一种新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球及其制备方法

1.本发明涉及生物分离工程技术领域，尤其涉及一种新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球及其制备方法。


背景技术：

2.琼脂糖是一种从石花菜属、江蓠属、紫菜属等红藻中分离出的天然海洋线性多糖，具有高亲水性、电中性、含有丰富的羟基、溶胶凝胶热可逆性等特点。以琼脂糖为原料制备的凝胶微球介质，是多糖类层析介质中最理想的一种。是生物工程分离纯化领域中重要的载体工具，可以制备成凝胶过滤层析介质、离子交换层析介质、疏水层析介质等，被广泛应用于蛋白质、细胞、核酸、抗体、酶等生物分子的分离纯化。
3.葡聚糖是在蔗糖中培养的细菌，经过催化反应生成的葡萄糖聚合物，分子式为(c6h
10
o5)n。根据糖苷键的类型可分为α-葡聚糖和β-葡聚糖，其中以α-葡聚糖使用较多，称为右旋糖酐，英文名为dextran。葡聚糖具有良好的生物降解性和胶凝特性、生物相容性、亲水性以及ph和温度稳定性，因此是优良的多糖类微球制备原料。将具有分支的葡聚糖链多位点接枝在琼脂糖介质的表面及孔道内部，可以利用葡聚糖提供三维吸附空间，提供更高吸附容量、加快传质速率的特性优点。
4.生命科学技术的迅猛发展对生物分离纯化技术及介质提出了更高的要求，未来这一领域主要向着研发高效、高通量、快速的层析介质材料的方向发展。为解决多糖基层析介质对大生物分子分离效率低下、原料损失严重、结构破坏易失活、耐压性能差等的问题，迫切需要开发一种高分辨率、高流速、高耐压性的分离纯化介质。


技术实现要素：

5.本发明旨在改善传统琼脂糖微球作为软凝胶基质，机械强度差，内部网络结构单一的特征，进而研制出一种以交联后的琼脂糖凝胶微球为内核，预交联多糖凝胶微球为壳层的新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球，这种核壳型微球兼具内核的细孔结构和壳层的大孔结构，经过交联处理制备的高分辨率层析介质，其丰富的孔道结构有利于生物分子在介质内部的高效传质，且机械强度也获得大程度地提高。
6.为实现上述目的，本发明提供一种新型多核结构琼脂糖凝胶微球，微球的核心是粒径不大于60μm的琼脂糖小微球，琼脂糖小微球均匀分散在微球内部；微球的壳层是中性多糖复合材料。
7.进一步，其的制备方法包括如下步骤，
8.s1.制备内核琼脂糖微球，包括：
9.s1.1.第一油相的制备：将表面活性剂和与水互不相溶的第一油性物质混合；
10.s1.2.第一水相的制备：制备含有4-6％w/v琼脂糖的多糖溶液，加热至澄清透明，完全溶解；
11.s1.3.将上述制备好的第一水相倾倒入制备好的正在搅拌的第一油相中乳化，再
降温固化，使琼脂糖液滴凝固成微球状态；
12.s1.4.离心使其破乳分层，弃去上清液后反复清洗直至洗净，即可获得内核琼脂糖微球；优选的，所述离心为3500rpm 5min；
13.s2.内核琼脂糖微球交联活化，具体步骤包括：
14.s2.1.将上述获得的内核琼脂糖微球与水、浓碱、1,4-二氧六环和第一交联剂混合均匀；
15.s2.2.将上述得到的混合体系在150-400rpm，20-35℃，反应2-6h；
16.s2.3.将上述所得使用超纯水或乙醇反复清洗多次，洗去naoh溶液以及有机溶剂，即可获得后交联处理的内核琼脂糖微球；
17.s3.新型多核结构琼脂糖凝胶微球的获得：
18.s3.1第二油相的制备：将表面活性剂和与水互不相溶的第二油性物质混合；
19.s3.2第二水相的制备：制备含有4-6％w/v含琼脂糖的多糖溶液，加热至澄清透明使其完全溶解，再加入的后交联处理的内核琼脂糖微球，混合均匀；如果有气泡就加热消泡；
20.s3.3将制备的第二水相倾倒入制备的正在搅拌的第二油相中，继续搅拌乳化，再固化；以使w/o乳液滴冷却凝固成琼脂糖凝胶微球；
21.s3.4再加入浓碱与第二交联剂反应；
22.s3.5离心使其分层，弃去上清液后反复清洗直至洗净，即可获得新型多核结构琼脂糖凝胶微球；优选的，所述离心为3500rpm 5min。
23.进一步，s1.1步骤中，所述表面活性剂为0.75-2％w/v span 80，第一油性物质为液体石蜡。
24.进一步，s1.2步骤中，多糖溶液还含有葡聚糖。
25.进一步，s1.3步骤中，所述乳化为800-1400rpm下乳化10-30min；所述固化为500-600rpm下降温至15-25℃；所述液体石蜡与琼脂糖的多糖溶液的体积比为200:60。
26.进一步，s2.1步骤，所述第一交联剂为卤代环氧化合物和双缩水甘油醚类试剂中的至少一种；优选的，卤代环氧化合物为环氧氯丙烷，双缩水甘油醚类试剂选自乙二醇二缩水甘油醚，丁二醇二缩水甘油醚和己二醇二缩水甘油醚中的任意一种；
27.任选的，所述内核琼脂糖微球：浓碱：交联剂的用量比为36g：14ml：14ml。
28.进一步，s3.1步骤中，所述表面活性剂为0.75-2％w/v span 80，第二油性物质为液体石蜡。
29.进一步，s3.2步骤中，所述多糖溶液还含有葡聚糖；所述后交联处理的内核琼脂糖微球与多糖溶液的质量比为1:2-5。
30.进一步，s3.3步骤中，所述继续搅拌乳化的转速为800-1400rpm，乳化10-30min；
31.任选的，所述固化为500-600rpm下降温至15-25℃；
