一种构建高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌的方法及生产γ-氨基丁酸的方法

一种构建高产
γ-氨基丁酸重组大肠杆菌的方法及生产
γ-氨基丁酸的方法
技术领域
1.本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种构建高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌的方法及生产γ-氨基丁酸的方法。


背景技术：

2.γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，gaba）是自然界普遍存在的一种四碳非蛋白质氨基酸，在微生物、植物及生物体内均具有多种生理功能。在微生物中，γ-氨基丁酸的生成过程与菌体的耐酸机制直接相关。大多真核微生物细胞内的γ-氨基丁酸可促进孢子生长。在植物中，γ-氨基丁酸能诱导生物体中乙烯的合成或调节胞内ph的平衡，同时可防止植物体受到氧化胁迫或渗透压等外界环境的影响。在动物体内，由于γ-氨基丁酸所表现出的调节血压与心率、促进生长激素分泌、保肝利肾、改善机体的脂质代谢、减缓血管动脉硬化、抑制癌细胞生长和促进生殖等多种生理功能而在医药领域受到了越来越广泛的关注。此外，γ-氨基丁酸还具有减少活动量、促进动物生长的功能，使其可作为一种新型饲料添加剂应用于畜牧业。
3.目前，工业上制备γ-氨基丁酸主要包括化学合成法和微生物合成法。化学合成法虽反应迅速、产量高，但其反应条件苛刻、反应剧烈、副产物多等缺陷。随着生物技术的发展，成本低、工艺环保、绿色安全、生产效率高的生物合成法得到了应用。目前，微生物合成法所用菌株主要包括大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和乳酸菌等。这其中，由于大肠杆菌所具有的生长迅速、培养简单且成本低等优势，且仅在细胞内过表达谷氨酸脱羧酶就能够高效快速地直接将l-谷氨酸转化生成γ-氨基丁酸，目前已被应用于实际生产中。但是利用大肠杆菌细胞进行γ-氨基丁酸生产的效率有待进一步提高，且大肠杆菌内源合成的吡哆醛5
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磷酸浓度较低，不能满足谷氨酸脱羧酶发挥高催化活性进而实现γ-氨基丁酸高效合成的需要。因此，该生产过程中需要外源添加昂贵的吡哆醛5
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磷酸，提高了该方法的工业生产成本。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供构建高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌工程菌的方法。
5.本发明的再一目的是提供以l-谷氨酸和l-谷氨酸钠混合物为底物生产γ-氨基丁酸的方法。
6.根据本发明构建高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌工程菌的方法，包括以下步骤：在大肠杆菌菌株中利用诱导型启动子异源表达芽孢杆菌z11来源的谷氨酸脱羧酶的编码基因，构建具有γ-氨基丁酸合成能力的突变型大肠杆菌底盘细胞；在获得的具有γ-氨基丁酸合成能力的突变型大肠杆菌底盘细胞中，利用诱导型启动子分别对枯草芽孢杆菌168来源的吡哆醛5
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磷酸合酶编码基因和谷氨酰胺氨基转移酶编码基因进行异源表达，构建内源吡哆醛5
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磷酸合成途径，获得高效生产γ-氨基丁酸
的重组大肠杆菌工程菌。
7.根据本发明构建高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌工程菌的方法，其中，所述诱导型启动子为t7启动子。
8.根据本发明的全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法，包括如下步骤：通过摇瓶培养并诱导上述大肠杆菌工程菌株中的外源谷氨酸脱羧酶表达和吡哆醛5
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磷酸的合成；利用所获得的大肠杆菌工程菌株进行全细胞转化l-谷氨酸和l-谷氨酸钠混合物生产γ-氨基丁酸。
9.根据本发明的全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法，其中，利用lb培养基进行大肠杆菌工程菌的摇瓶诱导。
10.根据本发明的全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法，其中，lb培养基配方为：胰蛋白胨10 g/l，酵母浸粉5 g/l，nacl10 g/l。
11.根据本发明的全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法，摇瓶诱导时间为37℃，转速为220 rpm，诱导剂iptg浓度为0.1 mm。
12.根据本发明的全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法，其中，所述lb培养基中添加氨苄青霉素终浓度为100 μg/l。
13.根据本发明的全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法，其中，所述lb培养基中添加异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg）终浓度为0.1 mm。
14.根据本发明的全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法，其中，所述全细胞转化条件为温度37℃，转速120 rpm。
15.根据本发明的生产γ-氨基丁酸的方法，其中，所述全细胞转化底物为在纯水体系中添加浓度为0.6 m l-谷氨酸和0.4 m l-谷氨酸钠的混合物。
16.本技术的技术方案的优点：1. 本发明通过在大肠杆菌中异源表达芽孢杆菌z11来源的谷氨酸脱羧酶编码基因构建了一株能够进行γ-氨基丁酸生产的大肠杆菌工程菌株。为消除大肠杆菌工程菌在转化底物生产γ-氨基丁酸的过程中对外源昂贵辅因子吡哆醛5
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磷酸的依赖，通过对基因来源、基因组合及表达调控方式进行筛选，在上述大肠杆菌工程菌株中构建了内源吡哆醛5
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磷酸的合成途径。该途径的构建不但能够完全供给谷氨酸脱羧酶的辅酶需求，而且大幅提升了产物的转化效率。
