一种白蚁菌及其产生的碱性木聚糖酶和应用

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种白蚁菌及其产生的碱性木聚糖酶和应用。


背景技术：

2.木聚糖是自然界中含量最丰富的半纤维素，几乎在所有植物组织中都有发现，它是一种主要存在于植物细胞的细胞壁中的复杂分子。该聚合物的主链由β-1,4糖苷键连接的d-吡喃木糖残基组成。侧链连接有各种短的基团，侧链上的取代基以l-arabinose、ferulcacid、acetyl、coumaricacid和glcuronicacid的残基形式存在，因此不同木聚糖的结构和化学组成差异很大。由于其结构的复杂性，想要将其完全转化为单糖，需要多种具有不同功能和作用方式的水解酶协同作用才能完成。
3.木聚糖酶是指能够将木聚糖水解成寡糖或单糖的一系列酶的总称，包括内切β1,4-d-木聚糖酶(endo-1,4-β-d-xylnxylnohydrolse，ec.3.2.1.8)、β-d-木糖苷酶(β-xylnxylhydrolse，ec.3.2.1.37)、α-l阿拉伯糖苷酶(α-arabinofuranosidase，ec3.2.1.55)、α-d-葡糖苷酸酶(α-glcuronidase，ec3.2.1.139)、乙酰基木聚糖酶(α-glcuronidase，ec3.2.1.139)等。狭义上的木聚糖酶单指内切β-1,4-d木聚糖酶，它能够催化木聚糖的主链内β-1,4-糖苷键的水解，切割木聚糖主链的β-1,4-糖苷键，生成木寡糖或带有侧链的寡聚木糖，从而降低木聚糖的聚合度，将木聚糖水解成低聚木糖，因此，内切木聚糖酶也称作木聚糖水解的关键酶。
4.工业上利用木聚糖酶还存在一些问题:稳定性低、底物特异性差，酶活性范围窄，限制了木聚糖酶的广泛应用，大多数报道的gh10木聚糖酶不能耐受超过50℃的温度。研究嗜极微生物已被证明是发现稳定性更高的新型酶的有效策略，同时，为使筛选得到的木聚糖酶能进行大规模生产，通常需要利用基因工程的手段实现木聚糖酶的异常源表达，探索更加有效的表达系统最终实现大规模发酵生产，以满足工业应用的要求。此外，借助高通量设备，计算机软件辅助的方式，从分子进化角度深度探索酶结构与功能的关系，也是近年来的研究热点之一。理性设计和定向进化方法已被广泛用于改善木聚糖酶的性能，国内外的相关研究也已取得重要研究进展。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种白蚁菌isoptericola sp.wl6，该白蚁菌可产生一种碱性木聚糖酶。
6.本发明的另一目的在于提供上述白蚁菌isoptericola sp.wl6产生的碱性木聚糖酶。该酶具有ph适应范围广，耐热、碱、金属离子和表面活性剂等适用于造纸、洗涤等工业的优良酶学特性。
7.本发明的再一目的在于提供上述白蚁菌及其产生的碱性木聚糖酶的应用。
8.本发明的目的通过下述技术方案实现：
9.一种白蚁菌，是从土壤中筛选得到的一株具有产碱性木聚糖酶活力的菌株isoptericola sp.wl6。
10.所述的白蚁菌的保藏编号为cctcc no:m 20221888，于2022年12月07日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。
11.菌落形态特征：在lb固体培养基上的菌落边缘较为整齐，颜色为淡黄色，表面平滑有光泽。
12.该菌株的选择培养基的配方：木聚糖8.0g/l，kno
3 1.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，nacl 15g/l，kh2po41.5g/l，琼脂15～20g/l，ph9.0。
13.所述的白蚁菌isoptericola sp.wl6产生的碱性木聚糖酶，按照下述方法制得：
14.(1)粗酶液的制备
15.将白蚁菌isoptericola sp.wl6在发酵培养基中进行液体发酵，在37℃，200rpm的培养条件下发酵7d，于4℃，12000rpm高速冷冻离心25min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，透析，即得粗酶液，用于离子交换层析；
16.(2)碱性木聚糖酶的分离纯化
17.(a)层析柱的装填
18.在规格为φ2.6cm
×
30cm的层析柱中倒入100ml搅拌均匀的阴离子交换层析介质sp-sepharose fast flow层析凝胶，随后将层析柱安装至ge healthcare快速蛋白层析系统。用去离子水以2ml/min的流速冲洗层析柱15min，随后用5～6倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡，待a280紫外吸收峰基线稳定后封闭柱头，完成层析柱的装填。
19.(b)内切木聚糖酶的阴离子离子交换层析
20.将装填好的层析柱安装至ge healthcare快速蛋白层析系统，以ph6.5的tris-hcl溶液为平衡缓冲液，ph6.5，含1m nacl的tris-hcl溶液为洗脱缓冲液，进行蛋白的分离纯化。上样前使用5～6倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡，待平衡缓冲液将a280基线冲洗稳定后，取5ml经0.22nm微孔滤膜过滤后的发酵液上样，继续用平衡缓冲液洗至穿透峰出现，待a280基线平稳时，转换为洗脱缓冲液，以不同的盐浓度梯度冲洗层析柱进行梯度洗脱。使用2ml ep管分别收集不同盐浓度紫外吸收峰下的洗脱液，并使用dns法对各管洗脱液进行木聚糖酶活检测。
21.(c)粗酶液的脱盐处理
