一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体及其应用

一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物合成技术领域，具体涉及到一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体及其应用。


背景技术：

2.稀有糖是指自然界中一类含量极少且获取难度极大的单糖。d-阿洛酮糖就是一种稀有糖，具有蔗糖甜度的70％，而其热量仅有蔗糖的0.3％，被认为是一种理想的新型甜味剂和蔗糖替代品。d-阿洛酮糖可以发生美拉德反应，对于食品的风味、色泽、口感等方面具有全面的改善作用。此外，d-阿洛酮糖还具有抗龋齿、预防肥胖、降血糖血脂、抗炎、清除ros等生理功能。2011年，d-阿洛酮糖被美国食品药品监督管理局(fda)批准为gras物质，并进一步于2019年被排除在“添加糖”、“总糖”标签之外。鉴于d-阿洛酮糖在食品、医疗、医药乃至化妆品等领域的广泛前景，d-阿洛酮糖的制备尤其是生物法制备成为近年来研究的热点。
3.d-阿洛酮糖3-差向异构酶(d-allulose 3-epimerase，dae)是生物催化法制备d-阿洛酮糖的关键酶，可以直接催化d-果糖在c3位的羟基发生可逆的差向异构化反应合成d-阿洛酮糖。
4.根据izumoring策略利用d-阿洛酮糖3-差向异构酶催化d-果糖异构化生产d-阿洛酮糖是目前工业上最为常用、有效的方法。然而，野生型d-阿洛酮糖3-差向异构酶往往存在催化活性低、热稳定性差等问题，无法满足工业生产工艺的需求。