17.2. 本发明菌株的培养诱导均可在37℃条件下进行，诱导时间为6 h，诱导剂iptg浓度为0.1 mm。所获得的大肠杆菌细胞（od
600
≈15）可在0.5 h内可将0.6 m l-谷氨酸和0.4 m l-谷氨酸钠的混合物完全转化生成约1 m的γ-氨基丁酸。同批次菌体细胞可重复使用7次且转化率均在96%以上，即在4 h内可将4.8 m l-谷氨酸和3.2 m l-谷氨酸钠转化生成γ-氨基丁酸，生产速率可达205 g/l/h。
附图说明
18.图1显示诱导条件对重组大肠杆菌合成γ-氨基丁酸的影响；图2显示基因来源及表达调控方式对吡哆醛5
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磷酸合成的影响；图3显示基因组合方式对自供给吡哆醛5
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磷酸菌株合成γ-氨基丁酸的影响；
图4显示重组大肠杆菌高效合成γ-氨基丁酸条件的优化；图5显示重组大肠杆菌菌体重复使用批次的探究。
实施方式
19.下述实施例中所使用的菌株为大肠杆菌bl21(de3)宿主菌株，质粒载体为pet-28a(+)、petdute-1和pacyadute-1。所使用的限制酶类及其它生化试剂均为生化试剂公司购买获得。未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
20.根据本发明的具体实施方式，在大肠杆菌菌株中利用诱导型启动子异源表达芽孢杆菌z11来源的谷氨酸脱羧酶的编码基因，构建具有γ-氨基丁酸合成能力的突变型大肠杆菌底盘细胞；在获得的具有γ-氨基丁酸合成能力的突变型大肠杆菌底盘细胞中，利用诱导型启动子分别对枯草芽孢杆菌168来源的吡哆醛5
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磷酸合酶编码基因和谷氨酰胺氨基转移酶编码基因进行异源表达，构建内源吡哆醛5
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磷酸合成途径，获得高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌工程菌。
21.在以下实施例中，所述芽孢杆菌z11来源的谷氨酸脱羧酶的编码基因为genbank所公开的gadz11基因，登录号为genbank id：mw703456.1；所述枯草芽孢杆菌168来源的吡哆醛5
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磷酸合酶编码基因为genbank所公开的pdxs，其核苷酸序列登录号为genbank id：939988；所述谷氨酰胺氨基转移酶编码基因为genbank所公开的pdxt，其核苷酸序列登录号为genbank id：939971。
22.本技术中所用到的质粒载体如表1所示，大肠杆菌bl21(de3)工程菌株如表2所示：表1
质粒名称性状pet28a-gadz11利用pet-28a(+)在t7启动子控制下表达gadz11petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt利用petdute-1载体分别在两个t7启动子控制下表达pdxs和pdxtpetdute-1-t7-pdxs/pdxt利用petdute-1载体中的一个t7启动子控制下表达pdxs和pdxtpetdute-1-t7-pdxs利用petdute-1载体在t7启动子控制下表达pdxspacycdute-1-t7-pdxt利用pacycdute-1载体在t7启动子控制下表达pdxtpetdute-1-j-pdxs-j-pdxt利用petdute-1载体分别在两个j23100启动子控制下表达pdxs和pdxtpetdute-1-j-pdxs/pdxt利用petdute-1载体在一个j23100启动子控制下表达pdxs和pdxtpetdute-1-j-pdxs利用petdute-1载体在j23100启动子控制下表达pdxspacycdute-1-j-pdxt利用pacycdute-1载体在j23100启动子控制下表达pdxtpetdute-1-t7-sno1-t7-snz1利用petdute-1载体分别在两个t7启动子控制下表达sno1和snz1petdute-1-t7-sno1/snz1利用petdute-1载体中的一个t7启动子控制下表达sno1和snz1petdute-1-t7-sno1利用petdute-1载体在t7启动子控制下表达sno1pacycdute-1-t7-snz1利用pacycdute-1载体在t7启动子控制下表达snz1petdute-1-j-sno1/snz1利用petdute-1载体在一个j23100启动子控制下表达sno1和snz1petdute-1-j-sno1利用petdute-1载体在j23100启动子控制下表达sno1pacycdute-1-j-snz1利用pacycdute-1载体在j23100启动子控制下表达snz1pcdfdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt利用pcdfdute-1载体分别在两个t7启动子控制下表达pdxs和pdxtpetdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt-t7-gadz11利用petdute-1载体分别在三个t7启动子控制下表达pdxs、pdxt和gadz11petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt-rbs-gadz11利用petdute-1载体分别在两个t7启动子控制下表达pdxs、pdxt和gadz11
23.表2
菌株名称性状e.colibl21(de3)大肠杆菌bl21(de3)菌株
ec-0携带质粒petdute-1的大肠杆菌菌株ec-1携带质粒pet28a-gadz11进行gadz11基因表达的菌株ec-2携带质粒petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt进行吡哆醛5
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磷酸合成的菌株ec-3携带质粒petdute-1-t7-pdxs/pdxt进行吡哆醛5
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磷酸合成的菌株ec-4携带质粒petdute-1-t7-pdxs和pacycdute-1-t7-pdxt进行吡哆醛5