22.使用脱盐柱，将收集到的粗酶液进行脱盐，将脱盐柱安装至ge healthcare快速蛋白层析系统，使用5～6倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡，待平衡缓冲液将离子浓度基线冲洗稳定后，取10ml经0.22nm微孔滤膜过滤后的粗酶液上样，继续使用平衡缓冲液进行洗脱至a280基线出现波动时，取20ml离心管收集a280洗脱液，待离子浓度基线升高时停止接样，得到碱性木聚糖酶粗酶液。将粗酶液进行sds-page蛋白电泳分析，4℃保存，用于后续的凝胶过滤层析。
23.(d)碱性木聚糖酶的凝胶过滤层析
24.将粗酶液倒入10kda超滤浓缩管进行超滤浓缩后，使用预装柱superdex200将粗酶液再次进行分离。缓冲体系为ph 8.0的去离子水，用5～6倍柱体积的缓冲液将a280基线冲洗稳定后，取500ul浓缩酶液上样，待a280洗脱峰出现时使用ep管进行接取。收集洗脱峰液，即纯酶液，进行酶活检测和蛋白电泳分析，并保存用于后续酶学性质研究。
25.所述碱性木聚糖酶的蛋白分子量为43kd左右，酶学特性研究显示，其最适反应温度为50℃，最适反应ph为8左右，特别是在ph6.5～10.5之间，该酶的相对酶活力均在80％以上，说明该酶ph稳定性良好，具有既耐酸又耐碱的强抗逆特性，符合造纸和洗涤等工业用酶的基本要求，具有良好的工业应用前景。
26.从白蚁菌isoptericola sp.wl6的基因组dna中扩增得到xynwl6木聚糖酶基因的完整表达开放阅读框(orf)，长1443bp。将其酶基因的氨基酸编码序列在ncbi数据库进行blast，发现该保守序列与同为10家族的木聚糖酶isoptericola halotolerans wp171782838.1，具有77％的相似性，结合酶蛋白的分子量大小、等电点、酶活特性等性质，可初步推断编码该氨基酸序列的基因为新的木聚糖酶基因。
27.所述的白蚁菌isoptericola sp.wl6及其产生的碱性木聚糖酶在造纸、洗涤等工业中的应用。
28.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
29.(1)本发明筛选得到的白蚁菌isoptericola sp.wl6属于嗜碱的极端微生物，可在高碱性条件下(ph9.0)培养，具有可有效抑制杂菌污染，有利于大规模的发酵生产的特点。
30.(2)本发明的白蚁菌isoptericola sp.wl6产生的碱性木聚糖酶蛋白分子量为43kd左右，酶学特性研究显示，其最适反应温度为50℃，最适反应ph为8左右，特别是在ph6.5～10.5之间，该酶的相对酶活力均在80％以上，说明该酶ph稳定性良好，具有既耐酸又耐碱的强抗逆特性，符合造纸和洗涤等工业用酶的基本要求，具有良好的工业应用前景。
附图说明
31.图1是isoptericola sp.wl6在固体培养基中的形态及木聚糖水解透明圈照片图。
32.图2是isoptericola sp.wl6的16s rdna的电泳条带图。
33.图3是isoptericola sp.wl6发酵液各洗脱峰阴离子交换图谱；其中(a)为各洗脱峰dns法酶活性检测图，(b)为f3号洗脱峰样品有明显的颜色变化的照片图。
34.图4是xynwl6阴离子交换分离纯化的电泳图谱；其中m:蛋白marker；1-7:各蛋白洗脱峰对应的蛋白图谱。
35.图5是xynwl6蛋白凝胶过滤层析交换图谱；其中(a)为与凝胶过滤层析纯化的电泳图谱(b)，m：蛋白marker；1:粗酶液蛋白图谱；1～4:凝胶过滤层析的酶活峰。
36.图6是xynwl6最适反应温度(a)与木聚糖酶温度的稳定性(b)结果图。
37.图7是xynwl6最适反应ph(a)与木聚糖酶的ph稳定性(b)结果图。
38.图8是金属离子和表面活性剂对酶活力的影响结果图。
39.图9是洗衣液对酶活力的影响结果图。
40.图10是碱性木聚糖酶水解木聚糖产物tlc分析；其中：m:木寡糖标记物；s1:xynwl6与底物反应12小时水解产物s2:xynwl6与底物反应24小时水解产物s3:xynwl6与底物反应48小时水解产物；n:木聚糖底物。
41.图11是isoptericola sp.wl6基因组电泳条带图。
42.图12是xynwl6木聚糖酶基因保守序列进行touchdownpcr扩增的电泳图；其中：m:分子量标记；1～2:xynwl6基因保守序列；3:阴性对照。
43.图13是fpni对xynwl6保守序列的上游基因进行克隆的电泳图；其中：m:分子量标
记；1～8:不同巢式引物第二轮pcr扩增结果。
44.图14是fpni-pcr对xynwl6保守序列的下游基因进行克隆的电泳图，其中：m:分子量标记；1～8:不同巢式引物第三轮pcr扩增结果。
45.图15是xynwl6木聚糖酶基因编码序列在ncbi比对结果图。
具体实施方式
46.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
47.下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
48.实施例1目标菌株的筛选
49.(1)富集培养：称取1g淤泥土壤样品，充分混匀在100ml的无菌水中，制成菌悬液后，取2ml菌悬液加入到灭菌的50ml富集培养基中，放入摇床37℃，200rpm富集培养48h。
50.富集培养基：木聚糖8.0g，蛋白胨10g，nacl 15g，kh2po
4 1.5g，na2hpo4·
12h2o 9.0g，mgso4·
7h2o2.0g，定容至1l ddh2o，ph9.0。
51.(2)平板初筛：将富集培养后的菌液10倍逐级稀释，分别取稀释倍数为10-3
、10-5
、10-7
的菌悬液0.5ml涂布于含有木聚糖的碱性选择培养基平板上，37℃培养48h，筛选出透明圈较大的单菌落进行多次筛选，直到获得单一菌落，将其作为原始菌株接种到斜面培养基保藏为原始菌种。
