TMEM147-AS1抑制剂作为制备治疗卵巢癌联合靶向药物的应用

tmem147-as1抑制剂作为制备治疗卵巢癌联合靶向药物的应用
技术领域
1.本发明涉及lncrna及蛋白技术领域，尤其是涉及一种tmem147-as1抑制剂作为制备治疗卵巢癌联合靶向药物的应用。


背景技术：

2.作为全球范围内影响最为恶劣的恶性肿瘤之一，卵巢癌的致死率在所有妇科肿瘤中居于首位。最新的报道显示，在女性癌症患者中，卵巢癌的死亡率在所有癌症中位居第五位，同时其五年生存率为45％。在所有卵巢癌的病例中，上皮性卵巢癌的比例最高，超过了50％。目前临床上用于卵巢癌诊断的主要方法有盆腔检查、阴道超声检查以及血清肿瘤标志物ca125检测，而主要的治疗手段为分期手术结合铂类/紫杉醇为基础的化疗。由于卵巢癌在治疗过程中容易产生化疗耐药性，导致其预后差、复发率高。
3.研究表明lncrna在生物体内的多个水平调控基因的表达，因对细胞有重要的调节作用而成为近来研究的热点。tmem147-as1位于人染色体19q13.12上，其转录本长度为3300bp，是基因tmem147的反义lncrna(antisense lncrna)。反义lncrna通常是指由蛋白编码基因的反义链转录得到非编码rna分子，并且与该基因的mrna在序列上存在重叠。更为重要的是，反义lncrna通常与其正义链基因的表达存在一定的关联性，这表明反义lncrna能够参与蛋白编码基因的表达调控。截至目前，未发现关于tmem147-as1在卵巢癌中的生物学功能的相关研究报道。
4.近20％的卵巢癌患者对于标准的铂类化疗会产生耐药性，这使得化疗抵抗成为卵巢癌治疗中最关键的问题之一。接受化疗的患者需要面对疾病复发以及承担耐药风险。更重要的是，对于获得性抵抗通常还没有有效的治疗方法。目前，对lncrna和卵巢癌耐药的研究尚处于起步阶段，只有少量lncrna被发现与化疗耐药有关，相关的调控机制仅包括dna损伤和细胞凋亡，因此需要进一步的研究来探索更多潜在的对化疗耐药性有调控作用的lncrna。


技术实现要素：

5.基于现有技术中缺少更多潜在的对化疗耐药性有调控作用的lncrna，本发明提供tmem147-as1抑制剂作为制备治疗卵巢癌联合靶向药物的应用。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
7.本发明首先提供一种靶向tmem147-as1的tmem147-as1抑制剂，其序列为gcagcuucuuguccucaua dtdt(3'悬垂)，所述tmem147-as1抑制剂经甲基化和胆固醇修饰后，在卵巢癌人源肿瘤异种移植模型中能够特异性抑制tmem147-as1表达。
8.本发明进一步提供tmem147-as1抑制剂作为制备治疗卵巢癌联合靶向药物的应用。
9.在本发明的一个实施方式中，所述tmem147-as1抑制剂在制备抑制aurka/ddx5蛋
白的表达，以抑制卵巢癌的肿瘤生长的药物中的应用。
10.在本发明的一个实施方式中，所述tmem147-as1抑制剂在制备阻滞hey和skov3细胞的细胞增殖的药物中的应用。
11.在本发明的一个实施方式中，所述tmem147-as1抑制剂在制备抑制卵巢癌细胞g2/m细胞周期转换的药物中的应用。
12.在本发明的一个实施方式中，所述tmem147-as1抑制剂在制备阻滞hey和skov3细胞的脂滴形成的药物中的应用。
13.在本发明的一个实施方式中，所述tmem147-as1抑制剂在制备抑制hey和skov3细胞的脂噬以促进卵巢癌顺铂敏感的药物中的应用。
14.在本发明的一个实施方式中，所述tmem147-as1抑制剂和aurka抑制剂vx-680在制备用以促进卵巢癌顺铂敏感的联合用药中的应用。
15.在本发明的一个实施方式中，所述tmem147-as1抑制剂在制备非小细胞肺癌的药物中的应用。