技术实现要素：

5.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
6.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
7.本发明的其中一个目的是提供一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，催化活性及热稳定性相比野生型得到显著提升。
8.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，所述d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体是将来源于cabaleronia insecticola的d-阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸序列的第37位的丝氨酸替换为天冬酰胺以及将第157位的苯丙氨酸替换为酪氨酸获得。
9.作为本发明d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的一种优选方案，其中：所述d-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
10.作为本发明d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的一种优选方案，其中：所述d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示。
11.本发明的另一个目的是提供编码所述突变体酶的基因。
12.本发明的另一个目的是提供一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包含所述的基因序列。
13.本发明的另一个目的是提供一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有所述的重组质粒。
14.作为本发明宿主细胞的一种优选方案，其中：所述宿主细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸菌中的一种。
15.本发明的另一个目的是提供一种表达所述突变体酶的重组大肠杆菌。
16.本发明的另一个目的是提供所述突变体酶在制备d-阿洛酮糖中的应用。
17.本发明的另一个目的是提供所述的重组大肠杆菌在制备d-阿洛酮糖中的应用。
18.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
19.本发明得到的daease突变体酶s37n/f157y，催化活性相比野生型提升了14.7％，同时热稳定性得到显著提升，65℃下的半衰期由野生型的1.60h延长至27.56h，较野生型的半衰期延长了16.23倍。此外，实现了dae野生型及突变体在枯草芽孢杆菌内的异源表达，并利用全细胞生产d-阿洛酮糖，双突变体在1h内达到33.3％的转化率，较野生型(4h内30.1％转化率)催化效率明显提高，同时达到了更高的平衡转化率。这表明，该重组工程菌具有良好的工业应用潜力。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
21.图1为本发明野生型及s37n/f157y双突变体酶在65℃下的热稳定性；其中，(a)为野生型酶的热稳定性；(b)为s37n/f157y双突变体酶的热稳定性。
22.图2为本发明野生型及s37n/f157y双突变体酶异源表达枯草芽孢杆菌全细胞生产d-阿洛酮糖的情况。
具体实施方式
23.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
24.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
25.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
26.为了描述本发明的方便，使用各种氨基酸残基的常规和非常规缩写。这些缩写是本领域技术人员熟悉的，但是为了清楚在下面列出：
27.asp＝d＝天冬氨酸；ala＝a＝丙氨酸；arg＝r＝精氨酸；
28.asn＝n＝天冬酰胺；gly＝g＝甘氨酸；glu＝e＝谷氨酸；
29.gln＝q＝谷氨酰胺；his＝h＝组氨酸；ile＝i＝异亮氨酸；
30.leu＝l＝亮氨酸；lys＝k＝赖氨酸；met＝m＝甲硫氨酸；
31.phe＝f＝苯丙氨酸；pro＝p＝脯氨酸；ser＝s＝丝氨酸；
32.thr＝t＝苏氨酸；trp＝w＝色氨酸；tyr＝y＝酪氨酸；
33.val＝v＝缬氨酸；cys＝c＝半胱氨酸。
34.本发明所述的突变体命名，按照本领域技术人员常规命名方式，例如：突变体f157y表示d-阿洛酮糖3-差向异构酶(dae)其氨基酸第157位的苯丙氨酸(f)经过定点突变为酪氨酸(y)。
35.编码来源于cabaleronia insecticola的野生型d-阿洛酮糖3-差向异构酶基因在genbank的编号为ban26336.1，核苷酸序列如seq id no.1所示，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
36.本发明中所用部分试剂及培养基配制如下：
37.50mm glycine-naoh缓冲液(ph 9.0)：3.7535g甘氨酸，加入去离子水定量至1l，并用naoh固体调节ph至9.0
38.lb培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g nacl，加入去离子水定量至1l，121℃下高压蒸汽灭菌20min。
39.tb培养基：12g/l胰蛋白胨，24g/l酵母提取物，4ml/l甘油，2.31g/lkh2po4，16.43g/l k2hpo4·
3h2o，营养成分与磷酸盐溶液在121℃下分开灭菌20min，于超净工作台内混合。
40.实施例1：d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的构建
41.重组质粒pet-28a(+)-dae
s37n/f157y
的构建：以本实验室前期构建的含有cabaleronia insecticola来源的dae基因(核苷酸序列如seq id no.1所示)的质粒pet-28a(+)-dae(其质粒载体pet-28a(+)及dae基因均易获取，通过基因合成或者质粒构建的方法得到该重组质粒，参考文献li,z.,feng,l.,chen,z.,hu,y.,fei,k.,xu,h.and gao,x.-d.(2023),efficient enzymatic synthesis of d-allulose using a novel d-allulose-3-epimerase from cabaleronia insecticola.j sci food agric,103:339-348.)为模板，含有简并碱基的引物f、r为引物，采用prime star酶通过pcr，引入s37n和f157y定点突变，测序验证结果表明除了所需突变位点外，没有出现随机突变。编码d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体酶s37n/f157y的核苷酸序列如seq id no.3所示，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
42.突变引物为：
43.s37n-f：gatttgatatgatggagatcaatttaagtgaatttcacaattt
44.s37n-r：aaattgtgaaattcacttaaattgatctccatcatatcaaatc
45.f157y-f：ccctggaggtggttaaccgctatgagcagtggcttgcaaacga
46.f157y-r：tcgtttgcaagccactgctcatagcggttaaccacctccaggg
47.pcr反应体系(50μl)为：ddh2o 31μl,5
×
prime star buffer 10μl，dntps4μl，模板(质粒dna浓度：80ng/μl)1μl，上下游引物各1μl，prime star酶1μl。
48.pcr反应条件为：94℃3min；98℃30s,55℃30s，68℃10min，循环22次；68℃10min，12℃∞。以2％琼脂糖凝胶电泳验证pcr扩增产物，当目的条带大小符合理论值时，用dpni酶
消化pcr产物中的模板dna，然后用产物回收试剂盒进行产物回收。
49.接着，通过化学法(cacl2法)转化pcr产物至e.coli bl21(de3)感受态细胞中，获得重组菌e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-dae
s37n/f157y
。
50.实施例2：突变体的摇瓶表达及蛋白纯化
51.将重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-dae(野生型，wt)以及e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-dae
s37n/f157y
在新鲜lb平板(kan，50μg/ml)上进行划线活化。
52.分别挑取长势良好的单菌落接种于装有5ml lb液体培养基(kan，50μg/ml)的试管中，37℃，220rpm下培养过夜。次日，种子液以1％的接种量转接至装有50ml新鲜tb液体培养基(kan，50μg/ml)的250ml摇瓶中，待菌体浓度od
600
达0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mm的iptg，在16℃，220rpm条件下诱导表达产酶24h。
53.取菌液于8000rpm，4℃下离心10min，收集菌体，用裂解缓冲液(25mm tris-hcl，150mm nacl，ph 8.0)重悬菌体，置于冰上进行超声破碎(超声5s，间隔5s)，破碎后于4℃，12000rpm条件下离心30min。
54.通过ni
2+
亲和层析柱(5ml histrp
tm
hp)手动纯化蛋白，具体步骤为：
①
依次使用30ml去离子水、10ml 0.1m niso4溶液对镍柱进行清洗和再生；
②
20ml去离子水洗去未结合的ni
2+
；
③
20ml平衡缓冲液(25mm tris-hcl，150mm nacl，ph 8.0)平衡柱子；
④
粗酶液缓慢上样结合镍柱；
⑤
依次使用20ml平衡缓冲液、20ml低浓度(60mm)咪唑溶液洗脱未结合镍柱的杂蛋白以及结合镍柱能力较弱的杂蛋白；
⑥
20ml高浓度(500mm)咪唑溶液洗脱目的蛋白并收集。最后，利用超滤管(10kda)在低温条件下离心(14000g)对目标蛋白进行浓缩、脱盐，并用bca试剂盒测定蛋白浓度。
55.实施例3：突变体相对酶活的测定
56.在500μl ph 9.0glycine-naoh缓冲液配制的250mm d-果糖反应液中(含5mm mn
2+
)，加入0.03mg/ml纯酶，于65℃下反应5min，并于100℃下煮沸10min终止反应。离心，取反应上清稀释到一定浓度后，用0.22μm的滤膜过滤处理，hplc定量分析，并计算相对酶活。以野生型的酶活水平为100％，各突变体的相对活性如下表1所示。
57.表1野生型及突变体在65℃下的相对酶活比较
[0058][0059]
可以看出，在65℃下，s37n/f157y突变体催化活性提升了14.71％。
[0060]
实施例4：突变体温度稳定性的测定
[0061]
将酶液于65℃下放置不同时间进行预处理，然后加入至500μl ph 9.0glycine-naoh缓冲液配制的250mm d-果糖反应体系中(含5mm mn
2+
)，加酶量为0.03mg/ml，准确反应5min，100℃煮沸10min终止反应。离心，取反应上清稀释到一定浓度后，用0.22μm的滤膜过滤处理，hplc定量分析，并计算相对残余酶活。以未预处理的酶液所测得酶活记为相对酶活100％，各突变体相对残余酶活与时间的关系如图1所示。根据曲线得到野生型及各突变体在该温度下的半衰期，如表2所示。
[0062]
表2野生型及其突变体在65℃下的热稳定性
[0063][0064]
可以看出，在65℃下，s37n/f157y突变体半衰期由野生型的1.60h延长至27.56h，增加了16.23倍。较好的温度稳定性使得酶可以在长时间的高温反应下酶活损失较少，使得酶能以较高催化活性催化反应进行。
[0065]
实施例5：突变前后酶的性质比较
[0066]
本实施例研究ph及温度对改造后突变体酶的催化活性的影响，c.insecticola daease野生型酶突变为突变体s37n/f157y后，最适ph没有发生变化，仍为9.0；而最适温度上升为75℃，较野生型提升了10℃。
[0067]
实施例6：突变体在枯草芽孢杆菌中的异源表达及应用
[0068]
利用引物p
ylbp-f/r从枯草芽孢杆菌基因组上扩增出启动子p
ylbp
片段，引物dae-f/r扩增出经密码子优化后的dae片段(核苷酸序列如seq id no.5所示)，重组至pp43nmk载体骨架的bamhi、psti之间。测序成功的重组质粒pp43nmk-p
ylbp-dae转化至枯草芽孢杆菌感受态b.subtilis wb800中。
[0069]
引物序列为：
[0070]
p
ylbp-f:cgagatttttttgagcaactggatccacttctcaaagatcccatgtg
[0071]
p
ylbp-r:gtgatgatgatgatgatgcatacaaatctccccctttg
[0072]
dae-f:ggggagatttgtatgcatcatcatcatcatcacaataaggtcgggatgt
[0073]
dae-r:cgaggtgcgcacctgcggtgctgcagttatgctaaatgcccccgtac
[0074]
取平板上长势良好的单菌落接种于5ml lb液体培养基(kan，50μg/ml)中，于37℃，220rpm摇床上培养10～12h。然后，种子液以2％的接种量转接至新鲜的50ml tb液体培养基(kan，50μg/ml)中，继续培养约15h后，5000rpm离心收集菌体，用于全细胞反应生产d-阿洛酮糖。
[0075]
全细胞反应在总体系为500μl的ph 9.5glycine-naoh缓冲液体系中进行，d-果糖浓度设定为500g/l，细胞量为40g/l，并加入5mm mg
2+
，于65℃下反应一段时间，间隔取样，测定不同时间段d-阿洛酮糖的生产情况，结果如图2所示。
[0076]
结果表明，双突变体s37n/f157y在1h内实现了33.3％的转化率，相比野生型(4h内转化率30.1％)在催化效率上明显提高，同时双突变体在d-阿洛酮糖合成中实现了较野生型更高的平衡转化率。这表明，该重组双突变体菌具有很好的工业应用潜力。
[0077]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