52.选择培养基：木聚糖8.0g，kno
3 1.0g，mgso4·
7h2o 0.5g，nacl 15g，kh2po
4 1.5g，琼脂15～20g，溶于1l ddh2o，ph9.0。
53.斜面培养基：葡萄糖10g/l，蛋白胨5g/l，酵母提取物5g/l，kh2po
4 1g/l，mgcl
2 0.2g/l，nacl 50g/l，na2co
3 10g/l，琼脂15～20g/l，ph 9.0。
54.(3)上述步骤筛选得到一株具有产碱性木聚糖酶活力的菌株，其液体发酵酶活力为65u/ml。该菌株在lb固体培养基中的形态如图1所示，菌落边缘较为整齐，颜色为淡黄色，表面平滑有光泽。利用通用引物(27f和1492r)，以该菌基因组为模版，扩增16s rdna序列，扩增出一条约1500bp的条带，如图2所示，条带回收经16s rdna测序后分析，在ncbi进行blast比对，初步确定该菌为白蚁菌属，并命名为isoptericola sp.wl6，保藏编号为cctcc no:m 20221888，于2022年12月07日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。
55.lb固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，固体培养基中加入15～20g琼脂，定容至1l，121℃高压灭菌20min。
56.与当前工业用酶菌株相比，白蚁菌isoptericola sp.wl6菌属于嗜碱的极端微生物，可在高碱性条件下(ph9.0)培养，具有可有效抑制杂菌污染，有利于大规模的发酵生产的特点。
57.所述的白蚁菌isoptericola sp.wl6菌株的16s rdna序列如seq id no：1所示，其长度为1440bp。
58.实施例2
59.(一)实验材料
60.1、菌种：实施例1获得的白蚁菌isoptericola sp.wl6。
61.2、培养基及缓冲液
62.(1)发酵培养基：麸皮6g，蛋白胨1g，k2hpo
4 0.7g，溶于100ml gly-naoh缓冲液，ph9.0。
63.(2)1％木聚糖溶液：1g木聚糖溶解于ph9.0的0.05m gly-naoh缓冲液中，定容至100ml，用前充分摇匀。
64.(3)gly-naoh缓冲液(0.05m)：甘氨酸3.8g，氢氧化钠0.35g，溶于1l ddh2o，ph9.0。
65.(4)3,5-二硝基水杨酸(dns)溶液：准确称取dns 7.5g、氢氧化钠14.0g(缓慢加入)、酒石酸钾钠216g、偏重亚硫酸钠6.0g，搅拌均匀，加入5.6ml预先在60℃水浴中融化的苯酚(有毒，带口罩)，充分溶解，加去离子水定容至1l，贮于棕色瓶中，室温下避光放置一周后使用。
66.(5)蛋白分离纯化缓冲液：
67.1.tris-hcl缓冲液a(平衡缓冲液)：20mm tris，用hcl调节ph至8.0。
68.2.tris-hcl缓冲液b(洗脱缓冲液)：20mm tris，1m nacl，用hcl调节ph至8.0。
69.3、主要试剂：蛋白marker均购于生工生物工程(上海)有限公司。木聚糖生产于megazyme。阴离子交换层析介质deae sepharose fast flow为ge公司生产。10kda蛋白超滤管购于millipore公司。其他试剂均为国产分析纯。
70.4、主要仪器：thermo高速冷冻离心机、bio-rad电泳仪、ge healthcare快速蛋白层析系统、thermo超微量紫外分光光度计、thermo低温培养箱、eppendorf大容量高速冷冻离心机、振荡摇床、压力蒸汽灭菌锅、millipore超纯水机、凝胶成像系统、分光光度计、电子天平、水浴锅、电热恒温培养箱、搅拌器、微波炉、鼓风干燥箱、eppendorf移液器、biotek酶标仪。
71.(二)实验方法
72.1、粗酶液的制备
73.将平板筛选得到的菌株isoptericola sp.wl6用发酵培养基于37℃、200rpm培养7d后，将培养液以12000rpm的转速4℃冷冻离心25min，取上清液；上清经0.45um滤膜抽滤后，将滤液倒入10000kda超滤浓缩袋，取适量peg20000粉末均匀覆盖在超滤浓缩袋外侧，4℃静置24h后，收集袋内浓缩发酵液，即得粗酶液，测定其木聚糖酶活性后，用于后续层析实验。
74.2、木聚糖酶酶活测定方法
75.以ph＝9.0的gly-naoh缓冲液制备的1％榉木木聚糖溶液为底物，取其1ml，加入40μl经适当稀释的上述粗酶液，混匀，于45℃下振荡反应20min后，迅速加入1ml dns(3,5-二硝基水杨酸)溶液，沸水浴10min，冰浴冷却后于540nm测定还原糖，并扣除空白试验测定值。将上述条件下每分钟由底物产生1μmol木糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，用u/ml表示。
76.3、木糖标准曲线的绘制
77.称取无水木糖1g定容至100ml，制成1％的标准木糖溶液，然后分别取上述制备好的1％标准木糖溶液0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml、1.25ml、1.5ml再次定容至10ml，使其木糖
浓度分别为0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml、1.25mg/ml、1.5mg/ml。取上述不同浓度的木糖溶液各1ml加入到不同的试管中(另设一管取1ml去离子水作为对照组)分别加入1mldns溶液，沸水浴显色10min，冰浴冷却后测定540nm处的吸光值。以三次重复实验的均值为纵坐标，对应标准木糖溶液木糖浓度为横坐标，绘制木糖标准曲线。根据木糖标准曲线计算出实验组经酶活反应后的木糖浓度，再根据标准酶活计算公式计算得到酶活单位(u/ml)。
