飞虱、伪褐飞虱、拟褐飞虱、白背飞虱、灰飞虱、稗飞虱、烟翅白背飞虱。
[0030]
图2为实施例2中样本的hnb变色检测结果图，其中：nl代表褐飞虱检测反应管；nm代表伪褐飞虱检测反应管；nb代表拟褐飞虱检测反应管；1～8分别代表：空白对照、阳性对照、褐飞虱虫体1、褐飞虱虫体2、伪褐飞虱虫体1、伪褐飞虱虫体2、拟褐飞虱虫体1、拟褐飞虱虫体2。
具体实施方式
[0031]
实施例1
[0032]
(1)测序试虫准备
[0033]
伪褐飞虱活虫由浙江师范大学提供，拟褐飞虱活虫采自广西昭平县田边杂草。两种飞虱在中国水稻研究所养虫室内继续饲养10～15代，每一代都会进行单雌单雄配对以纯化基因背景，建立近等基因系种群。
[0034]
(2)测序样本准备
[0035]
采集室内伪褐飞虱或拟褐飞虱近等基因系种群雌雄成虫各若干头，在显微镜下去除中肠，剩余虫体用trizol法提取rna，验证合格后送公司测序。
[0036]
(3)转录组测序及组装
[0037]
委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行转录组测序，测序文库构建和测序反应采用标准程序，测序平台为illuminanovaseq 6000，测序策略为pe150。对测序获得的原始数据(raw reads)进行过滤，去除带接头、含n(n表示无法确定碱基信息)和低质量的reads，得到高质量的clean reads。使用trinity(v2.1.4)将clean reads进行从头组装，获得伪褐飞虱和拟褐飞虱的转录组序列。
[0038]
(4)物种特异性基因筛选
[0039]
建立本地飞虱cds数据库，包含褐飞虱、伪褐飞虱、拟褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱共5种。用本地blast程序筛选褐飞虱、伪褐飞虱和拟褐飞虱物种特异性核苷酸序列(比对参数：-qcov_hsp_perc 90-evalue 1e-5)，筛选得到的靶标序列如seq id no.1～3所示。
[0040]
(5)lamp引物设计与筛选
[0041]
利用在线软件primerexploerv5及默认参数设计lamp引物(https://primerexplorer.jp/e/)，各5组。分别以褐飞虱、伪褐飞虱、拟褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱的
纯基因组dna为模板(10ng/μl)，采用lamp-sybr体系(如表1所示)各筛选出1组特异性引物(图1)。所筛选的nl引物组合序列如seq id no.4～7，nm引物组合序列如seq id no.8～11，nb引物组合序列如seq id no.12～15。
[0042]
表1 lamp-sybr体系
[0043]
haigene(a3801-01)lamp-sybr(10μl体系)ddh2o3.3mgso4(100mm)0.410
×
buffer(mg
2+
6mm)1dntp(10mm)1.4fip/bip mix(10μm)1.6f3/b3 mix(5μm)0.410
×
sybr green(10
×
)1bst 2.0(8u/μl)0.4dna/粗组织液1
[0044]
实施例2
[0045]
(1)测试样本获取
[0046]
广西昭平、湖南邵东和浙江富阳的测报灯灯下褐飞虱、拟褐飞虱、伪褐飞虱的飞虱样本。
[0047]
(2)测试模板准备
[0048]
取单头待测飞虱，放入1.5ml或2ml离心管中；加入50～300μl蒸馏水(或矿泉水)，用研磨棒或枪头轻轻研磨；研磨液无需离心即为飞虱粗组织液，可作为后续dna模板。
[0049]
(3)hnb变色检测法反应体系：
[0050]
haigene(a3801-01)lamp-hnb(25μl)ddh2o7mgso4(100mm)110
×
buffer(不含mg
2+
)2.5dntp(10mm)3.5betaine(5m)3fip/bip mix(10μm)4f3/b3 mix(5μm)1hnb(1.25mm)1bst 2.0(8u/μl)1粗组织液1
[0051]
(4)hnb变色检测法反应条件：
[0052]
水浴或金属浴，65℃恒温扩增35分钟。
[0053]
(5)hnb变色检测法结果判定：
[0054]
阴性对照的模板是无菌水，阳性对照就是nl、nm或nb的基因组dna(即对于nl检测管，阳性对照为nl的基因组dna；对于nm检测管，阳性对照为nm的基因组dna；对于nb检测管，阳性对照为nb的基因组dna)。
[0055]
在阴性和阳性对照结果无误的情况(即阴性对照为紫色、阳性标准品为天蓝色)，若褐飞虱引物反应单元由紫色变为了天蓝色，说明待测样品为褐飞虱；若伪褐飞虱引物反应单元由紫色变为了天蓝色，说明待测样品为伪褐飞虱；若拟褐飞虱引物反应单元由紫色变为了天蓝色，说明待测样品为拟褐飞虱；若三种反应单元都未观察到紫色向天蓝色的转变，说明待测样本不是褐飞虱属三种飞虱中的任何一种。
[0056]
图2中，nl代表褐飞虱检测反应管；nm代表伪褐飞虱检测反应管；nb代表拟褐飞虱检测反应管；1～8分别代表：空白对照、阳性对照、褐飞虱虫体1、褐飞虱虫体2、伪褐飞虱虫体1、伪褐飞虱虫体2、拟褐飞虱虫体1、拟褐飞虱虫体2。
[0057]
从图2中可知，在nl代表褐飞虱检测反应管中，作为阳性对照的管2、检测褐飞虱虫体1的管3、检测褐飞虱虫体2的管4中均由紫色变为了天蓝色，其他反应管中均未变色，呈现紫色；另一方面，在伪褐飞虱检测反应管和拟褐飞虱检测反应管中，对应的反应管3和反应管4中也均未变色，呈现紫色。
[0058]
在nm代表伪褐飞虱检测反应管中，作为阳性对照的管2、检测伪褐飞虱虫体1的管5、检测伪褐飞虱虫体2的管6中均由紫色变为了天蓝色，其他反应管中均未变色，呈现紫色；另一方面，在褐飞虱检测反应管和拟褐飞虱检测反应管中，对应的反应管5和反应管6中也均未变色，呈现紫色。
[0059]
在nb代表拟褐飞虱检测反应管中，作为阳性对照的管2、检测拟褐飞虱虫体1的管7、检测拟褐飞虱虫体2的管8均由紫色变为了天蓝色，其他反应管中均未变色，呈现紫色；另一方面，在褐飞虱检测反应管和伪褐飞虱检测反应管中，对应的反应管7和反应管8中也均未变色，呈现紫色。
[0060]
以上可知，本发明可以准确的检测和鉴别出褐飞虱属飞虱物种，本发明设计的引物具有高度的物种特异性，较传统的形态学鉴定方法具有更高的可重复性，易操作性和时效性。