32.任选的，所述液体石蜡：含琼脂糖的多糖溶液：后交联处理的内核琼脂糖微球的用量比为180ml：36g：18g。
33.进一步，s3.4步骤中，所述第二交联剂为卤代环氧化合物和双缩水甘油醚类试剂中的至少一种；
34.优选的，卤代环氧化合物为环氧氯丙烷，双缩水甘油醚类试剂选自乙二醇二缩水
甘油醚，丁二醇二缩水甘油醚和己二醇二缩水甘油醚中的任意一种；
35.任选的，浓碱：交联剂的体积用量比为1：2。
36.任选的，所述反应为300rpm的转速搅拌；优选的，反应时间为30min。
附图说明
37.图1是本发明实施例1中复合多糖微球(琼脂糖：葡聚糖＝5:1、4:2、3:3、2:4)的光学显微镜图与粒径分布图。
38.图2为对比例1-3制备所得放大100倍数的光学显微镜图片。
39.图3是本发明实施例2-4中新型多核结构琼脂糖凝胶微球与其内核琼脂糖凝胶微球的粒径及粒径分布图。
40.图4为本发明实施例2-5制备的新型多核结构琼脂糖凝胶微球放大100倍数的光学显微镜图片。
41.图5是本发明实施例5中以6％琼脂糖微球为内核的一系列新型多核结构琼脂糖凝胶微球的平均粒径及粒径分布图。
42.图6为本发明实施例6-10制备的新型多核结构琼脂糖凝胶微球放大100倍数的光学显微镜图片。
43.图7是本发明实施例11中不同内核微球大小的新型多核结构琼脂糖凝胶微球的光学显微镜图与粒径分布图。
44.图8是本发明实施例12中不同乳化转速下的新型多核结构琼脂糖凝胶微球的光学显微镜图与粒径分布图。
45.图9是本发明实施例13中不同交联时间的新型多核结构琼脂糖凝胶微球的光学显微镜图与粒径分布图。
46.图10是本发明实施例2-4中新型多核结构琼脂糖凝胶微球与其他类型微球的红外分析图。
47.图11是本发明实施例2-4中新型多核结构琼脂糖凝胶微球与其内核琼脂糖凝胶微球与对比例1的环氧基修饰密度图。
48.图12是本发明实施例3中新型多核结构琼脂糖凝胶微球与对比例3-5的流速-压力测试图。反映琼脂糖微球的耐压性能以及机械强度。
49.图13是本发明实施例5中以6％琼脂糖微球为内核的一系列新型多核结构琼脂糖凝胶微球的流速-压力测试图。
50.图14是本发明实施例5中以6％琼脂糖微球为内核的一系列新型多核结构琼脂糖凝胶微球的凝胶过滤色谱性能测试图。
具体实施方式
51.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的
实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。
52.实施例1：多核结构复合琼脂糖凝胶微球壳层材料的优选实验
53.s1.油相的制备：将180ml液体石蜡加热至65℃，在机械搅拌1000rpm的状态下，加入1.5％w/v span 80表面活性剂，保持恒温，混合均匀，备用；
54.s2.水相的制备：制备含有一定琼脂糖与葡聚糖重量比例(5:1、4:2、3:3、2:4)的复合多糖溶液54g，加热至澄清透明，完全溶解；
55.s3.将制备的水相倾倒入制备的正在搅拌的油相(800-1400rpm)中，搅拌乳化10min后，以600rpm的转速在冰水浴中固化10min；以使w/o乳液滴冷却凝固成琼脂糖凝胶微球；
56.s4.加入1％v/vnaoh、2％v/v乙二醇二缩水甘油醚、再以300rpm的转速搅拌反应0.5h；
57.s5.再将上述混合体系离心分层，弃去上清液，反复清洗，直至洗净。即可获得新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球。
58.图1是本实施例中复合多糖微球(琼脂糖：葡聚糖＝5:1、4:2、3:3、2:4)的光学显微镜图与粒径分布图。可以看出，随着复合多糖组成成分中葡聚糖占比的提高，微球的平均粒径随之减小。其中优选琼脂糖与葡聚糖比例为4:2时，粒径分布均一。
59.实施例2：新型多核结构琼脂糖凝胶微球的制备
60.s1.制备内核琼脂糖微球，包括：
61.s1.1.油相的制备：将200ml液体石蜡加热至80℃，在机械搅拌900rpm的状态下，加入0.75％w/v span 80表面活性剂，保持恒温，混合均匀，备用；
62.s1.2.水相的制备：制备含有4％w/v琼脂糖的多糖溶液60ml，加热(加热至琼脂糖溶液呈沸腾状态，约90-100℃)至澄清透明，完全溶解。
63.s1.3.将上述制备好的水相倾倒入制备好的正在搅拌的油相(800-1400rpm)中，搅拌乳化10min后，以600rpm的转速降温至20℃进行固化，将琼脂糖液滴凝固成微球状态；
64.s1.4.再以3500rpm离心5min，使其破乳分层(达到离心破乳沉降分层的目的)，弃去上清液(油和表面活性剂)，反复清洗，直至洗净，即可获得内核琼脂糖微球。
65.s2.内核琼脂糖微球交联活化，具体步骤包括：
66.s2.1.将18g上述获得的内核琼脂糖微球与10ml水、7ml质量浓度为20％的naoh溶液、7ml 1,4-二氧六环、7ml环氧氯丙烷混合均匀；
67.s2.2.将上述得到的混合体系在200rpm、30℃的条件下，反应2h；
68.s2.3.将上述所得使用超纯水或乙醇反复清洗多次，洗去naoh溶液以及有机溶剂，即可获得后交联处理的内核琼脂糖微球；
69.s3.新型多核结构琼脂糖凝胶微球的制备，步骤包括：
70.s3.1.油相的制备：将180ml液体石蜡加热至65℃，在机械搅拌1000rpm的状态下，加入1.5％w/v span 80表面活性剂，保持恒温，混合均匀，备用；