16.在本发明的一个实施方式中，所述tmem147-as1抑制剂和aurka抑制剂vx-680以及顺铂在制备抑制卵巢癌生长的联合用药中的应用。
17.与现有技术相比，本发明研究tmem147-as1在人正常卵巢和卵巢癌组织中的表达差异，发现tmem147-as1在人类卵巢癌组织及细胞系中特异性高表达，因此，本发明提出tmem147-as1可作为潜在的药物靶点用于卵巢癌的联合用药，进而提供tmem147-as1抑制剂作为制备治疗卵巢癌联合靶向药物的应用，为卵巢癌的治疗提供了重要的实验依据和应用指导。
附图说明
18.图1tmem147-as1抑制剂作为制备治疗卵巢癌联合靶向药物的应用的原理示意图；
19.图2.tmem147-as1在上皮性卵巢癌细胞系及组织中呈现高表达趋势
20.图2包括图2a、图2b、图2c、图2d、图2e、图2f、图2g、图2h、图2i、图2j；
21.a.根据前期研究基础分别在ovca-420/ovca-429中构建aurka过表达/敲低稳转细胞系。
22.b.通过对rna-seq结果分析并筛选出与aurka表达呈正负相关性的lncrna。
23.c.筛选出的lncrna所对应的转录本长度及染色体定位。
24.d.通过qrt-pcr验证并确定tmem147-as1与aurka表达呈正相关。
25.e.正常卵巢上皮细胞系hosepic和人卵巢癌细胞系a2780、hey、skov3、ovca-420、ovca-429和ovca-433中tmem147-as1的表达情况。
26.f.71例正常卵巢组织和60例上皮性卵巢癌组织中tmem147-as1的表达情况。
27.g.tmem147-as1与上皮性卵巢癌总生存率的相关性。
28.h.tmem147-as1与上皮性卵巢癌无进展存率的相关性。
29.i.免疫组化检测aurka在4例正常卵巢组织和4例上皮性卵巢癌组织中的表达情况。
30.j.原位杂交检测tmem147-as1在4例正常卵巢组织和4例上皮性卵巢癌组织中的表达情况。
31.图3.敲低tmem147-as1能够抑制上皮性卵巢癌细胞增殖及g2/m细胞周期转换
32.图3包括图3a、图3b、图3c、图3d、图3e、图3f、图3g、图3h、图3i、图3j、图3k；
33.a.qrt-pcr检测tmem147-as1敲低稳转细胞系中tmem147-as1的表达水平变化。
34.b.cck-8实验确认敲低tmem147-as1能够抑制上皮性卵巢癌细胞增殖。
35.c.qrt-pcr检测tmem147-as1过表达稳转细胞系中tmem147-as1的表达水平变化。
36.d.cck-8实验确认过表达tmem147-as1能够促进上皮性卵巢癌细胞增殖。
37.e&f.克隆形成实验确认敲低tmem147-as1能够抑制上皮性卵巢癌细胞成克隆能力。
38.g&h.克隆形成实验确认过表达tmem147-as1能够促进上皮性卵巢癌细胞成克隆能力。
39.i.过表达tmem147-as1能够上调vx-680在卵巢癌中的ic50值。
40.j&k.过表达tmem147-as1能够回复vx-680对于g2/m期的阻滞作用。
41.图4.tmem147-as1能够诱导脂滴形成及脂噬发生以促进上皮性卵巢癌顺铂抵抗
42.图4包括图4a、图4b、图4c、图4d、图4e、图4f、图4g、图4h
43.a.敲低tmem147-as1能够下调顺铂在卵巢癌中的ic50值。
44.b.过表达tmem147-as1能够上调顺铂在卵巢癌中的ic50值。
45.c&e.敲低tmem147-as1能够促进卵巢癌中经顺铂处理后的凋亡率。
46.d&f.过表达tmem147-as1能够抑制卵巢癌中经顺铂处理后的凋亡率。
47.g.tmem147-as1能够诱导卵巢癌细胞中的脂滴形成。
48.h.tmem147-as1能够介导卵巢癌细胞的脂噬发生以抵抗顺铂处理。