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磷酸合成的菌株ec-5携带质粒petdute-1-j-pdxs-j-pdxt进行吡哆醛5
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磷酸合成的菌株ec-6携带质粒petdute-1-j-pdxs/pdxt进行吡哆醛5
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磷酸合成的菌株ec-7携带质粒petdute-1-j-pdxs和pacycdute-1-j-pdxt进行吡哆醛5
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磷酸合成的菌株ec-8携带质粒petdute-1-t7-sno1-t7-snz1进行吡哆醛5
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磷酸合成的菌株ec-9携带质粒petdute-1-t7-sno1/snz1进行吡哆醛5
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磷酸合成的菌株ec-10携带质粒petdute-1-t7-sno1和pacycdute-1-t7-snz1进行吡哆醛5
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磷酸合成的菌株ec-11携带质粒petdute-1-j-sno1/snz1进行吡哆醛5
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磷酸合成的菌株ec-12携带质粒petdute-1-j-sno1和/pacycdute-1-j-snz1进行吡哆醛5
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磷酸合成的菌株ec-13携带质粒pet28a-gadz11和pcdfdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt能够利用内源合成的吡哆醛5
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磷酸酸进行γ-氨基丁酸生产的菌株ec-14携带质粒petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt-t7-gadz11能够利用内源合成的吡哆醛5
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磷酸进行γ-氨基丁酸生产的菌株ec-15携带质粒petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt-rbs-gadz11能够利用内源合成的吡哆醛5
’‑
磷酸进行γ-氨基丁酸生产的菌株
。
24.1. pet28a-gadz11载体的构建使用细菌基因组dna提取试剂盒，提取芽孢杆菌z11基因组dna。根据谷氨酸脱羧酶的编码基因gadz11的基因序列设计合成引物，以上述基因组dna为模板扩增gadz11基因片段，大小为1525 bp。将获得的片段使用gibson assembly连接方式连接至至质粒pet-28a(+)的ecori/noti位点。将质粒化学转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（卡那霉素50
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后通过菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为pet28a-gadz11。
25.2. 重组大肠杆菌ec-1的构建将重组质粒pet28a-gadz11利用热激转化法转入大肠杆菌bl21(de3)中得到大肠杆菌工程菌ec-1。
26.3. 重组大肠杆菌ec-1的培养及谷氨酸脱羧酶gadz11的诱导条件优化将ec-1以接种量1
‰
接种至50 ml的lb培养基中（卡那霉素50
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g/ml），于37℃，220 rpm下摇床培养过夜。将获得的菌液以2％的接种量接种至300 ml lb培养基中（卡那霉素50
ꢀµ
g/ml），于摇床中37℃，220 rpm培养约3 h至od
600
≈0.6。
27.（1）诱导温度对重组大肠杆菌基因工程菌合成γ-氨基丁酸的影响向培养至od
600
≈0.6的菌液中加入终浓度1 mm iptg，于不同的诱导温度下（16、20、25、30、37℃），200 rpm摇床中诱导16 h。12000 rpm离心5 min收集菌体。将获得的菌体用纯水清洗两次后将菌体转移至50 ml离心管中，加水20 ml重悬，使菌液浓度od
600
≈20并加入终浓度为0.1 mm的吡哆醛5
’‑
磷酸。称取2.94 g l-谷氨酸（在反应体系中的终浓度为1 m）加入100 ml锥形瓶中，将上述离心管中的20 ml菌液加入锥形瓶中启动产物合成反应。分别在反应0.5和1 h取500 μl反应液加500 μl 80%乙醇终止反应，12000 rpm离心3 min取上清适度稀释后进行hplc检测。检测结果如图1的（a）所示。结果表明，低温诱导有利于谷氨酸脱羧酶的表达，当诱导温度为16℃时，转化反应进行1 h后体系中γ-氨基丁酸的产量为1.2 m，即此时体系中的l-谷氨酸已经得到了完全转化。当诱导温度升高至20、25和30℃时，反应1 h后底物的转化率以此增加，最高为98.6%，略低于16℃诱导后的菌体的产物转化率。但当诱导温度为37℃时，转化反应进行1 h后体系中γ-氨基丁酸的产量为1.1 m，即此时体系中的l-谷氨酸理论上也已得到了完全转化。这可能是由于在大肠杆菌的最适生长温度下（37
℃），谷氨酸脱羧酶的表达量得到了提升。在实际生产中，37℃易于实现且能够获得更多的菌体用于产物的生产。因此，最终选择37℃作为诱导温度。
28.（2）菌株诱导时间对重组大肠杆菌基因工程菌合成γ-氨基丁酸的影响向培养至od
600
≈0.6的菌液中加入终浓度1 mm iptg，于37℃，200 rpm摇床中诱导不同时间（2、4、6、10、16 h）。12000 rpm离心5 min收集菌体。将获得的菌体用纯水清洗两次后将菌体转移至50 ml离心管中，加水20 ml重悬，使菌液浓度od
600
≈20并加入终浓度为0.1 mm的吡哆醛5
’‑
磷酸。称取2.94 g l-谷氨酸（在反应体系中的终浓度为1 m）加入100 ml锥形瓶中，将上述离心管中的20 ml菌液加入锥形瓶中启动产物合成反应。分别在反应0.5和1 h取500 μl反应液加500 μl 80%乙醇终止反应，12000 rpm离心3 min取上清适度稀释后利用hplc进行检测，检测结果如图1的（b）所示。结果表明，当诱导时间在2-6 h范围内时γ-氨基丁酸的产量随时间的延长而增加。当诱导时间为6 h，转化反应1 h后γ-氨基丁酸的产量达到1.05 m，即此时底物已反应完全。因此，诱导时间选取为6 h。