71.s3.2.水相的制备：制备含有4％w/v琼脂糖的多糖溶液36g，加热至澄清透明，完全溶解。趁热，加入s2后交联处理所得的18g内核琼脂糖微球，混合均匀；如果有气泡就80-90℃加热消泡5min；
72.s3.3.将制备的水相倾倒入制备的正在搅拌的油相(800-1400rpm)中，搅拌乳化
10min后，以600rpm的转速在冰水浴中固化10min；以使w/o乳液滴冷却凝固成琼脂糖凝胶微球；
73.s3.4.加入1％v/vnaoh和2％v/v乙二醇二缩水甘油醚、再以300rpm的转速搅拌反应0.5h；
74.s3.5.将上述混合体系，离心(3500rpm 5min)分层，弃去上清液，反复清洗，直至洗净。即可获得新型多核结构琼脂糖凝胶微球。
75.实施例3：新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备
76.s1.制备内核琼脂糖微球：同实施例2。
77.s2.内核琼脂糖微球交联活化：同实施例2。
78.s3.新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备，步骤包括：
79.s3.1.油相的制备：将180ml液体石蜡加热至65℃，在机械搅拌1000rpm的状态下，加入1.5％w/v span 80表面活性剂，保持恒温，混合均匀，备用；
80.s3.2.水相的制备：制备含有2％葡聚糖和4％琼脂糖的复合多糖溶液36g，加热至澄清透明，完全溶解。趁热，加入18g内核琼脂糖微球后混合均匀；如果有气泡就80-90℃加热消泡5min；
81.s3.3.将制备的水相倾倒入制备的正在搅拌的油相(800-1400rpm)中，搅拌乳化10min后，以600rpm的转速在冰水浴中固化10min；以使w/o乳液滴冷却凝固成琼脂糖凝胶微球；
82.s3.4.加入1％v/vnaoh和2％v/v乙二醇二缩水甘油醚、再以300rpm的转速搅拌反应0.5h；
83.s3.5.再将上述混合体系离心分层，弃去上清液，反复清洗，直至洗净。即可获得新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球。
84.本实施例所得新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的平均粒径与粒径分布采用winner2000激光粒度分析仪进行测量，在水中微球的平均粒径为125μm，粒径分布系数r
span
为1.38。
85.实施例4：新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备
86.s1.制备内核琼脂糖微球：同实施例2。
87.s2.内核琼脂糖微球交联活化：同实施例2。
88.s3.新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备，步骤包括：
89.s3.1.油相的制备：将180ml液体石蜡加热至65℃，在机械搅拌1000rpm的状态下，加入1.5％w/v span 80表面活性剂，保持恒温，混合均匀，备用；
90.s3.2.水相的制备：制备含有2％葡聚糖和4％琼脂糖的复合多糖溶液36g，加热至澄清透明，完全溶解。趁热，加入18g s2所得后交联处理的内核琼脂糖微球后混合均匀；如果有气泡就80-90℃加热消泡5min；
91.s3.3.将制备的水相倾倒入制备的正在搅拌的油相(800-1400rpm)中，搅拌乳化10min后，以600rpm的转速在冰水浴中固化10min；以使w/o乳液滴冷却凝固成琼脂糖凝胶微球；
92.s3.4.加入1％v/v naoh、2％v/v 1,4-二氧六环和2％v/v环氧氯丙烷、再以300rpm的转速搅拌反应0.5h；
93.s3.5.再将上述混合体系离心分层，弃去上清液，反复清洗，直至洗净。即可获得新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球。
94.本实施例所得新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的平均粒径与粒径分布采用winner2000激光粒度分析仪进行测量，在水中微球的平均粒径为133μm，粒径分布系数r
span
为1.51。
95.实施例5：新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备
96.s1.制备内核琼脂糖微球，包括：
97.s1.1.油相的制备：将200ml液体石蜡加热至80℃，在机械搅拌3000rpm的状态下，加入0.75％w/v span 80表面活性剂，保持恒温，混合均匀，备用；
98.s1.2.水相的制备：制备含有6％w/v琼脂糖的多糖溶液60ml，加热至澄清透明，完全溶解。
99.s1.3.将上述制备好的水相倾倒入制备好的正在搅拌的油相(2000-4000rpm)中，搅拌乳化20min后，以2800rpm的转速降温至20℃进行固化，将琼脂糖液滴凝固成微球状态；
100.s1.4.再离心分层(达到离心破乳沉降分层的目的)，弃去上清液(油和表面活性剂)，反复清洗，直至洗净，即可获得内核琼脂糖微球。
101.s2.内核琼脂糖微球交联活化：同实施例1。
102.s3.新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备，步骤包括：