49.图5.tmem147-as1通过激活aurka/ddx5在体内驱动卵巢癌的肿瘤生长图5包括图5a、图5b、图5c、图5d、图5e、图5f、图5g、图5h
50.a.敲低tmem147-as1抑制卵巢癌细胞的瘤体生成。
51.b.过表达tmem147-as1促进卵巢癌细胞的瘤体生成。
52.c.tmem147-as1敲低组的肿瘤体积的统计分析。
53.d.tmem147-as1过表达组的肿瘤体积的统计分析。
54.e.tmem147-as1敲低组的肿瘤重量的统计分析。
55.f.tmem147-as1过表达组的肿瘤重量的统计分析。
56.g.用苏木精和伊红溶液染色tmem147-as1敲低的肿瘤组织。ihc检测ki-67、aurka和ddx5的蛋白水平。原位杂交检测tmem147-as1的rna水平。
57.h.用苏木精和伊红溶液染色tmem147-as1过表达的肿瘤组织。ihc检测ki-67、aurka和ddx5的蛋白水平。原位杂交检测tmem147-as1的rna水平。
58.图6.“tmem147-as1抑制剂+vx-680+顺铂”联合用药方案能够抑制卵巢癌pdx模型的体内瘤体生成
59.图6包括图6a、图6b、图6c、图6d、图6e
60.a.在pdx模型中注射体内tmem147-as1抑制剂、vx680及顺铂的图示。
61.b.瘤内和腹膜内联合注射后21天的四组小鼠的肿瘤图像，包括sinc+0.9％生理盐水+cddp、sitmem147-as1+0.9％生理盐水+cddp、sinc+vx-680+cddp、50％sitmem147-as1+50％ vx-680+cddp。
62.c.每周测量两次肿瘤体积，并进行分析以构建生长曲线。
63.d.收集得到最终的肿瘤瘤体，并进行称重以统计瘤体重量。
64.e.用苏木精和伊红溶液染色pdx模型的肿瘤组织。ihc检测ki-67、aurka、ddx5、acc1和lc3b的蛋白水平。原位杂交检测tmem147-as1的rna水平。
具体实施方式
65.本发明首先筛选并确定长链非编码rna tmem147-as1是aurka下游信号通路中重要的调控分子，步骤包括：
66.1)根据前期研究中aurka在不同卵巢癌细胞系中的表达水平，构建aurka稳定过表达或敲低的卵巢癌细胞系。
67.2)然后收集相关稳转细胞并进行rna-seq二代测序，对测序结果进行分析并筛选出与aurka的表达呈正负相关性的lncrna。
68.3)利用qrt-pcr对所筛选lncrna的表达水平进行检测，并汇总rna-seq的分析结果确定最终的研究对象为tmem147-as1。
69.本发明还对tmem147-as1促进卵巢癌细胞增殖、g2/m细胞周期转换和顺铂抵抗的生物学功能进行研究，具体方法为：
70.1)根据tmem147-as1在不同卵巢癌细胞系中的表达水平，构建tmem147-as1稳定过表达或敲低的卵巢癌细胞系。
71.2)利用cell counting kit-8、克隆形成和balb/c裸鼠皮下瘤模型等体内外实验证明tmem147-as1对卵巢癌细胞增殖过程有重要的调节作用。
72.3)利用aurka抑制剂vx-680加药、流式细胞仪检测细胞周期等体外实验证明tmem147-as1对卵巢癌细胞g2/m期转换过程有重要的调节作用。
73.4)利用ic50、流式细胞仪检测细胞凋亡周期和顺铂注射balb/c裸鼠皮下瘤模型等体内外实验证明tmem147-as1能够调控卵巢癌细胞顺铂抵抗。
74.5)利用油红染色证明tmem147-as1能够促进卵巢癌细胞脂滴形成。
75.本发明对tmem147-as1抑制剂联合aurka抑制剂vx-680促进卵巢癌顺铂敏感的生物学功能进行研究，方法为：
76.构建卵巢癌pdx模型，并同时在pdx模型瘤内注射tmem147-as1抑制剂及腹腔内注射aurka抑制剂vx-680和顺铂，实验证明“tmem147-as1抑制剂+vx-680+顺铂”联合用药能够抑制卵巢癌在pdx模型中的生长。