78.xylan-dns酶活力计算公式：
[0079][0080]
公式中：6.66为1mg木糖的μmol数。(1000/150.13＝6.66)
[0081]
4、碱性木聚糖酶的分离纯化
[0082]
(a)层析柱的装填
[0083]
在规格为φ2.6cm
×
30cm的层析柱中倒入100ml搅拌均匀的阴离子交换层析介质q-sepharose fast flow层析凝胶，随后将层析柱安装至ge healthcare快速蛋白层析系统。用去离子水以2ml/min的流速冲洗层析柱15min，随后用5～6倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡，待a280紫外吸收峰基线稳定后封闭柱头，完成层析柱的装填。
[0084]
(b)内切木聚糖酶的阴离子离子交换层析
[0085]
将装填好的层析柱安装至ge healthcare快速蛋白层析系统，以ph6.5的tris-hcl溶液为平衡缓冲液，ph6.5，含1m nacl的tris-hcl溶液为洗脱缓冲液，进行蛋白的分离纯化。上样前使用5～6倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡，待平衡缓冲液将a280基线冲洗稳定后，取5ml经0.22nm微孔滤膜过滤后的发酵液上样，继续用平衡缓冲液洗至穿透峰出现，待a280基线平稳时，转换为洗脱缓冲液，以不同的盐浓度梯度冲洗层析柱进行梯度洗脱。使用2ml ep管分别收集不同盐浓度紫外吸收峰下的洗脱液，并使用dns法对各管洗脱液进行木聚糖酶活检测。
[0086]
(c)粗酶液的脱盐处理
[0087]
使用脱盐柱，将收集到的粗酶液进行脱盐，将脱盐柱安装至ge healthcare快速蛋白层析系统，使用5～6倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡，待平衡缓冲液将离子浓度基线冲洗稳定后，取10ml经0.22nm微孔滤膜过滤后的粗酶液上样，继续使用平衡缓冲液进行洗脱至a280基线出现波动时，取20ml离心管收集a280洗脱液，待离子浓度基线升高时停止接样，得到碱性木聚糖酶粗酶液。将粗酶液进行sds-page蛋白电泳分析，4℃保存，用于后续的凝胶过滤层析。
[0088]
(d)碱性木聚糖酶的凝胶过滤层析
[0089]
将粗酶液倒入10kda超滤浓缩管进行超滤浓缩后，使用预装柱superdex200将粗酶液再次进行分离。缓冲体系为ph 8.0的去离子水，用5～6倍柱体积的缓冲液将a280基线冲洗稳定后，取500ul浓缩酶液上样，待a280洗脱峰出现时使用ep管进行接取。收集洗脱峰液，即纯酶液，进行酶活检测和蛋白电泳分析，并保存用于后续酶学性质研究。
[0090]
(e)sds-page蛋白电泳分析
[0091]
(1)试剂的准备与配制
[0092]
使用生工的变性胶制备试剂盒完成sds-page凝胶所需的试剂的配置
[0093]
考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰r-250取2.5g溶解于0.5l甲醇，冰醋酸0.1l，去离子水补至1l，混合均匀后过滤保存。
[0094]
脱色液：乙醇50ml，乙酸100ml，去离子水定容至1l。
[0095]
(2)sds-page凝胶的配制：
[0096]
a.按照下表配制15％的分离胶，将配置好的分离胶加到已经固定好的玻璃板间，等待其凝固
[0097]
表1sds-page凝胶分离胶配制
[0098][0099][0100]
b.待分离胶凝固后，按照下表中的配方配置浓缩胶，将配置好的浓缩胶加到已经固定好的玻璃板间，并插上梳子，等待其凝固，完全聚合后开始sds-page凝胶电泳。
[0101]
表2sds-page凝胶浓缩胶配制
[0102][0103]
(3)电泳的步骤：
[0104]
a.样品准备：在适量样品中加入5
×
loading buffer，沸水浴5min，然后12000rpm离心10min，取上清备用。
[0105]
b.向电泳槽的内外槽中加入现配的电泳缓冲液。
[0106]
c.上样：取20μl样品上清加入到孔道中，后加入5μl的预染蛋白marker作为判断蛋白分子量的标准。
[0107]
d.电泳：接通电源，并正确连接正负极，电压为120v，约50min，即待溴酚兰指示剂下行至凝胶底部停止电泳。
[0108]
e.染色：小心将凝胶从玻璃板上取下，加入适量考马斯亮兰染色液，在振荡摇床上染色20～30min。
[0109]
f.脱色：将染色液倒掉，用去离子水漂洗一两遍，然后加入脱色液,多次更换脱色液直至蛋白条带清晰可见。
[0110]
(三)实验结果
[0111]
1、阴离子交换层析
[0112]
用3～5倍柱体积的ph6.5的tris-hcl缓冲液进行q-sepharose fast flow层析柱平衡，待平衡液将a280基线冲洗稳定后，取适量经0.22um滤膜过滤的粗酶液上样。继续用
ph6.5的tris-hcl缓冲液冲洗至穿透峰出现，待a280基线再次稳定后使用含nacl的ph6.5的tris-hcl缓冲液进行盐浓度梯度洗脱，分别收集不同盐浓度梯度洗脱峰，并将收集到的所有峰液各自进行木聚糖酶活检测。离子交换图谱如图3所示。使用10kda超滤管将检测到有酶活的峰液进行浓缩和脱盐，得到碱性木聚糖酶的纯酶液。取适量浓缩纯酶液进行sds-page蛋白电泳分析，结果如图4，在泳道2能清楚地看到一条约为43kda的条带。
[0113]
2、凝胶过滤层析
[0114]