技术特征：
1.一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，其特征在于：所述d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体是将来源于cabaleronia insecticola的d-阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸序列的第37位的丝氨酸替换为天冬酰胺以及将第157位的苯丙氨酸替换为酪氨酸获得。2.如权利要求1所述的d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，其特征在于：所述d-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。3.如权利要求1所述的d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，其特征在于：所述d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示。4.编码权利要求1或3所述突变体酶的基因。5.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包含权利要求4所述的基因序列。6.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有权利要求5所述的重组质粒。7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸菌中的一种。8.一种表达权利要求1或3所述突变体酶的重组大肠杆菌。9.如权利要求1或3所述突变体酶在制备d-阿洛酮糖中的应用。10.如权利要求8所述的重组大肠杆菌在制备d-阿洛酮糖中的应用。

技术总结
本发明公开了一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体及其应用，将来源于Cabaleronia insecticola的D-阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸序列的第37位的丝氨酸替换为天冬酰胺以及将第157位的苯丙氨酸替换为酪氨酸获得。本发明得到的突变体酶，催化活性相比野生型提升了14.7％，同时热稳定性得到显著提升。此外，较野生型催化效率明显提高，同时达到了更高的平衡转化率，这表明，该重组工程菌具有良好的工业应用潜力。应用潜力。应用潜力。


技术研发人员：李子杰 胡扬帆 中西秀树 高雅慧
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/8/4