77.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。这些实施例仅用于阐述本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实验条件或实验方法，通常按照常规条件——即“分子克隆”(molecular cloning:a laboratory manual,3rd ed.)中所描述的条件，或按照制造厂商所建议的条件实施。
78.实施例1：筛选并确定长链非编码rna tmem147-as1是aurka下游信号通路中重要的调控分子
79.1)aurka表达质粒及shrna质粒的构建与稳定转染
80.设计引物(f:5'-gctctagaatggaccgatctaaagaaaact-3'；r:5'-cgggatccctaagactgtttgctagctg-3')，并利用pcr扩增aurka的cdna，构建重组表达质粒
pcdh-puro-aurka。根据实验室已发表的文章，合成用于敲低aurka的shrna序列(f:
81.5'-ccgggtcttgtgtccttcaaattctcgagaatttgaaggacacaagacttt ttg-3'，r:
82.5'-aattcaaaaagtcttgtgtccttcaaattctcgagaatttgaaggacaca agac-3')并构建敲低质粒plko.1-puro-aurka。参考实验室在常见卵巢癌细胞中检测的aurka表达情况，分别在ovca-420和ovca-429中构建aurka过表达及敲低稳转细胞株。利用慢病毒包装系统转染并收集病毒液，随后感染相关细胞24h并换用含puromycin的培养液筛选。经western blot鉴定后确定所需稳转细胞系。
83.2)对aurka稳转细胞株进行rna-seq并进行qrt-pcr验证
84.成功构建aurka过表达及敲低稳转细胞株后，将细胞送至晶能生物技术(上海)有限公司进行rna-seq二代测序。在测序结果中对有变化的lncrna进行筛选，筛选标准为上升倍数fc＞1.2或下降倍数fc＜0.8且p＜0.05。设计引物并对筛选结果进行qrt-pcr验证，确定最终研究lncrna为tmem147-as1。
85.3)利用qrt-pcr及原位杂交检测tmem147-as1在常见卵巢癌细胞系及卵巢癌组织中的表达情况
86.收集实验室正常卵巢上皮细胞系hosepic和多种上皮性卵巢癌细胞系包括a2780、hey、skov3、ovca420、ovca429和ovca433，提取各细胞系的rna并反转录。
87.图2展示了tmem147-as1在上皮性卵巢癌细胞系及组织中呈现高表达趋势。其中，a.根据前期研究基础分别在ovca-420/ovca-429中构建aurka过表达/敲低稳转细胞系。b.通过对rna-seq结果分析并筛选出与aurka表达呈正负相关性的lncrna。c.筛选出的lncrna所对应的转录本长度及染色体定位。d.通过qrt-pcr验证并确定tmem147-as1与aurka表达呈正相关。e.正常卵巢上皮细胞系hosepic和人卵巢癌细胞系a2780、hey、skov3、ovca-420、ovca-429和ovca-433中tmem147-as1的表达情况。f.71例正常卵巢组织和60例上皮性卵巢癌组织中tmem147-as1的表达情况。g.tmem147-as1与上皮性卵巢癌总生存率的相关性。h.tmem147-as1与上皮性卵巢癌无进展存率的相关性。i.免疫组化检测aurka在4例正常卵巢组织和4例上皮性卵巢癌组织中的表达情况。j.原位杂交检测tmem147-as1在4例正常卵巢组织和4例上皮性卵巢癌组织中的表达情况。