29.（3）诱导物浓度对重组大肠杆菌基因工程菌合成γ-氨基丁酸的影响向培养至od
600
≈0.6的菌液中加入终浓度0.1、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mm iptg，于37℃，200 rpm摇床中诱导6 h。12000 rpm离心5 min收集菌体。将获得的菌体用纯水清洗两次后将菌体转移至50 ml离心管中，加水20 ml重悬，使菌液浓度od
600
≈20并加入终浓度为0.1 mm的吡哆醛5
’‑
磷酸。称取2.94 g l-谷氨酸（在反应体系中的终浓度为1 m）加入100 ml锥形瓶中，将上述离心管中的20 ml菌液加入锥形瓶中启动产物合成反应。分别在反应0.5和1 h取500 μl反应液加500 μl 80%乙醇终止反应，12000 rpm离心3 min取上清适度稀释后利用hplc进行检测，检测结果如图1的（c）所示。结果表明，不同诱导物浓度对γ-氨基丁酸的产量并没有明显影响且低浓度iptg（0.1 mm）即可达到诱导目的。
30.4. 重组大肠杆菌ec-1在最佳条件下合成γ-氨基丁酸分别向培养至od
600
≈0.6的菌液中加入终浓度0.1和1.0的iptg，并分别于37和16℃，220 rpm摇床中诱导6和16 h。12000 rpm离心5 min收集菌体。将获得的菌体用纯水清洗两次后将菌体转移至50 ml离心管中，加水20 ml重悬，使菌液浓度od
600
≈20并加入终浓度为0.1 mm的吡哆醛5
’‑
磷酸。称取2.94 g l-谷氨酸（在反应体系中的终浓度为1 m）加入100 ml锥形瓶中，将上述离心管中的20 ml菌液加入锥形瓶中启动产物合成反应。分别在反应0.5和1 h取500 μl反应液加500 μl 80%乙醇终止反应，12000 rpm离心3 min取上清适度稀释后利用hplc进行检测，检测结果如图1的（d）所示。结果表明，在上述两种条件下获得的细胞在转化l-谷氨酸生产γ-氨基丁酸时的产物产量均无明显差异。在转化反应进行1 h后，底物均被完全转化，生成了1 m的γ-氨基丁酸。基于上述研究，该转化反应所用大肠杆菌工程菌的诱导条件定为37℃、0.1 mm iptg诱导6 h。
31.通过上述研究所构建的大肠杆菌工程菌株ec-1虽然能够实现γ-氨基丁酸的生产的全流程均在常温下进行，但由于谷氨酸脱羧酶gadz11在催化l-谷氨酸转化生成γ-氨基丁酸时需要辅酶吡哆醛5
’‑
磷酸才能发挥其活性。而大肠杆菌自身合成的吡哆醛5
’‑
磷酸量较少，无法满足产物合成的需要，因此，该转化反应仍需外源添加价格昂贵的吡哆醛5
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磷酸，这不但增加了操作步骤，而且增加了生产成本。通过在大肠杆菌中建立吡哆醛5
’‑
磷酸合成途径实现该辅酶的自供给无疑是解决这一问题的有效途径。微生物中的天然吡哆醛5
’‑
磷酸合成途径包括两个。一个为脱氧木酮糖5-磷酸依赖的途径，但该途径过长，需要7种
酶参与催化反应。另一种为核酮糖5-磷酸依赖的途径。该途径仅由两种酶组成的复合物催化，以核糖5-磷酸、甘油醛3-磷酸和谷氨酰胺为底物直接合成吡哆醛5
’‑
磷酸。基于此，对枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）168和酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）sc288来源的吡哆醛5
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磷酸合酶基因（pdxs和sno1）和谷氨酰胺氨基转移酶编码基因（pdxt和snz1）进行了基因来源、启动子和组合方式的筛选并基于此在大肠杆菌bl21(de3)中构建了吡哆醛5
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磷酸合成通路，实现了辅酶哆醛5
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磷酸的自供给。具体方法如下：1. 谷氨酰胺酶基因和吡哆醛5
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磷酸合成酶基因表达载体的构建分别使用细菌基因组dna提取试剂盒和酵母基因组dna提取试剂盒，提取枯草芽孢杆菌168和酿酒酵母sc288的基因组dna。
32.（1）petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt载体的构建根据pdxs基因序列设计合成引物。以枯草芽孢杆菌168基因组为模板利用上述设计的引物扩增pdxs基因，片段大小926 bp。将获得的片段使用gibson assembly连接方式连接至质粒petdute-1的ecori/noti位点。将质粒转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（氨苄青霉素100
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为petdute-1-t7-pdxs。
33.而后根据pdxt基因序列设计合成引物。以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，利用上述设计的引物扩增pdxt基因，片段大小631 bp，将获得的片段使用gibson assembly连接方式连接至质粒petdute-1-t7-pdxs的ecorv和bglii位点。将质粒转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（氨苄青霉素100
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt。
34.（2）petdute-1-t7-pdxs/pdxt载体的构建根据pdxs和pdxt基因序列设计合成引物，以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，利用上述设计的引物扩增同时含有pdxs和pdxt的基因片段，片段大小1539 bp。将获得的片段使用gibson assembly连接方式连接至质粒petdute-1的ecori和bglii位点。将质粒化学转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（氨苄青霉素100
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为petdute-1-t7-pdxs/t。