技术特征：
1.一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的靶标，其特征在于，所述靶标为三条序列组成的靶标组合，核苷酸序列具体如下：(1)nl：序列如seq id no.1所示；(2)nm：序列如seq id no.2所示；(3)nb：序列如seq id no.3所示。2.权利要求1所述的靶标在鉴别褐飞虱属飞虱物种中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述褐飞虱属飞虱物种为褐飞虱(nilaparvata lugens)、伪褐飞虱(nilaparvata muiri)和拟褐飞虱(nilaparvata bakeri)。4.一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的引物组合，其特征在于，包括以下3组，其外引物和内引物的核苷酸序列具体如下：(1)nl：外引物序列如seq id no.4～5所示，内引物序列如seq id no.6～7所示；(2)nm：外引物序列如seq id no.8～9所示，内引物序列如seq id no.10～11所示；(3)nb：外引物序列如seq id no.12～13所示，内引物序列如seq id no.14～15所示。5.一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的试剂盒，其特征在于，包括权利要求4所述的引物组合。6.一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备待测样本粗组织液；(2)制备用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的引物反应单元；其中，褐飞虱引物反应单元检测使用的外引物的核苷酸序列如seq id no.4～5所示，内引物的核苷酸序列如seq id no.6～7所示；伪褐飞虱引物反应单元检测使用的外引物的核苷酸序列如seq id no.8～9所示，内引物的核苷酸序列如seq id no.10～11所示；拟褐飞虱引物反应单元检测使用的外引物的核苷酸序列如seq id no.12～13所示，内引物的核苷酸序列如seq id no.14～15所示(3)使用hnb变色法进行检测，若褐飞虱引物反应单元呈现天蓝色，说明待测样品为褐飞虱；若伪褐飞虱引物反应单元呈现天蓝色，说明待测样品为伪褐飞虱；若拟褐飞虱引物反应单元呈现天蓝色，说明待测样品为拟褐飞虱；若各反应单元均呈现紫色，说明待测样本不是褐飞虱、伪褐飞虱或拟褐飞虱中的一种。7.如权利要求6所述的用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的方法，其特征在于，hnb变色法反应体系为：100mm硫酸镁1μl，无镁离子的10
×
buffer2.5μl，10mm的dntp 3.5μl，5m的betaine 3μl，10μm内引物4μl，5μm外引物1μl，1.25mm羟基萘酚蓝1μl，8u/μl的bst 2.0 1μl，待测样本粗组织液1μl，ddh2o补充至25μl。8.如权利要求7所述的用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的方法，其特征在于，hnb变色法反应条件为：65℃恒温扩增30～50分钟。9.如权利要求7所述的用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的方法，其特征在于，步骤(3)中，还包括阴性对照和阳性标准品的测定；当阴性对照为紫色、阳性标准品为天蓝色条件下，结果判读有效。

技术总结
本发明公开了一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的方法，涉及生物技术领域。本发明是在生物信息学分析的基础上，筛选三种飞虱的物种特异性基因并设计引物开发的试剂盒，具有高度的物种特异性。本方法采用环介导恒温扩增技术进行靶标基因的恒温扩增，采用羟基萘酚蓝(HNB)变色法，实现扩增产物的可视化检测，降低了对仪器设备的要求，降低了操作难度，摆脱了对专业分类技能的依赖。综上所述，本发明的飞虱快速检测和鉴定方法具有准确、操作简便、快速，对操作人员要求不高等优点，较传统的形态学鉴定方法具有更高的可重复性，易操作性和时效性。易操作性和时效性。易操作性和时效性。


技术研发人员：刘淑华 罗举 汪慈林
受保护的技术使用者：中国水稻研究所
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/8/4