88.通过qrt-pcr检测发现，以正常卵巢上皮细胞系hosepic为对照，tmem147-as1在多种上皮性卵巢癌细胞系呈现高表达趋势。同时，收集了40-50例正常卵巢以及40-50例上皮性卵巢癌的样本组织，提取rna并反转录。通过qrt-pcr检测确认，较正常卵巢组织而言，tmem147-as1在上皮性卵巢癌样本里呈现高表达趋势。为了进一步验证qrt-pcr的结果，拟设计tmem147-as1的特异性探针，通过原位杂交(in situ hybridization,ish)检测tmem147-as1在4例正常卵巢组织以及4例上皮性卵巢癌组织中的表达丰度。
89.实施例2：tmem147-as1促进卵巢癌细胞增殖、g2/m细胞周期转换和顺铂抵抗的生物学功能研究
90.1)tmem147-as1表达质粒及shrna质粒的构建与稳定转染
91.设计并合成用于敲低tmem147-as1的shrna序列(1.f:5'-ccgggggccagaacacgtggcttccctcgagggaagccacgtgttctggc cctttttg-3'，r:
92.5'-aattcaaaaagggccagaacacgtggcttccctcgagggaagccacgtgt tctggccc-3'；2.f:
93.5'-ccggggaacaggagtcagaacttagctcgagctaagttctgactcctgtt cctttttg-3'，r:
94.5'-aattcaaaaaggaacaggagtcagaacttagctcgagctaagttctgact cctgttcc-3'；3.f:
95.5'-ccgggcagcttcttgtcctcataccctcgagggtatgaggacaagaagct gctttttg-3'，r:
96.5'-aattcaaaaagcagcttcttgtcctcataccctcgagggtatgaggacaa gaagctgc-3')并构建敲低质粒plko.1-puro-tmem147-as1。tmem147-as1过表达质粒由苏州金唯智生物科技有限公司合成及构建成重组表达质粒pcdh-gfp-tmem147-as1，并经过测序鉴定。同时分别在hey及skov3中构建tmem147-as1过表达及敲低稳转细胞株。利用慢病毒包装系统转染并收集病毒液，随后用病毒液感染相关细胞24h。其中敲低细胞株换用含puromycin的培养液筛选。过表达细胞株则利用流式细胞仪进行gfp分选。经qrt-pcr鉴定后，筛选出所需稳转细胞系。
97.2)利用cck-8法检测tmem147-as1对细胞增殖的影响
98.正常消化细胞，计数。在96孔板中，加入1,500～2,000个细胞/孔，150μl细胞悬液/孔，24h，48h，72h，96h各检测一次，每次四个复孔。每次测时吸掉旧培养基，每孔加100μl检测工作液(5μl cck-8+95μl无血清培养基)，并在4个空白孔中只加检测工作液，作为空白对照。避光孵育2.5h。每孔吸出90μl检测液于干净的96孔酶标板中，上机检测od450值。
99.3)检测tmem147-as1对细胞克隆形成能力的影响
100.对数生长期细胞，用胰酶消化制成单细胞悬液，将500-600个细胞接种于6孔细胞培养板内，培养过夜。10-14d后用甲醇固定、结晶紫染色并计数细胞克隆数，确定tmem147-as1过表达及敲低对细胞克隆形成能力的影响。
101.4)利用cck-8法检测aurka抑制剂vx-680或顺铂处理后的ic50值
102.取对数生长期细胞，用胰酶消化制成单细胞悬液并计数。在96孔板中，加入10,000个细胞/孔，150μl细胞悬液/孔，每次四个复孔。vx-680组共设计9个浓度梯度，分别为：0nm、0.5nm、1nm、2nm、16nm、32nm、64nm、128nm、256nm；顺铂组共设计10个浓度梯度，分别为：0μm、0.0128μm、0.064μm、0.32μm、1.6μm、8μm、40μm、100μm、200μm、100μm，37℃孵育培养48小时进行检测。检测时吸掉旧培养基，每孔加100μl检测工作液(5μl cck-8+95μl无血清培养基)，并在4个空白孔中只加检测工作液，作为空白对照。避光孵育1.5h。每孔吸出90μl检测液于干净的96孔酶标板中，上机检测od450值。对所测得的od450值进行数据处理和曲线拟合，从而计算出最终的ic50值。