103.s3.1.油相的制备：将180ml液体石蜡加热至65℃，在机械搅拌1000rpm的状态下，加入1.5％w/v span 80表面活性剂，保持恒温，混合均匀，备用；
104.s3.2.水相的制备：制备三种复合多糖溶液36g：含有5％琼脂糖和2.5％葡聚糖；或者4％琼脂糖和2％葡聚糖；或者3％琼脂糖和1.5％葡聚糖，加热至澄清透明，完全溶解。趁热，加入18gs2所得内核琼脂糖微球后混合均匀；如果有气泡就80-90℃加热消泡5min；
105.s3.3.将制备的水相倾倒入制备的正在搅拌的油相(800-1400rpm)中，搅拌乳化10min后，以600rpm的转速在冰水浴中固化10min；以使w/o乳液滴冷却凝固成琼脂糖凝胶微球；
106.s3.4.加入1％v/v naoh、2％v/v 1,4-二氧六环和2％v/v环氧氯丙烷、再以300rpm的转速搅拌反应0.5h；
107.s3.5.再将上述混合体系离心分层，弃去上清液，反复清洗，直至洗净。即可获得以6％琼脂糖微球为内核，三种复合多糖(5％琼脂糖和2.5％葡聚糖；4％琼脂糖和2％葡聚糖；3％琼脂糖和1.5％葡聚糖)为壳层的三种新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球。
108.本实施例所得新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的平均粒径与粒径分布采用winner2000激光粒度分析仪进行测量，在水中微球的平均粒径为140μm，粒径分布系数r
span
为1.63。
109.表1是本发明实施例5中以6％琼脂糖微球为内核的一系列新型多核结构琼脂糖凝胶微球的分配系数kd值表格。从表1可以看出，随着壳层浓度的提高，牛血清白蛋白的kd值逐级降低。对于同一蛋白样品，更小的kd值，是由于被微球中较小的孔隙阻挡，因此更快地流出层析柱。
110.表1
[0111][0112]
实施例6：新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备
[0113]
s1.制备内核琼脂糖微球：同实施例2。
[0114]
s2.内核琼脂糖微球交联活化：同实施例2。
[0115]
s3.新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备：同实施例3，不同点：预交联用1％v/vnaoh、2％v/v丁二醇二缩水甘油醚。
[0116]
本实施例所得新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的平均粒径与粒径分布采用winner2000激光粒度分析仪进行测量，在水中微球的平均粒径为143μm，粒径分布系数r
span
为1.52。
[0117]
实施例7：新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备
[0118]
s1.制备内核琼脂糖微球：同实施例2。
[0119]
s2.内核琼脂糖微球交联活化：同实施例2。
[0120]
s3.新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备：同实施例2，不同点：预交联用1％v/vnaoh、2％v/v己二醇二缩水甘油醚。
[0121]
本实施例所得新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的平均粒径与粒径分布采用winner2000激光粒度分析仪进行测量，在水中微球的平均粒径为149μm，粒径分布系数r
span
为1.58。
[0122]
实施例8：新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备
[0123]
s1.制备内核琼脂糖微球：同实施例2。
[0124]
s2.内核琼脂糖微球交联活化：同实施例2。
[0125]
s3.新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备：
[0126]
s3.1.油相的制备：将160ml液体石蜡与20ml大豆油加热至65℃，在机械搅拌1000rpm的状态下，加入1.5％w/v span 80表面活性剂，保持恒温，混合均匀，备用
[0127]
s3.2.水相的制备：制备含有2％葡聚糖和4％琼脂糖的复合多糖溶液36g，加热至澄清透明，完全溶解。趁热，加入内核琼脂糖微球后混合均匀；如果有气泡就80-90℃加热消泡5min；
[0128]
s3.3.将制备的水相倾倒入制备的正在搅拌的油相(800-1400rpm)中，搅拌乳化10min后，以600rpm的转速在冰水浴中固化10min；以使w/o乳液滴冷却凝固成琼脂糖凝胶微球；
[0129]
s3.4.加入1％v/v naoh、2％v/v乙二醇二缩水甘油醚，再以300rpm的转速搅拌反应0.5h；
[0130]
s3.5.再将上述混合体系，离心分层，弃去上清液，反复清洗，直至洗净。即可获得新型多核结构琼脂糖凝胶微球。
[0131]
本实施例所得新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的平均粒径与粒径分布采用
winner2000激光粒度分析仪进行测量，在水中微球的平均粒径为127μm，粒径分布系数r