使用预装柱superdex75将进行过阴离子交换层析的酶液再次进行分离。缓冲液体系为ph8.0的tris-hcl缓冲液，用3～5倍体积缓冲液将a280基线冲洗至稳定状态后，取适量浓缩酶液上样，再用1个体积将样品进行洗脱，并收集洗脱峰液进行酶活检测和蛋白电泳分析。凝胶过滤的蛋白电泳结果如图5的泳道3所示，可见一条明显的目的蛋白条带(分子量约为43kda)，基本达到分离纯化的目的。
[0115]
实施例3碱性木聚糖酶的酶学性质研究
[0116]
(一)实验方法
[0117]
1、最适反应温度与温度稳定性
[0118]
取40ul稀释的纯酶液，分别在不同温度下(30℃～80℃)反应15min，dns法测定其酶活力，以此确定最适反应温度。在探究温度的稳定性时，将纯酶液进行适当的稀释后，分别在5℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃保温1h，随后在45℃下反应15min，测定其酶活力。
[0119]
2、最适反应ph与ph稳定性
[0120]
取20ml稀释的纯酶液分别在不同ph(3.0～12.0)下反应20min后，dns法测定其酶活力，以此确定最适反应ph。研究ph的稳定性时，将适量稀释的纯酶液放置在不同的ph下保温1h，随后在ph8.0下反应20min测定其酶活力。
[0121]
3、金属离子和表面活性剂对酶活力的影响
[0122]
将一定体积的金属离子溶液与适量纯酶液混合，使其终浓度为10mm；在酶促反应体系中分别加入以下金属离子(终浓度为5mm)包括：k
+
、na
+
、ca
2+
、li
+
、ni
2+
、cu
2+
、mg
2+
、fe
2+
、mn
2+
、xn
2+
以及金属螯合剂edta(0.05％)表面活性剂sds(0.05％)，以研究其对酶活性的影响。在最适ph和最适温度的条件下测定酶活性，以同样条件下未加金属离子和化学试剂的酶促反应作为对照，反应60min后测定酶活力。
[0123]
4、洗衣液对酶活力的影响
[0124]
配制市售洗衣液溶液使其终浓度为分别为0.5％、1％、1.5％、2％、5％，37℃，在市售洗衣液溶液中进行酶促反应，保温30min，然后测定其酶活力。
[0125]
5、木聚糖酶水解产物分析
[0126]
木聚糖酶的水解产物通过薄层色谱(tlc)进行分析。水解产物样品的制备方式如下：
[0127]
1ml的1％榉木木聚糖溶液底物中加入20ul纯化后的酶液混匀，于50℃、ph8.0的条件下分别反应12h、24h、48h后沸水浴10min终止反应，然后将上述己终止的反应液10000r/min离心5min后收集上清液用于薄层色谱分析。
[0128]
薄层色谱(tlc)实验步骤：
[0129]
(1)配制层展剂(乙酸乙酯：甲醇：水：冰乙酸(v:v:v)＝1：3：1:0.25)和显色剂(丙
酮：二苯胺：苯胺：磷酸(v:v:v)＝50:1:1:5)，显色剂必须按照顺序依次加入，否则会难以溶解；
[0130]
(2)将展开剂提前倒入层析缸中，使层析缸内的气体达到饱和状态，展开剂的深度以不要没过点样点为宜；
[0131]
(3)将未点样的硅胶板置于110℃烘箱，活化20min后，取出硅胶板并冷却至室温，在距离硅胶板底部1.5cm处用铅笔划线，并标记出点样点的位置。
[0132]
(4)用毛细管蘸取样品进行点样，点样量为1μl，每次点样需等前次点样样品完全干燥后才能进行重复点样，待点样完成，将硅胶板置于层析缸中，开始展开；
[0133]
(5)展开完成后，将硅胶板置于室温干燥，干燥后放入显色剂中数秒后立即取出并置于90℃烘箱加热30min进行显色。
[0134]
(二)实验结果
[0135]
1、最适反应温度与温度稳定性
[0136]
由图6a可看出该碱性木聚糖酶的最适反应温度为50℃，在35-50℃之间，相对酶活性均大于60％。温度稳定性结果如图6b，在50℃以下时，酶的稳定性较好，大于50℃时，酶活力逐渐下降。
[0137]
2、最适反应ph与ph稳定性
[0138]
由图7a中可看出，该酶的最适反应ph为8左右，为一典型的碱性木聚糖酶。将适量稀释的纯酶液放置在不同的ph下保温1h，随后在ph9.0下反应20min测定其酶活力。ph稳定性结果如图7b，从图中可知，在ph6.5～10.5之间，该酶的相对酶活力均在80％以上，说明该酶ph稳定性良好，具有既耐酸又耐碱的强抗逆特性，符合造纸和洗涤等工业用酶的基本要求，具有良好的工业应用前景。
[0139]
3、金属离子和表面活性剂对酶活力的影响
[0140]
取1ml的反应底物加入20ul的金属离子(终浓度为10mmol/l)及100ul酶液，测定酶活力，考察金属离子对重组内切木聚糖酶xynwl6酶活力的影响。图8中可以看出li
2+
、ag
+
和ca
2+
对酶活力基本无影响；mg
2+
和ni
+
对酶活有一定程度的促进作用；mn
3+
、edta、sds则对酶活有抑制作用。co
+
、cu
2+
和ag
+
对酶活影响很小。可见该酶具有耐多种金属离子和表面活性剂的优良特性。
[0141]
4、洗衣液对酶活力的影响
[0142]
在适量纯酶液中加入一定量的市售洗衣液使其反应终浓度为2％、4％、6％、8％、10％，37℃保温30min，然后加入1ml反应底物测定其酶活力。图9可见，xynwl6在2％～4％浓度的洗衣液中，能维持50％以上的活性，显示在洗涤剂等工业中良好的应用价值。
[0143]
5、木聚糖酶水解产物分析
[0144]
分析结果如图10所示，其中s1～s3依次为xynwl6木聚糖酶在50℃、ph8.0的条件下与底物反应12h，24h，48h的结果，可以看出，榉木木聚糖的主要水解产物都是木二糖和木三糖等木寡糖，而几乎不产木糖，符合内切木聚糖酶的酶学特征。
[0145]
实施例4
[0146]
(一)实验材料
[0147]