103.5)利用流式细胞仪检测tmem147-as1对细胞周期的影响
104.对细胞进行消化，并用等体积的细胞培养基混合。将混合的细胞悬液转移至15ml离心管中，在室温条件下800rpm离心5min，去除细胞上清液。用含10％ fbs的新鲜细胞培养基吹打细胞沉淀以获得均匀的细胞悬液，然后使用细胞计数仪对细胞总数进行测定。在6孔细胞培养板内接种细胞，接种量均为2
×
105个，接着于co2为5％、温度为37℃条件下进行静置培养。待细胞生长到合适密度后，对实验细胞进行周期同步化和10nm aurka抑制剂vx-680加药处理。常规消化细胞，室温条件下1000rpm、离心5min，去除上清。用1ml pbs重悬细胞，清洗两次。用0.3ml pbs对细胞进行重悬处理，接着将预冷的无水乙醇慢速滴加至细胞悬液内至终浓度达70％，然后颠倒细胞悬液，温和混匀，置于-20℃条件下固定过夜。次日每管滴加20μl fbs，有助于固定后细胞的沉淀，然后进行5min离心处理，温度、转速分别设定
为4℃、1000rpm，将上清舍弃，用温度为4℃的pbs对细胞进行1次洗涤处理，然后进行5min离心处理，温度与转速同上，将上清舍弃。各孔添加0.2ml rnase a(100ng/ml)，并在室温条件下静置消化20min。每孔加入200μl 2
×
pi溶液，使混合均匀，然后置于室温环境中进行15min遮光孵育处理。借助200目滤膜完成细胞的过滤，上机测定。
105.6)利用流式细胞仪检测顺铂处理后tmem147-as1对细胞凋亡的影响
106.对细胞进行消化处理，并等体积的细胞培养基混合。将混合的细胞悬液转移至15ml离心管中，在室温条件下800rpm离心5min，去除细胞上清液。用含10％ fbs的新鲜细胞培养基吹打细胞沉淀以获得均匀的细胞悬液，然后使用细胞计数仪对细胞总数进行测定。在6孔细胞培养板内接种细胞，接种量均为2
×
105个，接着于5％co2、37℃温度条件下进行静置培养。12h后根据ic50值加入顺铂至合适浓度，继续孵育培养48h。收集细胞上清液并常规消化细胞，室温条件下1000rpm、离心5min，去除上清。用1ml pbs重悬细胞，清洗一次。利用pi/annexin v-fitc或者7-aad/annexin v-apc凋亡试剂盒对收集细胞的凋亡情况进行流式细胞仪检测。
107.7)利用油红染色检测tmem147-as1对脂滴形成的影响
108.将适量细胞接种于细胞爬片上，在培养基中加入油酸共培养48h，并饥饿诱导24h。条件处理72h后，细胞固定并用油红染色，于显微镜下观察脂滴形成情况。
109.8)构建裸鼠皮下瘤模型
110.取对数生长期的tmem147-as1过表达及敲低稳转细胞株，经胰酶消化制成单细胞悬液，其中hey取3
×
106/0.1ml细胞以及skov3取5
×
106/0.1ml细胞，分别植瘤于5周雌性balb/c裸鼠皮下构建皮下瘤模型。注射后每周测量瘤体大小，在第六周后对balb/c裸鼠处死，切除瘤体称重。部分瘤体组织通过组织液氮研磨、rna提取和反转录，并经qrt-pcr检测tmem147-as1，let-7b-5p和let-7c-5p的表达情况。剩余瘤体储存在液氮中用于后续的western blot、原位杂交及免疫组化实验。