35.（3）pacycdute-1-t7-pdxt载体的构建根据pdxt基因序列设计合成引物。以枯草芽孢杆菌基因组为模板，利用上述设计的引物扩增pdxt基因片段，片段大小631 bp，将获得的片段使用gibson assembly连接方式连接至质粒pacycdute-1的ecori/noti位点。将质粒化学转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（氯霉素35
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为pacycdute-1-t7-pdxt。
36.（4）pacycdute-1-j-pdxt载体的构建根据载体pacycdute-1-t7-pdxt基因序列设计合成含有j23100启动子序列引物。以载体pacycdute-1-t7-pdxt为模板，利用上述设计的引物扩增目的基因，片段大小3361 bp，将获得的片段转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（氯霉素35
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为pacycdute-1-j-pdxt。
37.（5）petdute-1-j-pdxs-j-pdxt载体的构建根据载体petdute-1-t7-pdxs基因序列设计合成含有j23100启动子序列的引物。以载体petdute-1-t7-pdxs为模板，利用上述设计的引物扩增片段，片段大小4794 bp。将片段转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（氨苄青霉素100
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为petdute-1-j-pdxs。
38.根据载体pacycdute-1-j-pdxt基因序列设计合成含有j23100启动子序列引物。以载体pacycdute-1-j-pdxt为模板，利用上述设计的引物扩增目的片段，片段大小749 bp，将获得的片段使用gibson assembly连接方式连接至质粒petdute-1-j-pdxs的noti和ecorv位点。将质粒化学转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（氨苄青霉素100
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为petdute-1-j-pdxs-j-pdxt。
39.（6）petdute-1-j-pdxs/pdxt载体的构建根据载体petdute-1-t7-pdxs/t序列设计合成含有j23100启动子序列的引物。以载体petdute-1-t7-pdxs/t为模板，利用上述设计的引物扩增目的片段，片段大小为5406 bp，将获得的片段使用gibson assembly连接方式连接成环状质粒。将片段转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（氨苄青霉素100
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为petdute-1-j-pdxs/t。
40.（7）petdute-1-t7-sno1-t7-snz1载体的构建根据sno1基因序列设计合成引物。以酿酒酵母sc288基因组为模板，利用上述设计的引物分别扩增sno1基因片段，片段大小717 bp，将获得的片段使用gibson assembly连接方式连接至质粒petdute-1的ecori/noti位点。将质粒转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（氨苄青霉素100
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为petdute-1-t7-sno1。而后根据snz1基因序列设计合成引物。以酿酒酵母sc288基因组为模板，利用上述设计的引物扩增snz1基因片段，片段大小946 bp。将获得的片段使用gibson assembly连接方式连接至质粒petdute-1-t7-sno1的ecorv和bglii位点。将质粒化学转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（氨苄青霉素100
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为petdute-1-t7-sno1-t7-snz1。
41.（8）petdute-1-t7-sno1/snz1载体的构建根据sno1和snz1基因序列设计合成引物，以酿酒酵母sc288基因组为模板，利用上述设计的引物扩增目的片段，片段大小1631 bp。将获得的片段使用gibson assembly连接方式连接至质粒petdute-1的ecori/noti位点。将质粒转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（氨苄青霉素100
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为petdute-1-t7-sno1/snz1。
42.（9）pacycdute-1-t7-snz1载体的构建根据snz1基因序列设计合成引物。以酿酒酵母sc288基因组为模板，利用上述设计的引物扩增snz1基因片段，片段大小949 bp。将获得的片段使用gibson assembly连接方式连接至质粒pacycdute-1的ecori/noti位点。将质粒化学转化至大肠杆菌trans1-t1宿主
中，涂布lb固体平板（氯霉素35
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为pacycdute-1-t7-snz1。
43.（10）petdute-1-j-sno1/snz1载体的构建根据载体petdute-1-t7-sno1/snz1基因序列设计合成含有j23100启动子序列的引物。以载体petdute-1-t7-sno1/snz1为模板，利用上述设计的引物扩增目的片段，片段大小5500 bp。将片段转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（氨苄青霉素100
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为petdute-1-j-sno1/snz1。
