一种基于苯并吲哚-肉桂醛的粘度荧光探针的制备和应用

1.本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于苯并吲哚-肉桂醛的粘度荧光探针的制备和应用。


背景技术：

2.粘度作为细胞微环境中的一个重要参数，在控制细胞过程中起着关键作用，例如信号的传输、蛋白质聚集、膜融合(w.j.akers，ma.j.haidekker，biomech.eng.，2005，127，450-454；c.otto，m.m.ritter，w.o.richter，r.minkenberg，p.schwandt，metabolism，2001，50，166-170；m.a.haidekker，e.a.theodorakis，org.biomol.chem.，2007，5，1669-1678)。细胞内粘度异常已被证明是动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、阿尔茨海默病以及恶性肿瘤的诱因(z.g.yang，y.x.he，j.h.lee，n.park，m.suh，w.s.chae，j.f.cao，x.j.peng，h.jung，c.kang，j.s.kim，j.am.chem.soc.，2013，135，9181-9185；m.g.ren，b.b.deng，k.zhou，x.q.kong，j.y.wang，w.y.lin，anal.chem.，2017，89，552-555；s.j.li，y.f.li，h.w.liu，d.y.zhou，w.l.jiang，j.ou-yang，c.y.li，anal.chem.，2018，90，9418-9425；g.s.zubenko，u.kopp，t.seto，l.l.firestone，psychopharmacology，1999，145，175-180)。鉴于粘度重要的生理及临床意义，精确检测粘度变化是十分有必要的。
3.传统的测量粘度的方法有：毛细管粘度计法，乌氏粘度计法，落球粘度计法等，这些测量方法操作复杂，无法实现对体内细胞粘度的实时监测。与传统的检测方法相比，荧光成像具有高灵敏度、实时和原位检测的优点，非常适合于定位和动态监测生命系统中的分子。到目前为止，已有一些对细胞内粘度成像的荧光探针的报道(j.l.yin，x.q.kong，w.y.lin，anal.chem.，2021，93，2072-2081；k.dou，w.j.huang，y.h.xiang，s.j.li，z.h.liu，anal.chem.，2020，92，4177-4181；y.y.zhang，z.li，w.hu，z.h.liu，anal.chem.，2019，91，10302-10309)，然而，大多数的荧光探针仍存在发射波长短、高本底荧光等局限性。因此，设计和合成具有长波长和高响应倍数的荧光探针是非常迫切且有意义的。