span
为1.55。
[0132]
实施例9：新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备
[0133]
s1.制备内核琼脂糖微球：同实施例2。
[0134]
s2.内核琼脂糖微球交联活化：同实施例2。
[0135]
s3.新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备：
[0136]
s3.1.油相的制备：将180ml液体石蜡加热至65℃，在机械搅拌1000rpm的状态下，加入1.5％w/v span 80表面活性剂，保持恒温，混合均匀，备用；
[0137]
s3.2.水相的制备：制备含有2％葡聚糖和4％琼脂糖的复合多糖溶液45g，加热至澄清透明，完全溶解。趁热，加入9g内核琼脂糖微球后混合均匀；如果有气泡就80-90℃加热消泡5min；
[0138]
s3.3.将制备的水相倾倒入制备的正在搅拌的油相(800-1400rpm)中，搅拌乳化10min后，以600rpm的转速在冰水浴中固化10min；以使w/o乳液滴冷却凝固成琼脂糖凝胶微球；
[0139]
s3.4.加入1％v/v naoh、2％v/v乙二醇二缩水甘油醚，再以300rpm的转速搅拌反应0.5h；
[0140]
s3.5.再将上述混合体系，离心分层，弃去上清液，反复清洗，直至洗净。即可获得新型多核结构琼脂糖凝胶微球。
[0141]
本实施例所得新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的平均粒径与粒径分布采用winner2000激光粒度分析仪进行测量，在水中微球的平均粒径为120μm，粒径分布系数r
span
为1.74。
[0142]
实施例10：新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备
[0143]
s1.制备内核琼脂糖微球：同实施例2，不同点在于多糖溶液为含5％w/v琼脂糖的多糖溶液。
[0144]
s2.内核琼脂糖微球交联活化：同实施例2。
[0145]
s3.新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备：同实施例3，不同点：预交联用1％v/vnaoh、2％v/v乙二醇二缩水甘油醚。
[0146]
本实施例所得新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的平均粒径与粒径分布采用winner2000激光粒度分析仪进行测量，在水中微球的平均粒径为118μm，粒径分布系数r
span
为1.67。
[0147]
实施例11：新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备
[0148]
s1.制备内核琼脂糖微球：同实施例2。
[0149]
s2.内核琼脂糖微球交联活化：同实施例2。
[0150]
s3.新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备，步骤包括：
[0151]
s3.1.油相的制备：将180ml液体石蜡加热至65℃，在机械搅拌1000rpm的状态下，加入1.5％w/v span 80表面活性剂，保持恒温，混合均匀，备用；
[0152]
s3.2.水相的制备：制备含有2％葡聚糖和4％琼脂糖的复合多糖溶液36g，加热至澄清透明，完全溶解。趁热，加入一定粒径范围(10-45μm、45-60μm、60-75μm、75-105μm)的内核琼脂糖微球，与复合多糖溶液混合均匀，加热消泡5min。
[0153]
制备含有2％葡聚糖和4％琼脂糖的复合多糖溶液36g，加热至澄清透明，完全溶解。趁热，加入内核琼脂糖微球后混合均匀；如果有气泡就80-90℃加热消泡5min；
[0154]
s3.3.将制备的水相倾倒入制备的正在搅拌的油相(800-1400rpm)中，搅拌乳化10min后，以600rpm的转速在冰水浴中固化10min；以使w/o乳液滴冷却凝固成琼脂糖凝胶微球；
[0155]
s3.4.加入1％v/vnaoh和2％v/v乙二醇二缩水甘油醚、再以300rpm的转速搅拌反应0.5h；
[0156]
s3.5.再将上述混合体系离心分层，弃去上清液，反复清洗，直至洗净。即可获得新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球。
[0157]
实施例12：新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备
[0158]
s1.制备内核琼脂糖微球：同实施例2。
[0159]
s2.内核琼脂糖微球交联活化：同实施例2。
[0160]
s3.新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备，步骤包括：
[0161]
s3.1.油相的制备：将180ml液体石蜡加热至65℃，在一定机械搅拌转速(800rpm、1000rpm、1200rpm、1400rpm)的状态下，加入1.5％w/v span 80表面活性剂，保持恒温，混合均匀，备用；
[0162]
s3.2.水相的制备：制备含有2％葡聚糖和4％琼脂糖的复合多糖溶液36g，加热至澄清透明，完全溶解。趁热，加入内核琼脂糖微球后混合均匀；如果有气泡就80-90℃加热消泡5min；