111.图3展示了敲低tmem147-as1能够抑制上皮性卵巢癌细胞增殖及g2/m细胞周期转换。a.qrt-pcr检测tmem147-as1敲低稳转细胞系中tmem147-as1的表达水平变化。b.cck-8实验确认敲低tmem147-as1能够抑制上皮性卵巢癌细胞增殖。c.qrt-pcr检测tmem147-as1过表达稳转细胞系中tmem147-as1的表达水平变化。d.cck-8实验确认过表达tmem147-as1能够促进上皮性卵巢癌细胞增殖。e&f.克隆形成实验确认敲低tmem147-as1能够抑制上皮性卵巢癌细胞成克隆能力。g&h.克隆形成实验确认过表达tmem147-as1能够促进上皮性卵巢癌细胞成克隆能力。i.过表达tmem147-as1能够上调vx-680在卵巢癌中的ic50值。j&k.过表达tmem147-as1能够回复vx-680对于g2/m期的阻滞作用。
112.图4展示了tmem147-as1能够诱导脂滴形成及脂噬发生以促进上皮性卵巢癌顺铂抵抗。a.敲低tmem147-as1能够下调顺铂在卵巢癌中的ic50值。b.过表达tmem147-as1能够上调顺铂在卵巢癌中的ic50值。c&e.敲低tmem147-as1能够促进卵巢癌中经顺铂处理后的凋亡率。d&f.过表达tmem147-as1能够抑制卵巢癌中经顺铂处理后的凋亡率。g.tmem147-as1能够诱导卵巢癌细胞中的脂滴形成。h.tmem147-as1能够介导卵巢癌细胞的脂噬发生以抵抗顺铂处理。
113.图5展示了tmem147-as1通过激活aurka/ddx5在体内驱动卵巢癌的肿瘤生长。a.敲低tmem147-as1抑制卵巢癌细胞的瘤体生成。b.过表达tmem147-as1促进卵巢癌细胞的瘤体
生成。c.tmem147-as1敲低组的肿瘤体积的统计分析。d.tmem147-as1过表达组的肿瘤体积的统计分析。e.tmem147-as1敲低组的肿瘤重量的统计分析。f.tmem147-as1过表达组的肿瘤重量的统计分析。g.用苏木精和伊红溶液染色tmem147-as1敲低的肿瘤组织。ihc检测ki-67、aurka和ddx5的蛋白水平。原位杂交检测tmem147-as1的rna水平。h.用苏木精和伊红溶液染色tmem147-as1过表达的肿瘤组织。ihc检测ki-67、aurka和ddx5的蛋白水平。原位杂交检测tmem147-as1的rna水平。
114.实施例3：构建卵巢癌pdx模型进行“tmem147-as1抑制剂+vx-680+顺铂”联合用药方案
115.取新鲜的卵巢癌组织植瘤于5周雌性balb/c裸鼠皮下构建皮下瘤模型。成瘤之后(约4-6周)，对balb/c裸鼠处死并切下瘤体，并将瘤体切块取同等大小体积。切块后的瘤体经无菌pbs清洗后，种植于新的一批5周雌性裸鼠皮下。种植后每周测量瘤体大小，持续时间2-3周。之后，将同一组内的balb/c裸鼠双盲分成四组给药，分别包括sinc+0.9％生理盐水+cddp、sitmem147-as1+0.9％生理盐水+cddp、sinc+vx-680+cddp、50％sitmem147-as1+50％ vx-680+cddp。根据瘤体生长速度持续3-4周，每三天测量瘤体大小。实验结束后对balb/c裸鼠处死，切除瘤体称重。部分瘤体组织通过组织液氮研磨、rna提取和反转录，并经qrt-pcr检测tmem147-as1，let-7b-5p和let-7c-5p的表达情况。剩余瘤体储存在液氮中用于后续的western blot、原位杂交及免疫组化实验。
116.图6展示了“tmem147-as1抑制剂+vx-680+顺铂”联合用药方案能够抑制卵巢癌pdx模型的体内瘤体生成。a.在pdx模型中注射体内tmem147-as1抑制剂、vx680及顺铂的图示。b.瘤内和腹膜内联合注射后21天的四组小鼠的肿瘤图像，包括sinc+0.9％生理盐水+cddp、sitmem147-as1+0.9％生理盐水+cddp、sinc+vx-680+cddp、50％sitmem147-as1+50％ vx-680+cddp。c.每周测量两次肿瘤体积，并进行分析以构建生长曲线。d.收集得到最终的肿瘤瘤体，并进行称重以统计瘤体重量。e.用苏木精和伊红溶液染色pdx模型的肿瘤组织。ihc检测ki-67、aurka、ddx5、acc1和lc3b的蛋白水平。原位杂交检测tmem147-as1的rna水平。