44.（11）petdute-1-j-sno1载体的构建根据载体petdute-1-t7-sno1基因序列设计合成含有j23100启动子序列的引物。以载体petdute-1-t7-sno1为模板，利用上述设计的引物扩增目的片段，片段大小4535 bp。将片段转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（氨苄青霉素100
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证。将正确构建的质粒命名为petdute-1-j-sno1。
45.（12）pacycdute-1-j-snz1载体的构建根据载体pacycdute-1-t7-snz1基因序列设计合成含有j23100启动子序列引物。以载体pacycdute-1-t7-snz1为模板，利用上述设计的引物扩增目的片段，片段大小3622 bp。将片段化学转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（氯霉素35
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为pacycdute-1-j-snz1。
46.2. 合成吡哆醛5
’‑
磷酸的重组大肠杆菌的构建及产物产量测定将上述载体分别转化到大肠杆菌bl21(de3)中构建重组菌株ec-2、ec-3、ec-4、ec-5、ec-6、ec-7、ec-8、ec-9、ec-10、ec-11、ec-12和ec-13。
47.ec-2：t7-pdxs-t7-pdxt，进行吡哆醛5
’‑
磷酸合成的菌株；ec-3：t7-pdxs/pdxt，进行吡哆醛5
’‑
磷酸合成的菌株；ec-4：t7-pdxs和t7-pdxt进行吡哆醛5
’‑
磷酸合成的菌株；ec-5：j-pdxs-j-pdxt，进行吡哆醛5
’‑
磷酸合成的菌株；ec-6：j-pdxs/pdxt，进行吡哆醛5
’‑
磷酸合成的菌株；ec-7：j-pdxs和-j-pdxt，进行吡哆醛5
’‑
磷酸合成的菌株；ec-8：t7-sno1-t7-snz1，进行吡哆醛5
’‑
磷酸合成的菌株；ec-9：t7-sno1/snz1，进行吡哆醛5
’‑
磷酸合成的菌株；ec-10：t7-sno1和t7-snz1，进行吡哆醛5
’‑
磷酸合成的菌株；ec-11：j-sno1/snz1，进行吡哆醛5
’‑
磷酸合成的菌株；ec-12：j-sno1和/ j-snz1，进行吡哆醛5
’‑
磷酸合成的菌株；ec-13：gadz11和t7-pdxs-t7-pdxt，能够利用内源合成的吡哆醛5
’‑
磷酸酸进行γ-氨基丁酸生产的菌株；ec-14： t7-pdxs-t7-pdxt-t7-gadz11，能够利用内源合成的吡哆醛5
’‑
磷酸进行γ-氨基丁酸生产的菌株；ec-15： t7-pdxs-t7-pdxt-rbs-gadz11，能够利用内源合成的吡哆醛5
’‑
磷酸进行
γ-氨基丁酸生产的菌株。
48.以转入petdute-1的大肠杆菌菌株ec-0作为对照。将上述菌株以接种量1
‰
接种至50 ml带有相应抗生素的lb培养基中（氨苄青霉素100
ꢀµ
g/ml和/或氯霉素35
ꢀµ
g/ml），于37℃，220 rpm下摇床培养过夜。将获得的菌液以2％的接种量接种至300 ml带有相应抗性的lb培养基中（氨苄青霉素100
ꢀµ
g/ml和/或氯霉素35
ꢀµ
g/ml），于摇床中37℃，220 rpm培养至od
600
≈0.6。
49.向培养至od
600
≈0.6的菌液中加入终浓度0.1 mm iptg，于37℃下，200 rpm摇床中诱导6 h。利用可见光分光光度计，测定波长600 nm下菌液的吸收值（od
600
）。将10 mg（细胞干重）细胞重悬于含有100 μg/ml溶菌酶、10 μg/ml rnasea和5
ꢀµ
g/ml dnase i的15 ml磷酸盐缓冲液中（pbs，ph 7.4）。冰上孵育1 h后超声破碎菌体。而后将20
ꢀµ
g蛋白酶k添加到样品中并于冰上孵育30 min，而后加入1.5 ml 100%三氯乙酸（tca）沉淀蛋白。将样品涡旋1 min后于冰上孵育15 min。4℃，12000 rpm离心10 min后取上清进行hplc检测。色谱柱为agilent zorbax 300sb-c18(5μm，4.6
×
250 mm)，柱温40℃。进样量为10 μl。流动相为含8%乙腈和0.1% c
16h37
no的50 mm (nh4)2hpo4缓冲液（ph 3.6），检测程序为：流速0.7 ml/min，检测时间20 min，检测波长292 nm。
50.检测结果如图2所示，结果表明，基因来源及组合和诱导方式在吡哆醛5
’‑
磷酸产量上存在差异。总体而言，利用枯草芽孢杆菌来源的吡哆醛5
’‑
磷酸合成相关基因构建的代谢通路的产物产量优于利用酿酒酵母来源的基因构建的代谢通路。同时，利用诱导型启动子对基因表达进行调控更有益于吡哆醛5
’‑
磷酸的合成，这可能是由于产物的合成对菌株的生长具有负面影响，而诱导型启动子在加入诱导剂前处于关闭状态，对菌株生长的影响较小。吡哆醛5
’‑
磷酸产量最高的菌株为携带质粒petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt的ec-2菌株，该菌株中枯草芽孢杆菌来源的吡哆醛5
’‑
磷酸合成酶基因（pdxs）和谷氨酰胺酶基因（pdxt）的表达分别由t7启动子控制。基于此，选择重组大肠杆菌ec-2中构建吡哆醛5
’‑
磷酸合成途径所用的的基因、组合和诱导方式用于γ-氨基丁酸生产。
51.基于筛选到的能够在大肠杆菌中合成哆醛5
’‑
磷酸的基因、组合和诱导方式，对该组合与谷氨酸脱羧酶gadz11的组合方式进行了实验探究。以期将二者进行叠加获得能够利用内源合成的吡哆醛5
’‑
磷酸配合谷氨酸脱羧酶gadz11进行产物γ-氨基丁酸的高效合成。具体实施方法如下：1. 谷氨酸脱羧酶和吡哆醛5
’‑
磷酸合成酶相关基因表达载体的构建（1）pcdfdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt根据pdxs和pdxt基因序列设计合成引物。以载体petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt为模板，利用上述设计的引物扩增目的片段，片段大小1673 bp。将获得的片段使用gibson assembly连接方式连接至质粒pcdfdute-1的ecori/ndei位点。将质粒化学转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（链霉素35
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为pcdfdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt。