[0163]
s3.3.将制备的水相倾倒入制备的正在搅拌的油相(800rpm、1000rpm、1200rpm、1400rpm)中，搅拌乳化10min后，以600rpm的转速在冰水浴中固化10min；以使w/o乳液滴冷却凝固成琼脂糖凝胶微球；
[0164]
s3.4.加入1％v/v naoh、2％v/v乙二醇二缩水甘油醚、再以300rpm的转速搅拌反应0.5h；
[0165]
s3.5.再将上述混合体系离心分层，弃去上清液，反复清洗，直至洗净。即可获得新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球。
[0166]
实施例13：新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备
[0167]
s1.制备内核琼脂糖微球：同实施例2。
[0168]
s2.内核琼脂糖微球交联活化：同实施例2。
[0169]
s3.新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球的制备，步骤包括：
[0170]
s3.1.油相的制备：将180ml液体石蜡加热至65℃，在一定机械搅拌转速(800-1400rpm)的状态下，加入1.5％w/v span 80表面活性剂，保持恒温，混合均匀，备用；
[0171]
s3.2.水相的制备：制备含有2％葡聚糖和4％琼脂糖的复合多糖溶液36g，加热至澄清透明，完全溶解。趁热，加入内核琼脂糖微球后混合均匀；如果有气泡就80-90℃加热消泡5min；
[0172]
s3.3.将制备的水相倾倒入制备的正在搅拌的油相(800-1400rpm)中，搅拌乳化10min后，以600rpm的转速在冰水浴中固化10min；以使w/o乳液滴冷却凝固成琼脂糖凝胶微球；
[0173]
s3.4.加入1％v/v naoh、2％v/v乙二醇二缩水甘油醚，再以300rpm的转速搅拌反
应一定时间(5min、15min、0.5h、1h、2h、4h、6h)；
[0174]
s3.5.再将上述混合体系离心分层，弃去上清液，反复清洗，直至洗净。即可获得新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球。
[0175]
对比例1：4％琼脂糖凝胶微球的制备
[0176]
同实施例2的s1步骤。不同点为机械搅拌转速为800rpm。得到4％琼脂糖凝胶微球。
[0177]
对比例2：6％琼脂糖凝胶微球的制备
[0178]
同实施例2的s1步骤。不同点为水相制备6％w/v琼脂糖溶液，机械搅拌转速为800rpm。得到6％琼脂糖凝胶微球。
[0179]
对比例3：复合多糖凝胶微球的制备
[0180]
同实施例1的s1-s5步骤。不同点为水相选取4％w/v琼脂糖和2％w/v葡聚糖制备复合多糖溶液，得到一种含4％琼脂糖和2％葡聚糖的复合多糖凝胶微球。
[0181]
对比例4：交联4％琼脂糖凝胶微球的制备
[0182]
s1：同对比例1步骤。
[0183]
s2：同实施例2的s2步骤。得到交联4％琼脂糖凝胶微球。
[0184]
对比例5：交联4％琼脂糖凝胶微球的制备
[0185]
同对比例4。不同点仅为将4％w/v琼脂糖溶液改为6％w/v琼脂糖溶液。
[0186]
s1：同对比例2步骤。
[0187]
s2：同实施例2的s2步骤。得到交联6％琼脂糖凝胶微球。
[0188]
测试例
[0189]
1)形态外观与粒径测试：
[0190]
对实施例和对比例制备的微球形貌表征采用光学显微镜观察：将湿态核壳微球滴于载玻片表面，覆上盖玻片，使用ml11
‑ⅱ
光学显微镜进行观察并拍照记录。
[0191]
其平均粒径与粒径分布采用激光粒度分析仪进行测量：通过将核壳微球均匀地分散到蒸馏水中制备样品，滴加适量湿态样品于激光粒度仪的测量杯中。粒径分布常用粒径分布系数r
span
值来表示，数值越小，说明粒径均一。
[0192]
图1含本发明实施例1制备的复合多糖微球(琼脂糖：葡聚糖＝5:1、4:2、3:3、2:4)放大100倍数的光学显微镜图片与粒径分布图。从图中可以看出，当琼脂糖：葡聚糖＝5:1、4:2、3:3、2:4时，随着复合多糖组成成分中葡聚糖占比的提高，微球的平均粒径随之减小。其中优选琼脂糖与葡聚糖比例为4:2时，粒径分布均一，且符合作为核壳微球壳层的粒径大小。
[0193]
图2为对比例1-3制备所得放大100倍数的光学显微镜图片。从图中可以看出，对比例1-3所示的微球球形度良好，单分散性良好。
[0194]
图3是本发明实施例2-4中新型多核结构琼脂糖凝胶微球与其内核琼脂糖凝胶微球的粒径及粒径分布图。从图中可以看出，当核壳微球包裹有平均粒径25μm的内核琼脂糖微球时，平均粒径会相应增大大；且当壳层复合有葡聚糖时，微球粒径会进一步增大。
[0195]
图4为本发明实施例2-5制备的新型多核结构琼脂糖凝胶微球放大100倍数的光学显微镜图片。从图中可以看出，实施例2的壳层材料仅含琼脂糖时，微球呈澄清透明；实施例2-5所示的微球球形度良好，单分散性良好。实施例5的三种不同浓度壳层的微球，可以观察到随着壳层浓度的提高，平均粒径逐渐增大。
[0196]