菌种：实施例1获得的白蚁菌isoptericola sp.wl6。
[0148]
(二)实验方法
[0149]
1、基因组的提取
[0150]
使用生工细菌基因组dna快速抽提试剂盒进行基因组dna的提取，步骤如下：
[0151]
(1)取1ml过夜培养的细菌菌液，加入1.5ml离心管中，室温8,000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。加入180μl溶菌酶溶液(使用前将相应的溶菌酶加入到enzymaticlysis buffer中，配置成20mg/ml的溶菌酶溶液)重悬菌液，37℃水浴30～60min，再加入400μl buffer digestion，震荡混匀。65℃水浴1h至细胞完全裂解。
[0152]
(2)加入200μl bufferpb，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。
[0153]
(3)室温10000rpm离心5min，将上清液(500～550μl)转移到新的1.5ml离心管中。
[0154]
(4)加入等体积的异丙醇，颠倒5～8次使之充分混匀，室温放置2-3min。室温10000rpm离心5min，弃上清。
[0155]
(5)加入1ml 75％乙醇，颠倒漂洗1～3min，10000rpm离心2min，弃上清，并重复步骤一次。
[0156]
(6)开盖室温倒置5～10min至残留的乙醇完全挥发，得到的dna用50～100μl te buffer溶解。提取的dna可立即进行下一步实验或-20℃保存。
[0157]
2、保守基因序列及侧翼序列的克隆
[0158]
2.1、木聚糖酶基因保守序列的克隆(touch down pcr)
[0159]
(1)保守序列引物的设计
[0160]
设计引物使用软件primerpremier5.0。首先在cazy数据库中检索并下载所有与isoptericola sp同属的g10木聚糖酶基因，随后使用dnaman软件对该属的木聚糖酶基因进行多序列比对以此获取该属的g10木聚糖酶保守序列。根据比对结果设计上游引物(ctctggaagccnayncmrtsna)和下游引物(gactgggaygtngtnaayga)克隆isoptericola sp.中未知的g10家族木聚糖酶基因。
[0161]
(2)touch down pcr扩增反应
[0162]
使用pcr扩增试剂盒，按下述体系配制反应液(总体积25ul)：
[0163]
10
×
pcr混合液酶20ul、上游引物、下游引物和基因组dna各2ul，去离子水补足至25ul。
[0164]
扩增反应程序如下：
[0165]
94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，此后每个循环退火温度降低1℃，共12个循环，即退火温度从55℃降落到43℃；94℃变性30s，43℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环，72℃延伸7min；4℃保存。扩增结束后采用1％琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行检测。
[0166]
(3)touch down pcr产物的回收
[0167]
pcr产物回收使用的是ag公司生产的steady pure pcr dna purification kit，主要回收步骤如下：
[0168]
a.在蓝光灯下切出含有目的dna条带的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，此时应注意尽量切除不含目的dna部分的凝胶，减小凝胶体积，提高dna回收率，之后放入ep管中。切胶后向胶块中加入凝胶溶解液buffer mb。每100mg凝胶加入3～5倍体积的buffer mb
[0169]
b.37℃溶解胶块5～10分钟。加热溶解期间应每隔2分钟将离心管取出颠倒混匀，
使胶块充分溶解。凝胶溶解完毕后，将溶液静置恢复至室温。
[0170]
c.将上述溶液转移至dna fragment mini column中，室温静置1min后，室温下12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
[0171]
d.向mini column中加入750ul的buffer wb，室温12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
[0172]
e.重复步骤(4)一次。
[0173]
f.将mini column安置于新的2ml collectiontube上，室温12,000rpm离心2分钟。
[0174]
g.将mini column安置于新的1.5ml的离心管上，在mini column膜的中央处加入50μl elution buffer或灭菌水，室温静置1分钟。
[0175]
h.室温12,000rpm离心2分钟洗脱dna。
[0176]
2.2、e.coli dh5α感受态细胞的制备
[0177]
(1)蘸取实验室保存的菌种dh5α在lb平板上划线涂布，待长出单菌落将其接种于10ml液体培养基中，37℃，200rpm摇床过夜培养；
[0178]
(2)取过夜摇床的菌液0.5ml，加入50ml lb液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养，待od600nm在0.3～0.6时，将菌液收集起来，放置在冰上；
[0179]
(3)4℃，5600rpm离心10min，去掉上清液后加入10ml冰预冷的0.1mol/l cacl2，并用枪头小心悬浮菌体，冰浴；
[0180]
(4)重复步骤3；