52.（2）petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt-t7-gadz11根据gadz11基因序列设计合成引物，以载体pet28a-gadz11为模板，利用上述设计的引物扩增目的片段，片段大小1779bp。将获得的片段使用gibson assembly连接方式连接至质粒petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt的ecorv和xhoi位点。将质粒化学转化至大肠杆菌
trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（氨苄青霉素100
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt-t7-gadz11。
53.（3）petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt-rbs-gadz11根据gadz11基因序列设计合成引物。以载体pet28a-gadz11为模板，利用上述设计的引物扩增目的片段，片段大小1681 bp。将获得的片段使用gibson assembly连接方式连接至质粒petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt的ecorv/xhoi位点。将质粒化学转化至大肠杆菌trans1-t1宿主中，涂布lb固体平板（氨苄青霉素100
ꢀµ
g/ml），37℃过夜培养后利用菌落pcr筛选阳性克隆子并测序验证，将正确构建的质粒命名为petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt-rbs-gadz11。
54.2. 利用内源吡哆醛5
’‑
磷酸进行γ-氨基丁酸合成的重组大肠杆菌构建将重组质粒pet28a-gadz11和pcdfdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt同时转入大肠杆菌bl21(de3)中，将重组质粒petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt-t7-gadz11和petdute-1-t7-pdxs-t7-pdxt-rbs-gadz11分别转入大肠杆菌bl21(de3)中得到大肠杆菌工程菌ec-13、ec-14和ec-15。携带质粒pet28a-gadz11进行gadz11基因表达的菌株ec-1作为对照，且在该转化反应体系中添加终浓度为0.1 mm的吡哆醛5
’‑
磷酸。
55.将ec-14、ec-15和ec-16以接种量1
‰
接种至50 ml含有相应抗生素的lb培养基中（卡那霉素50
ꢀµ
g/ml、链霉素50
ꢀµ
g/ml或氨苄青霉素100
ꢀµ
g/ml），于37℃，220 rpm下摇床培养过夜。将获得的菌液以2％的接种量接种至300 ml lb培养基中（卡那霉素50
ꢀµ
g/ml），于摇床中37℃，220 rpm培养至od
600
≈0.6。向菌液中加入终浓度0.1 mm iptg，于37℃下，2200 rpm摇床中诱导6 h。12000 rpm离心5 min收集菌体。将获得的菌体用纯水清洗两次后将菌体转移至50 ml离心管中，加水20 ml重悬，使菌液浓度od
600
≈20。称取2.94 g l-谷氨酸（在反应体系中的终浓度为1 m）加入100 ml锥形瓶中，将上述离心管中的20 ml菌液加入锥形瓶中启动产物合成反应。分别在反应0.5和1 h取500 μl反应液加500 μl 80%乙醇终止反应，12000 rpm离心3 min取上清适度稀释后进行hplc检测。检测结果如图3所示。结果表明，构建有内源合成吡哆醛5
’‑
磷酸途径的菌株即使在不外源添加吡哆醛5
’‑
磷酸的情况下仍能够高效转化l-谷氨酸生成γ-氨基丁酸。同时，其反应速率要显著高于对照菌株。当反应时间为0.5 h时，对照菌株体系中的产物浓度为0.7 m，而此时菌株ec-13、ec-14和ec-15反应体系中的产物浓度均达到了约1 m。这可能是由于外源添加的吡哆醛5
’‑
磷酸虽然浓度较高，但并不能完全进入细胞内参与催化反应。此外，有报道表明，胞内的吡哆醛5
’‑
磷酸有助于谷氨酸脱羧酶的表达，这增加了细胞内参与催化反应的酶量。基于此，选择反应1 h后的γ-氨基丁酸产量最高的菌株ec-14作为后续的生产菌株。
56.将大肠杆菌菌株ec-15以接种量1
‰
接种至50 ml lb培养基中（卡那霉素50
ꢀµ
g/ml），于37℃，220 rpm下摇床培养过夜。将获得的菌液以2％的接种量接种至300 ml lb培养基中（卡那霉素50
ꢀµ
g/ml），于摇床中37℃，220 rpm培养至od
600
≈0.6。向菌液中加入终浓度0.1 mm iptg，于37℃下，2200 rpm摇床中诱导6 h。12000 rpm离心5 min收集菌体。
57.1. 重组大肠杆菌菌株ec-15全细胞转化生产γ-氨基丁酸条件优化（1）反应体系中添加不同浓度l-谷氨酸对产物合成的影响将获得的菌体用纯水清洗两次后将菌体转移至50 ml离心管中，加水20 ml重悬，
使菌液浓度od
600
≈20。称取不同量的l-谷氨酸（在反应体系中的终浓度为0.5、1、2、3和4 m）加入100 ml锥形瓶中，将上述离心管中的20 ml菌液加入锥形瓶中启动产物合成反应。反应1 h后取500 μl反应液加500 μl 80%乙醇终止反应，12000 rpm离心3 min取上清适度稀释后进行hplc检测。检测结果如图4的（a）所示。结果表明，随着底物l-谷氨酸浓度的增加，γ-氨基丁酸的产量逐渐增加，然而产物转化率逐渐降低。当底物l-谷氨酸在1 m及以下时，其转化率为100%。当浓度高于1 m，产物浓度虽略上升至约1.2 m，但转化率急剧下降至60%以下。这可能是由于产物γ-氨基丁酸对谷氨酸脱羧酶的抑制作用造成的，即在产物浓度过高时，谷氨酸脱羧酶gadz11的催化活性受到了抑制，无法再进行底物催化。
58.（2）反应体系中的菌体浓度对产物合成的影响将获得的菌体用纯水清洗两次后将菌体转移至50 ml离心管中，加水20 ml重悬，使菌液浓度od
600
分别为2、10、15、20和30。称取在反应体系中的终浓度为6 m的l-谷氨酸加入100 ml锥形瓶中，将上述离心管中的20 ml菌液加入锥形瓶中启动产物合成反应。反应在37℃、120 rpm条件下进行2 h后取500 μl反应液加入等体积的80%乙醇以终止反应，离心收集上清液适度稀释后利用hplc检测γ-氨基丁酸的浓度。检测结果如图4的（b）所示。结果表明，当菌体用量为od
600
约为2-15时，产物的产量依次增加且在od
600
为15时达到最大值1.5 m。当继续加大菌体用量时，产物产量反而出现了下降。
59.（3）转化反应时间对产物合成的影响将获得的菌体用纯水清洗两次后将菌体转移至50 ml离心管中，加水20 ml重悬，使菌液浓度od
600