图5是本发明实施例5中以6％琼脂糖微球为内核的一系列新型多核结构琼脂糖凝胶微球的平均粒径及粒径分布图。当壳层浓度为4.5-7.5％(即壳层浓度为3％琼脂糖与1.5％葡聚糖，4％琼脂糖与2％葡聚糖，5％琼脂糖与2.5％葡聚糖)时，说明在相同的实验条件下，随着壳层浓度的提高，平均粒径逐渐增大，粒径分布系数r
span
减小，粒径相对更均一。
[0197]
图6为本发明实施例6-10制备的新型多核结构琼脂糖凝胶微球放大100倍数的光学显微镜图片。从图中可以看出，实施例6-10均制备出球形度良好，单分散性良好的微球。
[0198]
图7是本发明实施例11中不同内核微球大小的新型多核结构琼脂糖凝胶微球的光学显微镜图与粒径分布图。从图中可以看出，粒径分析图具有两个峰值，第一峰表示未被包裹的内核微球体积百分比，第二峰表示形成的核壳微球体积百分比。当内核微球的粒径小于60μm(即10-45μm，45-60μm)时，所形成的核壳微球总体积占比最高，光学显微镜图中可见核壳微球形态良好。当内核微球的粒径大于60μm(即60-75μm，75-105μm)时，粒径图中的体积百分比以内核微球为主，且从光学显微镜中可见，形成的核壳微球粒径过大，易破裂。
[0199]
图8是本发明实施例12中不同乳化转速下的新型多核结构琼脂糖凝胶微球的光学显微镜图与粒径分布图。从图中可以看出，乳化转速为800-1400rpm时，均能形成核壳微球。
[0200]
图9是本发明实施例13中不同交联时间的新型多核结构琼脂糖凝胶微球的光学显微镜图与粒径分布图。当交联时间为15min与30min时，均能形成形态良好的多核结构琼脂糖凝胶微球。其中优选交联时间为30min时，多核结构琼脂糖凝胶微球的粒径分布最均一。
[0201]
2)红外光谱图测试：将微球经过干燥、粉碎、过筛后，与溴化钾混合压片，使用傅里叶红外光谱仪测试，见图10，不同类型微球均体现出明显的多糖吸收特征峰，3016-3679cm-1
为缔合羟基的伸缩振动带，实施例3和4中该振动带强度的降低，说明复合多糖分子中的大量羟基参与了交联反应；2824-3008cm-1
为-ch的伸缩振动带，实施例3和4中2855cm-1
处峰值的出现，是亚甲基基团强度增加的结果，由于制备过程中使用了交联剂，使微球中引入了更多的亚甲基基团。
[0202]
3)环氧基修饰密度测试：分别将实施例中所制备的微球以及所使用的内核琼脂糖凝胶微球，同时进行环氧氯丙烷活化，加入硫代硫酸钠，并用标准盐酸溶液滴定，滴定所求得的活化凝胶微球中释放的oh
－
的浓度，就是环氧基的浓度，通过换算得出环氧基修饰密度。其中内核琼脂糖微球的环氧基修饰密度为66.82μmol/g，实施例2的多核结构琼脂糖微球的环氧基修饰密度为61.97μmol/g，实施例3的多核结构琼脂糖微球的环氧基修饰密度为52.77μmol/g，实施例4的多核结构琼脂糖微球的环氧基修饰密度为50.53μmol/g见图11。
[0203]
4)流速-压力测试：取不同类型琼脂糖凝胶微球装于5ml的层析柱中。通入一定流速，待柱床稳定后，采用恒定压力，测最高流速的方法，通过逐步间隔式增大压力，稳定5min后，记录对应压力下的相应流速，直至在一定范围压力下，流速变化趋于稳定时，可得出该微球介质的最高流速，由此绘制流速-压力曲线。见图12，反映了本发明制备的新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球，以内核琼脂糖微球提供支撑作用，结合壳层采用复合多糖预交联形成互穿型凝胶网络结构，使得机械性能得到大幅提高，超过交联6％琼脂糖凝胶微球。见图13，反映了本发明制备的新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球，随着壳层复合多糖浓度的提高，机械性能随之得到有效提高。
[0204]
5)凝胶过滤色谱性能测试：将核壳型琼脂糖微球装填至层析柱(10cm
×
1.5cm i.d.)内，并使用缓冲液(ph 6.8的0.01mol/l tris-hcl)进行平衡，直至基线趋于平稳。配
制标准蛋白混合溶液：将每种标准蛋白在缓冲液中溶解(1mg/ml)，并吸取100μl溶液注入层析柱中，使用上述缓冲液进行洗脱，将检测波长设置为280nm并记录层析谱图。每次层析操作均使用akta蛋白纯化系统重复进行，流速保持在1.0ml/min。kd值的计算方法如下：
[0205][0206]
式中，vr——样品的保留体积(ml)；本测试例的样品是牛血清白蛋白；
[0207]
v0——外水体积(ml),由蓝色葡聚糖2000的保留体积标定；
[0208]
vt——总流动相体积，包含内水体积与外水体积(ml),由尿嘧啶的保留体积标定。
[0209]
总流动相体积与外水体积之差，即为填充琼脂糖微球内部孔隙的内水体积，反映微球内部的网络结构疏密程度以及孔隙率大小。见图14与表1，随着多核结构复合琼脂糖凝胶微球的壳层浓度的提高，牛血清白蛋白样品溶质分子的kd值越小，说明流出越快，微球形成的孔隙越小。
[0210]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

技术特征：
