一种抗人CysC单克隆抗体及其在制备用于检测人CysC含量的试剂盒中的用途的制作方法

一种抗人cysc单克隆抗体及其在制备用于检测人cysc含量的试剂盒中的用途
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种抗人cysc单克隆抗体及其在制备用于检测人cysc含量的试剂盒中的用途。


背景技术：

2.血清胱抑素c(cystatin c，简称cysc)亦称半胱氨酸蛋白酶抑制剂c，是一种由120个氨基酸组成，分子量为13kda的低分子量、碱性非糖化蛋白质。cysc基因在包括肾、肝、胰、肠、胃、肺及胎盘等所有组织中持续地转录和表达。
3.cysc蛋白具有产生率及释放入血速率恒定，能自由通过肾小球滤过，在近曲小管全部重吸收并迅速代谢分解，不和其他蛋白形成复合物等特点。其血清浓度变化不受炎症、感染、肿瘤及肝功能等因素的影响，与性别、饮食、体表面积、肌肉量无关，是一种反映gfr变化的理想的内源性标志物。
4.目前检测人血清中cysc含量主要是采用胶乳比浊法，需要使用多克隆抗体来制备检测试剂，以兔多克隆抗体为主。但是多克隆抗体主要来源于免疫后的动物血清，因此抗体的质量容易受到动物状态，免疫工艺，免疫抗原以及佐剂等影响，具有难以控制的批间差。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种抗人cysc单克隆抗体及其在制备用于检测人cysc含量的试剂盒中的用途。为了消除现有技术中采用多克隆抗体制备检测试剂产生的批间差，本发明采用一种抗人cysc单克隆抗体与抗人cysc多克隆抗体混合物来制备胶乳比浊试剂盒。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.一方面，本发明提供了一种抗人cysc单克隆抗体，包含重链和轻链，其中重链可变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq id no.1-3所示，轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq id no.4-6所示。
8.所述的一种抗人cysc单克隆抗体，所述重链和轻链的氨基酸序列如seq id no.7-8所示，所述重链和轻链的核苷酸序列如seq id no.9-10所示。
9.第二方面，本发明提供了所述的抗人cysc单克隆抗体在制备用于检测人cysc含量的试剂盒中的用途。
10.所述的抗人cysc单克隆抗体与多克隆抗体的混合物在制备用于检测人cysc含量的试剂盒中的用途。
11.第三方面，本发明提供了一种用于检测人cysc含量的试剂盒，包含所述的抗人cysc单克隆抗体。
12.所述的用于检测人cysc含量的试剂盒，其特征在于，还包含抗人cysc多克隆抗体。
13.所述的一种用于检测人cysc含量的试剂盒，所述试剂盒为胶乳比浊试剂盒。
14.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
15.本发明采用抗人cysc单克隆抗体用于胶乳比浊法检测样品中人cysc含量，本发明保护的抗人cysc单克隆抗体包含氨基酸序列如seq id no.1-6所示的序列，能够消除采用多克隆抗体制备检测试剂时产生的批间差，并具有基本一致的稳定性等性能，可以与多克隆抗体混合使用，用于胶乳比浊法对人临床样品进行人cysc的临床检测。
附图说明
16.图1为纯多抗组与单抗+多抗组试剂的临床相关性结果。
具体实施方式
17.以下将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
18.实施例1：
19.1、抗人cysc单克隆抗体的制备和纯化
20.(1)免疫动物
21.一般使用6-8周龄雌性balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方法进行三次免疫注射。
22.第一次免疫用2ml注射器每只小鼠腹股沟皮下注射0.2ml乳化液(100ul重组cysc蛋白(贵州鸬鹚生物技术有限公司购买，用1
×
pbs稀释)+100ul弗氏完全佐剂，含100ug抗原)。
23.第二次免疫间隔两周，用2ml注射器每只小鼠腹腔注射0.2ml乳化液(100ul重组cysc蛋白(用1
×
pbs稀释)+100ul弗氏不完全佐剂，含100ug抗原)。
24.第三次免疫间隔两周，用2ml注射器每只小鼠腹股沟皮下注射注射0.2ml乳化液(100ul重组cysc蛋白(用1
×
pbs稀释)+100ul弗氏不完全佐剂，含100ug抗原)。
25.测试elisa效价根据融合时间安排，第三次免疫7-10天后取血检测，用常规的间接elisa法检测效价，选择效价达到1:10万的小鼠用于融合。
26.加强免疫融合前3天，向待取脾小鼠进行加强免疫，小鼠腹腔注射200ul液体(含60ug抗原，溶剂为1
×
pbs，ph7.4)。
27.(2)细胞融合
28.采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，放入带200目不锈钢网的平皿中研磨，制备细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞sp2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合(1:5-1:10)，并加入促融合剂聚乙二醇(50％)。采用hat选择培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。
29.用elisa方法检测杂交瘤细胞培养上清：将抗原用包被液(ph 9.6、0.05m碳酸盐缓冲液)稀释为2ug/ml加入96孔酶标板中，100ul/孔，放入4℃冰柜中包被过夜。弃去包被液，用pbst(磷酸盐缓冲液，ph7.4)洗板三次，加入封闭液3％bsa-pbst(加入3％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)，200ul/孔，37℃孵育1小时。弃去封闭液，pbst(磷酸盐缓冲液，ph7.4)洗板一次，甩干板子。将杂交瘤细胞培养上清加入酶标板100ul/well，同时加入pbst(磷酸盐缓冲液)作为阴性对照。37℃孵育1小时。弃上清，用洗板机pbst洗板三次，加入稀释好的anti-mouse igg/hrp，100ul/well，37℃孵育1小时。弃上清，用洗板机pbst洗板三次，加底物tmb100ul/well，rt，避光37℃，10-15min后加入50ul终止液(2mol/l硫酸)。使用酶标仪测
定，酶标仪设置为：450nm比色。和阴性对照相比，如果是od值2.5倍之上就是阳性。选择阳性克隆株进行细胞克隆化筛选，经过三至四轮的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100％即为稳定细胞株，最后筛选得到一株效价最好的抗人cysc的杂交瘤细胞株，命名为lc01，随后进一步对上述杂交瘤细胞株送测序公司进行抗体基因序列测序分析。
30.经上述步骤获得的抗人cysc单克隆抗体lc01，包含重链和轻链，其中重链可变区cdr1的氨基酸序列如seq id no.1所示(tsywih)、cdr2的氨基酸序列如seq id no.2所示(tiypgnndttynqkfkg)，和cdr3的氨基酸序列如seq id no.3所示(gnfyw)，轻链可变区cdr1的氨基酸序列如seq id no.4所示(hasqninvwls)、cdr2的氨基酸序列如seq id no.5所示(qasnlht)，和cdr3的氨基酸序列如seq id no.6所示(qqgrsyplt)。
31.将lc01抗体重链和轻链基因序列构建入pcdna
tm
3.4 topo
tm
ta(invitrogen
tm
)，然后采用pei瞬时转染expi293f细胞表达lc01抗体。转染后在37℃，8％二氧化碳，120rpm条件下培养7天，3500rpm离心收集上清，采用protein a亲和纯化获得抗体lc01，抗体经过浓缩后浓度定到10mg/ml。
32.实施例2：
33.抗人cysc单克隆抗体用于胶乳比浊试剂的制备：
34.1、取100纳米微球(贵州鸬鹚生物技术有限公司)0.4ml，用活化缓冲液稀释，37℃预热，并快速搅拌。
35.2、称取20μg edc，溶于1ml活化缓冲液
36.3、将活化剂0.06ml加入不断搅拌的微球溶液中，37度孵育30min。
37.4、同时配制偶联抗体：
38.单抗+多抗组：取300μg单抗与300μg兔多克隆抗体(贵州鸬鹚生物技术有限公司)混合，加入2ml包被缓冲液稀释待用。
39.纯多抗组：取600μg兔多克隆抗体(贵州鸬鹚生物技术有限公司)，加入2ml包被缓冲液活化完成后，在微球溶液中加入6ml包被缓冲液，并快速搅拌，然后缓慢滴入混合好的抗体溶液。
40.5、抗体滴加完后，继续在37度搅拌2小时。加入封闭剂和稳定剂，充分搅拌混匀，即可上机检测。
41.r1的主要成分为：4-羟乙基哌嗪乙磺酸，聚乙二醇-8000
42.仪器：日立7170生化分析仪
43.测试波长：800/570nm
44.测试方法：终点法。在37℃下，r1与待测样本混合5分钟，测量a1，然后加入不同的r2，开始反应10s后测量a1。体积比r1:样品:r2＝125:2:25。反应5分钟后测量a2。
△
a＝a2-a1。
45.生化仪测试校准曲线以及37度热加速稳定性，如下表1。
46.表137度热加速稳定性数据
[0047][0048]
如上表1所示，单抗+多抗组的胶乳比浊试剂性能与纯多抗组基本一致，稳定性也达到要求，与多抗一致。
[0049]
对两种试剂进行临床比对测试。测试结果如图1所示，表明了纯多抗组与单抗+多抗组试剂的临床相关性一致，r2＝0.9979。验证获得结果单抗+多抗组可以完全替代纯多抗组用于临床测试。