为15。称取在反应体系中的终浓度为1、2、3和4 m的l-谷氨酸加入100 ml锥形瓶中，将上述离心管中的20 ml菌液加入锥形瓶中启动产物合成反应。反应在37℃、120 rpm条件下进行，分别于10、20、30、60和90 min后取500 μl反应液加入等体积的80%乙醇以终止反应，离心收集上清液适度稀释后利用hplc检测γ-氨基丁酸的浓度。检测结果如图4的（c）所示。结果表明，在不同底物浓度条件下产物的产量随反应时间的延长而增加。其中，以底物为1 m时的转化速率最快。反应20 min后，其γ-氨基丁酸浓度即可达到1.0 m，即已实现了100%转化。而底物为2、3和4 m时，达到产物浓度为1 m需要1 h。因此确定反应的最佳时长为30 min。这相较于外源添加吡哆醛5
’‑
磷酸时的反应时长缩短了50%。表明内源吡哆醛5
’‑
磷酸的合成有利于反应速率的提升。
60.（4）反应体系中l-谷氨酸和l-谷氨酸比例对产物合成的影响谷氨酸脱羧酶在酸性条件下才能够充分发挥转化l-谷氨酸生成γ-氨基丁酸的催化活性。但l-谷氨酸底物价格较为高昂，增加了生产成本。但利用价格低廉的l-谷氨酸钠为底物时，在水反应体系中会导致较低转化率，需要添加大量酸使反应体系保持酸性，该操作增加操作步骤且增加了生产成本。因此，可将底物l-谷氨酸更换为l-谷氨酸和l-谷氨酸钠的混合物，以期既能够使溶液处于酸性条件有利于转化反应的进行同时降低生产成本。
61.将获得的菌体用纯水清洗两次后将菌体转移至50 ml离心管中，加水20 ml重悬，使菌液浓度od
600
≈20。称取不同比例的总终浓度为1 m的l-谷氨酸和l-谷氨酸钠（1:0、4:1、3:2、1:1、2:3、1:4和0:1）加入100 ml锥形瓶中，将上述离心管中的20 ml菌液加入锥形瓶中启动产物合成反应。反应在37℃、120 rpm条件下进行0.5 h后取500 μl反应液加入等体积的80%乙醇以终止反应，离心收集上清液适度稀释后利用hplc检测γ-氨基丁酸的浓度。检测结果如图4的（d）所示。结果表明，当将反应体系中20%-40%的l-谷氨酸替换为l-谷氨酸钠
时，对γ-氨基丁酸的生产无明显影响，转化率均在97.7%以上。而当比例增加至50%以上时，γ-氨基丁酸的浓度降至了0.8 m以下。因此，选择向转化体系中添加0.6 m l-谷氨酸和0.4 m l-谷氨酸钠混合物进行γ-氨基丁酸生产。
62.2. 利用重组大肠杆菌菌株ec-15高效生产γ-氨基丁酸将培养诱导后获得的菌体用纯水清洗两次后将菌体转移至50 ml离心管中，加水20 ml重悬，使菌液浓度od
600
≈15。称取在反应体系中的终浓度分别为0.6 m和0.4 m的l-谷氨酸和l-谷氨酸钠加入100 ml锥形瓶中，将上述离心管中的20 ml菌液加入锥形瓶中启动产物合成反应。反应在37℃、120 rpm条件下进行0.5 h后，将反应液离心，收集菌体清水清洗两次后再次加入相同的反应体系中进行γ-氨基丁酸合成反应。同批次工程菌株细胞共利用8次。测定每次反应的产物浓度及转化率如图5所示。结果表明，各批次中的产物γ-氨基丁酸的产量及其转化率均在0.9 m和96%以上。表明菌体可进行重复利用，有利于节约生产成本。综合实验结果，该菌株可在4 h内生产820 g/l以上的γ-氨基丁酸，生产速率达到了205 g/l/h，具有极高的产业化应用前景。
63.以上实施例仅用于解释本技术的技术方案，不限定本技术的保护范围。

技术特征：
1.一种构建高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌工程菌的方法，包括以下步骤：在大肠杆菌菌株中利用诱导型启动子异源表达芽孢杆菌z11来源的谷氨酸脱羧酶的编码基因，构建具有γ-氨基丁酸合成能力的突变型大肠杆菌底盘细胞；在获得的所述具有γ-氨基丁酸合成能力的突变型大肠杆菌底盘细胞中，利用诱导型启动子分别对枯草芽孢杆菌168来源的吡哆醛5
’‑
磷酸合酶编码基因和谷氨酰胺氨基转移酶编码基因进行异源表达，构建内源吡哆醛5
’‑
磷酸合成途径，获得高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌工程菌。2.根据权利要求1所述的构建高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于，所述诱导型启动子为t7启动子。3.高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌工程菌通过以下步骤构建而得：在大肠杆菌菌株中利用诱导型启动子异源表达芽孢杆菌z11来源的谷氨酸脱羧酶的编码基因，构建具有γ-氨基丁酸合成能力的突变型大肠杆菌底盘细胞；在获得的所述具有γ-氨基丁酸合成能力的突变型大肠杆菌底盘细胞中，利用诱导型启动子分别对枯草芽孢杆菌168来源的吡哆醛5
’‑
磷酸合酶编码基因和谷氨酰胺氨基转移酶编码基因进行异源表达，构建内源吡哆醛5
’‑
磷酸合成途径，获得高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌工程菌。4.一种全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：通过摇瓶诱导权利要求3所述的高效生产γ-氨基丁酸的重组大肠杆菌工程菌；加入全细胞转化底物，进行全细胞转化生产γ-氨基丁酸，所述全细胞转化底物为l-谷氨酸和l-谷氨酸钠的混合物。5.根据权利要求4所述的全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，摇瓶诱导时间为37℃，转速为220 rpm，诱导剂iptg浓度为0.1 mm。6.根据权利要求4所述的全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述全细胞转化的条件为温度37℃，转速120 rpm。7.根据权利要求4所述的全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述全细胞转化底物为总浓度为1m的l-谷氨酸和l-谷氨酸钠的混合物，包括0.6m的l-谷氨酸和0.4m的l-谷氨酸钠。

技术总结
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种构建高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌的方法及生产γ-氨基丁酸的方法。本发明通过在大肠杆菌中异源表达芽孢杆菌Z11来源的谷氨酸脱羧酶编码基因构建了一株能够进行γ-氨基丁酸生产的大肠杆菌工程菌株。为消除大肠杆菌工程菌在转化底物生产γ-氨基丁酸的过程中对外源昂贵辅因子吡哆醛5


技术研发人员：王晓璐 常放放 张杰 涂涛 姚斌 罗会颖 黄火清 柏映国 苏小运 张红莲 秦星 王苑 王亚茹 于会民
受保护的技术使用者：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/8/4