[0181]
(5)加入1.5ml 0.1mol/l cacl2和0.5ml 60％甘油轻轻悬浮菌体，分装在1.5ml离心管中，每管100ul，于-80℃保存备用。
[0182]
2.3、touchdown pcr产物的ta克隆
[0183]
(1)将回收的pcr产物4μl与1μl的克隆载体pmd-19t和5μl solution i混匀，16℃水浴连接3h。
[0184]
(2)从-80℃冰箱中取100μl感受态细胞悬液，冰中使其解冻。
[0185]
(3)将连接好的产物加入感受态细胞中小心混匀，冰上放置半小时。
[0186]
(4)42℃水浴中热激90s，之后迅速置于冰上冷却15～30min。
[0187]
(5)加入1ml lb液体培养基(含amp)，37℃、250rpm恒温摇床培养1h。(6)于6000rpm条件下，将培养菌液离心5min，去除部分上清后混匀。取100ul涂布于含amp的平板上，37℃过夜培养。
[0188]
(7)用灭菌的枪头挑选落，放于1ml含amp的lb液体培养基中，37℃、250rpm过夜摇菌，并送去测序，加入甘油-80℃保藏。
[0189]
3、木聚糖酶基因保守序列上下游基因的克隆
[0190]
3.1、上游基因的克隆
[0191]
为获得到木聚糖酶完整的基因序列，使用基因步移的方式，对已知序列上下游未知序列进行扩增，拼接后获取完成的基因。使用primerpremier5.0软件根据已知保守序列设计三段相互嵌套的引物(usp)，与通用巢式兼并引物(fp)用于fpni-pcr三轮反应。
[0192]
表3 fpni-pcr中的fp引物和通用引物
[0193][0194][0195]
表4fpni-pcr中的嵌套引物
[0196][0197]
fpni-pcr第一轮反应：
[0198]
使用高度兼并的8条融合简并引物以细菌基因组为模板，分别与基因特异性引物usp1完成pcr反应，获得的pcr产物作为第二轮pcr反应的模板。
[0199]
表5第一轮fpni-pcr反应的扩增程序
[0200][0201]
fpni-pcr第二轮反应：
[0202]
将第一轮pcr反应产物稀释100倍后，作为第二轮反应的模板，使用fsp1引物与usp2引物进行第二轮pcr反应
[0203]
表6第二轮fpni-pcr反应的扩增程序
[0204][0205]
fpni-pcr第三轮反应：
[0206]
第三轮的pcr反应液是将第二轮反应的产物稀释100倍后作为模板，同样，将fsp1
引物替换成fsp2引物、将usp2引物替换成usp3引物，反应结束后，取适量反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0207]
表7第三轮fpni-pcr反应的扩增程序
[0208][0209]
3.2、下游基因的克隆
[0210]
将usp1、usp2和usp3分别换成dsp1、dsp2和dsp3，依照fpni-pcr克隆上游基因的方法进行下游基因的克隆。反应后对第三轮pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。将fnpi-pcr产物回收测序fnpi-pcr产物的连接转化和测序步骤与touchdownpcr产物的回收测序步骤相同。
[0211]
3.3、木聚糖酶基因全长序列拼接
[0212]
根据fnpi-pcr克隆得到的保守序列上下游基因的测序结果，将序列提交至ncbi基因数据库进行blastn比对，匹配数据库中已知的内切木聚糖酶上下游基因片。随后将测序得到的基因上游片段、保守序列片段、基因下游片段进行拼接，得到木聚糖酶基因全长序列。以isoptericolasp.wl6的基因组为模板，使用上游引物f1：5
′‑
atgcgtccgcacccgg-3
′
和下游引物r1：5
′‑
agtcaaccggtggtacac-3
′
进行常规pcr，回收pcr产物送去生工测序，得到含木聚糖酶基因全长。
[0213]
(三)实验结果
[0214]
1、isoptericola sp.wl6的基因组提取
[0215]
使用genray公司的细菌基因组提取试剂盒提取isoptericola sp.wl6的基因组，之后使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图11所示，可以看出基因组的大小在10kb以上，可进行下步实验。
[0216]
2、木聚糖酶基因保守序列的克隆结果
[0217]
2.1、运用touch down pcr克隆保守序列得到的产物
[0218]
在cazy数据库中比对已知的10家族木聚糖酶保守序列，根据保守序列比对结果设计上、下游引物。利用该引物对进行touch down pcr反应，结果扩增到了xynwl6木聚糖酶基因的保守序列。在进行琼脂糖凝胶电泳检测之后，得到如图12所示的泳道1和2中约为240bp的条带。符合参考比对的10家族木聚糖酶基因保守序列大小，随后对该条带进行切胶回收。回收产物经测序后得到一条232bp的序列，其核苷酸序列如seq id no：2所示。
[0219]
将该编码序列在ncbi数据库上进行blastx比对，发现该保守序列与同为10家族的木聚糖酶endo-1,4-beta-xylanase[isoptericola haiaiotoierans]基因片段相似性为88％，初步推断克隆得到的xynwl6保守序列所在的基因隶属于gh10家族木聚糖酶基因。
[0220]
3、运用fnpi-pcr克隆保守序列上游基因
[0221]
使用3个嵌套的特异性引物dsp和8个融合简并引物进行xynwl6木聚糖酶基因保守序列的上游基因扩增，fnpi-pcr扩增产物的电泳图如图13所示。从该结果可以看出，经过3轮交错式热不对称pcr之后，选取若干条约1000bp的特异性条带，将其切胶回收后进行测序，测序结果过经ncbi数据库blastx比对，获得上游未知目的片段。