技术实现要素：

4.根据所提出的要求，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，提供了一种基于苯并吲哚-肉桂醛的近红外粘度荧光探针。
5.本发明的技术方案是，一种基于苯并吲哚-肉桂醛的粘度荧光探针，其结构式如下：
[0006][0007]
一种基于苯并吲哚-肉桂醛的粘度荧光探针的制备方法。步骤如下：
[0008]
在50ml圆底烧瓶中，加入20ml无水乙醇，接着，将1当量的苯并吲哚和1～1.2当量
的4-(二甲氨基)肉桂醛混合，加入0.1ml哌啶和0.1ml乙酸，在60～100℃的条件下，反应混合物在n2保护下，搅拌回流10～14h，停止反应，用减压蒸馏除去溶剂，再用体积比为400∶0.1～100∶1的二氯甲烷/甲醇进行柱层析，除去溶剂后得到蓝黑色固体，即为所述荧光探针。
[0009]
本发明的有益效果是，一种基于苯并吲哚-肉桂醛的粘度荧光探针的良好的光谱响应性能。首先，研究该探针的荧光光谱性质。荧光探针本身与水混合在790nm处没有明显的近红外发射峰；探针与甘油混合之后，在790nm处出现了明显的近红外发射峰。并且随着甘油体积配比增大，粘度增加，探针的近红外荧光强度不断增强。该探针的线性检测范围从1.03cp到657.50cp，这说明该探针可以高灵敏的检测粘度变化。接着，研究探针的紫外吸收光谱。探针本身在675nm处有吸收带；与甘油混合之后，675nm处的吸收峰发生红移至695nm。然后，研究探针的选择性。考察了探针与活性氧(h2o2，clo-)，活性氮(no，onoo-)，活性硫(hs-，hso
3-)，常见阴离子(i-，br-，cl-，ch3coo-，hco
3-)，常见阳离子(k
+
，mg
2+
，na
+
，fe
2+
，ca
2+
，cu
2+
，zn
2+
，nh
4+
)(200μm)和粘度的荧光响应情况。结果发现，只有粘度大的甘油能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。最后，研究了ph值对荧光探针测定粘度的影响，当ph值在6.0到10.0之间时，不影响荧光探针对粘度的测定。此外，该荧光探针光稳定性好，荧光强度在180min以内保持稳定。
[0010]
一种基于苯并吲哚-肉桂醛的粘度荧光探针的应用。在细胞中只加入荧光探针，红色通道几乎没有荧光。细胞用制霉菌素(nystatin)处理，刺激细胞内粘度升高，然后加入探针，检测到细胞内出现了很强的红色荧光信号。这些结果说明荧光探针能监控细胞内粘度的变化，这为监控人体内和粘度异常相关病变提供一种可靠的手段。
附图说明
[0011]
图1为荧光探针的合成路线。
[0012]
图2为荧光探针在不同粘度溶液中的荧光光谱图。
[0013]
横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针的浓度为10μm，甘油(gly)浓度分别为：0，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，99％，其粘度值分别为1.03cp，3.75cp，6.05cp，14.87cp，31.16cp，65.48cp，87.23cp，148.23cp，201.26cp，258.45cp，418.18cp，471.80cp，657.50cp。荧光激发波长为695nm。
[0014]
图3为荧光探针对于不同粘度的荧光线性响应图。
[0015]
图4为荧光探针在不同粘度溶液中的紫外可见吸收光谱图。
[0016]
图5为荧光探针对粘度测定的离子选择性图。
[0017]
荧光探针的浓度为10μm，甘油浓度为99％，其它分析物浓度均为200μm。
[0018]
图6为ph对荧光探针的影响图。
[0019]
图7为荧光探针连续激光照射时荧光强度随时间变化的关系曲线图。
[0020]
图8为细胞毒性试验。横坐标为荧光探针的浓度，纵坐标为细胞的存活率。
[0021]
图9为荧光探针与粘度作用的细胞成像图。control组：细胞用探针染色20min。制霉菌素组：细胞用制霉菌素处理30min，然后，用探针染色20min。
[0022]
图10相对荧光强度图。
具体实施方式
[0023]
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。
[0024]
实施例1：
[0025]
荧光探针的合成
[0026]
合成路线如图1。荧光探针(nc-v)的合成：在50ml圆底烧瓶中，加入20ml无水乙醇，接着，将苯并吲哚(200mg，1mmol)和4-(二甲氨基)肉桂醛(214mg，1.2mmol)混合，加入0.1ml哌啶和0.1ml乙酸，在80℃的条件下，反应混合物在n2保护下，搅拌回流12h，停止反应，用减压蒸馏除去溶剂，再用体积比为200：1的二氯甲烷/甲醇进行柱层析，除去溶剂后得到蓝黑色固体，即为所述荧光探针。1h nmr(400mhz，dmso-d6，δ，ppm)：8.65(d，j＝6.9hz，1h)，8.34(d，j＝8.1hz，2h)，8.07-8.01(m，2h)，7.87(d，j＝7.7hz，2h)，7.60(d，j＝8.1hz，1h)，7.21(d，j＝12.6hz，1h)，7.06(d，j＝8.1hz，3h)，6.64(d，j＝8.5hz，2h)，4.41(d，j＝6.8hz，2h)，2.88(s，6h)，0.81(d，j＝7.0hz，3h).ms(tof)：353.
[0027]
实施例2：
[0028]
荧光探针和不同粘度溶液配制
[0029]
探针溶液的制备：称取一定量探针溶解在二甲基亚砜中，配成1
×
104m的探针溶液。不同粘度溶液的配制：向10ml的容量瓶加入1ml的探针溶液，再分别加入不同百分比的甘油(gly)后，用缓冲溶液进行定容，得到浓度为1.0
×
10-5
mol
·
l-1
的荧光探针和不同粘度的甘油混合待测溶液。
[0030]
实施例3：
[0031]
荧光探针与不同粘度溶液作用的荧光光谱的测定
[0032]
图2为荧光探针与不同粘度溶液作用的荧光光谱，荧光探针浓度为10μm，甘油(gly)浓度分别为：0，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，99％，与其对应的粘度为1.03cp，3.75cp，6.05cp，14.87cp，31.16cp，65.48cp，87.23cp，148.23cp，201.26cp，258.45cp，418.18cp，471.80cp，657.50cp。激发波长固定为695nm，发射波长范围为720～900nm。狭缝宽度为5.0nm/5.0nm，所用的荧光测定仪器为日立f4600荧光分光光度计。从图2可以看出，荧光探针本身在790nm处没有明显的近红外发射峰；加入甘油溶液之后，在790nm处出现了明显的近红外发射峰。这是因为探针在无粘度或低粘度溶液中自由旋转，被激发的染料通过非辐射跃迁过程返回基态。随着甘油浓度的增加，溶液粘度增加，粘性环境会抑制分子的旋转，阻止激发态分子通过非辐射跃迁到基态，只能通过辐射跃迁才能回到基态，从而探针的荧光强度不断增强。图3为探针对粘度的线性响应图。荧光强度的对数跟粘度的对数呈现线性关系，线性范围是1.03～657.50cp，这说明该探针可以高灵敏的检测粘度。
[0033]
实施例4：
[0034]
荧光探针与粘度作用的紫外可见吸收光谱的测定
[0035]
图4为荧光探针与粘度作用后的紫外可见吸收光谱图，荧光探针的浓度为10μm，甘油(gly)浓度为0％，99％。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为安捷伦cary60紫外可见分光光度计。从图4中可以看出，探针本身在675nm处有吸收带；加入甘油溶液之后，吸收峰随着粘度增大而发生红移至695nm，且吸收峰强度增大。
[0036]
实施例5：
[0037]
荧光探针对粘度测定的选择性
[0038]
图5为荧光探针对粘度测定的选择性图。考察在浓度为10μm的荧光探针溶液中分别加入活性氧(h2o2，clo-)，活性氮(no，onoo-)，活性硫(hs-，hso
3-)，常见阴离子(i-，br-，cl-，ch3coo-，hco
3-)，常见阳离子(k
+
，mg
2+
，na
+
，fe
2+
，ca
2+
，cu
2+
，zn
2+
，nh
4+
)，甘油(gly，99％)(200μm)的荧光响应情况。从图5中可以看出，只有粘度能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。这些结果表明，荧光探针对粘度有较好的选择性。
[0039]
实施例6：
[0040]
溶液ph值对荧光探针测定粘度的荧光性质的影响
[0041]
考察ph值对荧光探针测定粘度的荧光光谱的影响，其结果如图6。研究的ph范围为3.0～13.0，荧光探针的浓度为10μm。从图中可以看出，荧光探针随着ph的变化，荧光强度基本不变，说明ph对探针本身没有很大的影响。然而，加入甘油溶液之后，ph值在6.0～10.0范围内，荧光强度比值显著增强。综上所述，当ph值在6.0到10.0之间时，不影响荧光探针对粘度的测定，是比较合适的ph值范围，这非常有利于该探针用于实际样品中粘度的测定。
[0042]
实施例7：
[0043]
荧光探针与粘度作用的光稳定性测定
[0044]
研究荧光探针与粘度作用的光稳定性，其结果如图7。从图中可以看出，该探针对粘度的响应迅速，并且在接下来的180min连续光照下，荧光强度不发生变化，这表明此荧光探针光稳定性较好，能够满足在实际样品中进行实时监测的要求。
[0045]
实施例8：
[0046]
荧光探针在活细胞中的应用
[0047]
首先，我们做了细胞毒性试验，如图8所示。当加入0～50μm nc-v探针，细胞的成活率均在90％以上。这可以说明，该荧光探针毒性较小，可应用于检测活细胞内的粘度。然后，研究荧光探针在活细胞中的应用，选择hela细胞进行共聚焦显微成像，结果如图9所示。在control组的细胞中只加入荧光探针，红色通道几乎没有荧光。文献报道，制霉菌素(nystatin)可以刺激细胞内粘度异常。制霉菌素组的细胞用制霉菌素(nystatin)预先处理30min，刺激细胞内粘度的产生，然后加入探针染色20min，检测到细胞内出现了很强的红色荧光信号。图10给出了两组细胞相对荧光强度。结果表明荧光探针能监控细胞内粘度含量的变化，这为监控人体内和粘度异常相关病变提供一种可靠的手段。