技术特征：
1.一种抗人cysc单克隆抗体，其特征在于，包含重链和轻链，其中重链可变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq id no.1-3所示，轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq id no.4-6所示。2.如权利要求1所述的一种抗人cysc单克隆抗体，其特征在于，所述重链和轻链的氨基酸序列如seq id no.7-8所示，所述重链和轻链的核苷酸序列如seq id no.9-10所示。3.如权利要求1或2所述的抗人cysc单克隆抗体在制备用于检测人cysc含量的试剂盒中的用途。4.如权利要求1或2所述的抗人cysc单克隆抗体与多克隆抗体的混合物在制备用于检测人cysc含量的试剂盒中的用途。5.一种用于检测人cysc含量的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的抗人cysc单克隆抗体。6.如权利要求5所述的用于检测人cysc含量的试剂盒，其特征在于，还包含抗人cysc多克隆抗体。7.如权利要求5或6所述用于检测人cysc含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为胶乳比浊试剂盒。

技术总结
一种抗人CysC单克隆抗体及其在制备用于检测人CysC含量的试剂盒中的用途，属于生物医学技术领域。本发明抗CysC单克隆抗体包含重链和轻链，其中重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示。本发明采用抗人CysC单克隆抗体用于胶乳比浊法检测样品中人CysC含量，抗人CysC单克隆抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1-6所示的序列，能够消除产生的批间差，并具有基本一致的稳定性等性能，可以与多克隆抗体混合使用，用于胶乳比浊法对人临床样品进行人CysC的临床检测。床检测。床检测。


技术研发人员：邱俊康 邓超
受保护的技术使用者：贵州鸬鹚生物技术有限公司
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/8/4