1.一种新型多核结构琼脂糖凝胶微球，其特征在于，微球的核心是粒径不大于60μm的琼脂糖小微球，琼脂糖小微球均匀分散在微球内部；微球的壳层是中性多糖复合材料。2.权利要求1所述新型多核结构琼脂糖凝胶微球，其的制备方法包括如下步骤，s1.制备内核琼脂糖微球，包括：s1.1.第一油相的制备：将表面活性剂和与水互不相溶的第一油性物质混合；s1.2.第一水相的制备：制备含有4-6％w/v琼脂糖的多糖溶液，加热至澄清透明，完全溶解；s1.3.将上述制备好的第一水相倾倒入制备好的正在搅拌的第一油相中乳化，再降温固化，使琼脂糖液滴凝固成微球状态；s1.4.离心使其破乳分层，弃去上清液后反复清洗直至洗净，即可获得内核琼脂糖微球；优选的，所述离心为3500rpm5min；s2.内核琼脂糖微球交联活化，具体步骤包括：s2.1.将上述获得的内核琼脂糖微球与水、浓碱、1,4-二氧六环和第一交联剂混合均匀；s2.2.将上述得到的混合体系在150-400rpm，20-35℃，反应2-6h；s2.3.将上述所得使用超纯水或乙醇反复清洗多次，洗去naoh溶液以及有机溶剂，即可获得后交联处理的内核琼脂糖微球；s3.新型多核结构琼脂糖凝胶微球的获得：s3.1第二油相的制备：将表面活性剂和与水互不相溶的第二油性物质混合；s3.2第二水相的制备：制备含有4.5-7.5％w/v含琼脂糖的多糖溶液，加热至澄清透明使其完全溶解，再加入后交联处理的内核琼脂糖微球，混合均匀；如果有气泡就加热消泡；s3.3将制备的第二水相倾倒入制备的正在搅拌的第二油相中，继续搅拌乳化，再固化；以使w/o乳液滴冷却凝固成琼脂糖凝胶微球；s3.4再加入浓碱与第二交联剂反应；s3.5离心使其分层，弃去上清液后反复清洗直至洗净，即可获得新型多核结构琼脂糖凝胶微球；优选的，所述离心为3500rpm5min。3.如权利要求2所述新型多核结构琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，s1.1步骤中，所述表面活性剂为0.75-2％w/vspan80，第一油性物质为液体石蜡。4.如权利要求2所述新型多核结构琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，s1.2步骤中，多糖溶液还含有葡聚糖。5.如权利要求2所述新型多核结构琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，s1.3步骤中，所述乳化为800-1400rpm下乳化10-30min；所述固化为500-600rpm下降温至15-25℃；所述液体石蜡与琼脂糖的多糖溶液的体积比为200:60。6.如权利要求2所述新型多核结构琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，s2.1步骤，所述第一交联剂为卤代环氧化合物和双缩水甘油醚类试剂中的至少一种；优选的，卤代环氧化合物为环氧氯丙烷，双缩水甘油醚类试剂选自乙二醇二缩水甘油醚，丁二醇二缩水甘油醚和己二醇二缩水甘油醚中的任意一种；任选的，所述内核琼脂糖微球：浓碱：交联剂的用量比为36g：14ml：14ml。7.如权利要求2所述新型多核结构琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，s3.1步骤
中，所述表面活性剂为0.75-2％w/vspan80，第二油性物质为液体石蜡。8.如权利要求2所述新型多核结构琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，s3.2步骤中，所述多糖溶液还含有葡聚糖；所述后交联处理的内核琼脂糖微球与多糖溶液的质量比为1:2-5。9.如权利要求2所述新型多核结构琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，s3.3步骤中，所述继续搅拌乳化的转速为800-1400rpm，乳化10-30min；任选的，所述固化为500-600rpm下降温至15-25℃；任选的，所述液体石蜡：含琼脂糖的多糖溶液：后交联处理的内核琼脂糖微球的用量比为180ml：36g：18g。10.如权利要求2所述新型多核结构琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，s3.4步骤中，所述第二交联剂为卤代环氧化合物和双缩水甘油醚类试剂中的至少一种；优选的，卤代环氧化合物为环氧氯丙烷，双缩水甘油醚类试剂选自乙二醇二缩水甘油醚，丁二醇二缩水甘油醚和己二醇二缩水甘油醚中的任意一种；任选的，浓碱：交联剂的体积用量比为1：2；任选的，所述反应为300rpm的转速搅拌；优选的，反应时间为30min。

技术总结
本发明公开了一种新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球及其制备方法。微球的核心是粒径不大于60μm的琼脂糖小微球，琼脂糖小微球均匀分散在微球内部；微球的壳层是中性多糖复合材料。先制备内核琼脂糖微球，再将内核琼脂糖微球交联活化，最后以活化交联后的琼脂糖凝胶微球为内核，预交联多糖凝胶微球为壳层制备新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球。这种核壳型微球兼具内核的细孔结构和壳层的大孔结构，经过交联处理制备的高分辨率层析介质，其丰富的孔道结构有利于生物分子在介质内部的高效传质，且机械强度也获得大程度地提高。机械强度也获得大程度地提高。机械强度也获得大程度地提高。


技术研发人员：肖安风 叶津铭 兰博 肖琼 陈福泉 宋思萌 陈俊 杨秋明 庄小燕
受保护的技术使用者：集美大学
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/8/4