[0222]
4、运用fnpi-pcr克隆保守序列下游基因
[0223]
下游基因片段获取方式同上，上游基因与保守序列下游基因拼接成一段完成的基因序列，fnpi-pcr扩增产物的电泳图如图14所示。。
[0224]
5、xynwl6全基因序列拼接
[0225]
将fnni-pcr扩增出的上下游未知序列测序后进行blast比对找到对应的orf片段，与touchdown-pcr扩增出来的保守序列进行拼接，获得一段,以atg开头，tga结尾的长度为1443bp的基因，如seq id no：3所示。
[0226]
将基因序列翻译为氨基酸序列后，其序列如seq id no：4所示，将该氨基酸序列在ncbi数据库上进行比对(blastx)，比对结果如图15所示，发现该保守序列与同为10家族的木聚糖酶isoptericola halotolerans wp171782838.1，具有77％的相似性，初步推断编码该氨基酸序列的基因为10家族新的木聚糖酶(新的木聚糖酶蛋白)。
[0227]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种白蚁菌，其特征在于：名称为isoptericola sp.wl6，保藏编号为cctcc no:m 20221888，于2022年12月07日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。2.一种碱性木聚糖酶的制备方法，其特征在于：所述的碱性木聚糖酶按照下述方法制得：(1)粗酶液的制备将白蚁菌isoptericola sp.wl6在发酵培养基中进行液体发酵，离心取上清液，经过滤，透析，即得粗酶液，用于离子交换层析；(2)碱性木聚糖酶的分离纯化(a)层析柱的装填在规格为φ2.6cm
×
30cm的层析柱中倒入100ml搅拌均匀的阴离子交换层析介质q-sepharose fast flow层析凝胶，随后将层析柱安装至ge healthcare快速蛋白层析系统；用去离子水以2ml/min的流速冲洗层析柱15min，随后用5～6倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡，待a280紫外吸收峰基线稳定后封闭柱头，完成层析柱的装填；(b)内切木聚糖酶的阴离子离子交换层析将装填好的层析柱安装至ge healthcare快速蛋白层析系统，以ph6.5的tris-hcl溶液为平衡缓冲液，ph6.5，含1m nacl的tris-hcl溶液为洗脱缓冲液，进行蛋白的分离纯化；上样前使用5～6倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡，待平衡缓冲液将a280基线冲洗稳定后，取5ml经0.22nm微孔滤膜过滤后的发酵液上样，继续用平衡缓冲液洗至穿透峰出现，待a280基线平稳时，转换为洗脱缓冲液，以不同的盐浓度梯度冲洗层析柱进行梯度洗脱；使用2ml ep管分别收集不同盐浓度紫外吸收峰下的洗脱液，并使用dns法对各管洗脱液进行木聚糖酶活检测；(c)粗酶液的脱盐处理使用脱盐柱，将收集到的粗酶液进行脱盐，将脱盐柱安装至ge healthcare快速蛋白层析系统，使用5～6倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡，待平衡缓冲液将离子浓度基线冲洗稳定后，取10ml经0.22nm微孔滤膜过滤后的粗酶液上样，继续使用平衡缓冲液进行洗脱至a280基线出现波动时，取20ml离心管收集a280洗脱液，待离子浓度基线升高时停止接样，得到碱性木聚糖酶粗酶液；将粗酶液进行sds-page蛋白电泳分析，4℃保存，用于后续的凝胶过滤层析；(d)碱性木聚糖酶的凝胶过滤层析将粗酶液倒入10kda超滤浓缩管进行进行超滤浓缩后，使用预装柱superdex200将粗酶液再次进行分离；缓冲体系为ph 8.0的去离子水，用5～6倍柱体积的缓冲液将a280基线冲洗稳定后，取500ul浓缩酶液上样，待a280洗脱峰出现时使用ep管进行接取；收集洗脱峰液，即纯酶液，进行酶活检测和蛋白电泳分析，并保存用于后续酶学性质研究。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的液体发酵的条件为在37℃，200rpm的培养条件下发酵7d。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的离心的条件为于4℃，12000rpm高速冷冻离心25min。5.根据权利要求2所述的碱性木聚糖酶的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的过滤为经0.45μm滤膜过滤。6.权利要求1所述的白蚁菌在造纸、洗涤工业中的应用。

技术总结
本发明提供了一种白蚁菌及其产生的碱性木聚糖酶和应用。本发明筛选得到的白蚁菌Isoptericolasp.WL6属于嗜碱的极端微生物，可在高碱性条件下(pH9.0)培养，具有可有效抑制杂菌污染，有利于大规模的发酵生产的特点。本发明的白蚁菌Isoptericola sp.WL6产生的碱性木聚糖酶蛋白分子量为43kD左右，酶学特性研究显示，其最适反应温度为50℃，最适反应pH为8左右，特别是在pH6.5～10.5之间，该酶的相对酶活力均在80％以上，说明该酶pH稳定性良好，具有既耐酸又耐碱的强抗逆特性，符合造纸和洗涤等工业用酶的基本要求，具有良好的工业应用前景。景。景。


技术研发人员：刘森林 张文斌 陈伟钊
受保护的技术使用者：深圳大学
技术研发日：2023.01.13
技术公布日：2023/8/4