技术特征：
1.一种基于苯并吲哚-肉桂醛的粘度荧光探针，其特征在于，其结构如下：2.根据权利要求1所述的一种基于苯并吲哚-肉桂醛的粘度荧光探针的制备方法，其特征在于，反应步骤如下：在50ml圆底烧瓶中，加入20ml无水乙醇，接着，将1当量的苯并吲哚和1～1.2当量的4-(二甲氨基)肉桂醛混合，加入0.1ml哌啶和0.1ml乙酸，在60～100℃的条件下，反应混合物在n2保护下，搅拌回流10～14h，停止反应，用减压蒸馏除去溶剂，再用体积比为400∶0.1～100∶1的二氯甲烷/甲醇进行柱层析，除去溶剂后得到蓝黑色固体，即为所述荧光探针。3.根据权利要求1所述的一种基于苯并吲哚-肉桂醛的粘度荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针应用于活细胞内粘度的检测。

技术总结
本发明涉及了一种基于苯并吲哚-肉桂醛的粘度荧光探针的制备和应用，该荧光探针的结构式为：本发明提供了苯并吲哚，4-(二甲氨基)肉桂醛等为原料合成该荧光探针的制备方法；该荧光探针是一种近红外粘度荧光探针；首先，该荧光探针对粘度表现出很高的灵敏度，粘度增加，荧光强度显著增强；其次，该荧光探针对粘度表现出很高的选择性，不受其他活性氧、活性氮、活性硫以及常见阴离子和常见阳离子的干扰；并且，该荧光探针具有较好的光稳定性，在180min持续光照下，荧光强度不变；当pH值在6.0到10.0之间时，不影响荧光探针对粘度的测定；此外，该荧光探针应用于活细胞内粘度的检测。活细胞内粘度的检测。活细胞内粘度的检测。


技术研发人员：李春艳 李莉 廖沁婷
受保护的技术使用者：湘潭大学
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/8/4