117.上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种靶向tmem147-as1的tmem147-as1抑制剂，其特征在于，其序列为gcagcuucuuguccucaua dtdt，dtdt表示3'悬垂，所述tmem147-as1抑制剂经甲基化和胆固醇修饰后，在卵巢癌人源肿瘤异种移植模型中能够特异性抑制tmem147-as1表达。2.tmem147-as1抑制剂作为制备治疗卵巢癌联合靶向药物的应用，其特征在于，所述tmem147-as1抑制剂序列为gcagcuucuuguccucaua dtdt。3.tmem147-as1抑制剂作为制备治疗卵巢癌联合靶向药物的应用，其特征在于，所述tmem147-as1抑制剂在制备抑制aurka/ddx5蛋白的表达，以抑制卵巢癌的肿瘤生长的药物中的应用。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述tmem147-as1抑制剂在制备阻滞hey和skov3细胞的细胞增殖的药物中的应用。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述tmem147-as1抑制剂在制备抑制卵巢癌细胞g2/m细胞周期转换的药物中的应用。6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述tmem147-as1抑制剂在制备阻滞hey和skov3细胞的脂滴形成的药物中的应用。7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述tmem147-as1抑制剂在制备抑制hey和skov3细胞的脂噬以促进卵巢癌顺铂敏感的药物中的应用。8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述tmem147-as1抑制剂和aurka抑制剂vx-680在制备用以促进卵巢癌顺铂敏感的联合用药中的应用。9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述tmem147-as1抑制剂在制备非小细胞肺癌的药物中的应用。10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述tmem147-as1抑制剂和aurka抑制剂vx-680以及顺铂在制备抑制卵巢癌生长的联合用药中的应用。

技术总结
本发明涉及lncRNA及蛋白技术领域，尤其是涉及一种TMEM147-AS1抑制剂作为制备治疗卵巢癌联合靶向药物的应用。TMEM147-AS1抑制剂，其特征在于，其序列为GCAGCUUCUUGUCCUCAUA dTdT，所述TMEM147-AS1抑制剂经甲基化和胆固醇修饰后，在卵巢癌人源肿瘤异种移植模型中能够特异性抑制TMEM147-AS1表达。与现有技术相比，本发明研究TMEM147-AS1在人正常卵巢和卵巢癌组织中的表达差异，发现TMEM147-AS1在人类卵巢癌组织及细胞系中特异性高表达，因此，本发明提出TMEM147-AS1可作为潜在的药物靶点用于卵巢癌的联合用药，进而提供TMEM147-AS1抑制剂作为制备治疗卵巢癌联合靶向药物的应用，为卵巢癌的治疗提供了重要的实验依据和应用指导。用指导。用指导。


技术研发人员：邵杨 吴勇 李艳利 夏玲芳 曹思宇 潘维
受保护的技术使用者：上海大学
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/8/4