一种抗吡蚜酮的单克隆抗体及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种抗吡蚜酮的单克隆抗体，本发明还涉及该单克隆抗体在检测吡蚜酮中的应用以及一种检测农产品中吡蚜酮残留的酶联免疫方法。


背景技术：

2.吡蚜酮(py)属三嗪酮类杀虫剂，对害虫具有触杀作用，昆虫一旦接触到该类药剂，就会产生“口针穿透阻塞”效应，立即停止取食，最终因饥饿而死，多用于蔬菜、小麦、水稻、棉花、果树，可有效防治各种蚜虫、飞虱、粉虱、叶蝉等多种害虫。虽然吡蚜酮效果显著，使用后虫害能够得到有效控制，但不排除该农药的残留会对人、畜构成威胁，已有相关研究表明烟碱类杀虫剂会干扰蜜蜂归巢，对哺乳动物的生殖有负面影响，对呼吸道造成刺激。日本、欧盟、美国等对吡蚜酮在农作物中的最高允许残留量均已作出明确规定，其中，日本规定了西兰花等31种农作物中吡蚜酮的最大残留限量为0.02～3.00mg/kg，欧盟规定吡蚜酮在农作物中的mrl不得超过0.02mg/kg，美国为0.02～0.6mg/kg。我国食品安全国家规定标准gb2763-2019《食品中农药最大残留限量》中规定吡蚜酮mrl小麦中为0.02mg/kg，糙米中为0.20mg/kg，燕麦为0.10mg/kg。
3.现今常用检测吡蚜酮农药残留的方法为色谱法，包括高效液相色谱法(hplc)、液质联用(lc-ms)等的仪器方法，但这些方法需要昂贵的仪器、专业的操作人员，且样品前处理复杂、成本高、时间长、不能实现大量样品的快速检测，因此，建立快速、灵敏、价廉的吡蚜酮检测方法具有重要意义。酶联免疫分析法(elisa)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。elisa方法主要依赖于灵敏度高、特异性好的抗体，然而目前缺少针对吡蚜酮的抗体。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种抗吡蚜酮的单克隆抗体，将其用于吡蚜酮的酶联免疫检测，具有特异性强、灵敏度高等优点。
5.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.首先，本发明合成了一种吡蚜酮半抗原，其结构式如下：
[0007][0008]
抗原决定抗体，本发明所使用的半抗原在此之前没有人使用过。
[0009]
将以上半抗原与载体蛋白偶联，分别得到免疫原和包被原。
[0010]
所述的载体蛋白可以是牛血清蛋白(bsa)或卵清蛋白(ova)，但不局限于这两种蛋白。
[0011]
利用免疫原免疫小鼠，对小鼠脾脏进行细胞融合，然后经过亚克隆筛选得到杂交瘤细胞，再采用体内诱生腹水法获得单克隆抗体。
[0012]
本发明筛选到一株杂交瘤细胞py-d8，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c20222366。
[0013]
该单克隆抗体能特异性识别吡蚜酮，对其它三嗪酮类农药没有交叉反应，且该单克隆抗体对吡蚜酮有很高的识别能力。
[0014]
进一步地，本发明还利用该单克隆抗体开发了检测吡蚜酮的试剂盒和一种酶联免疫方法。
[0015]
所述的试剂盒是用于检测吡蚜酮的酶联免疫试剂盒，其中包含以上所述的单克隆抗体。
[0016]
所述的酶联免疫方法可用于检测食品中的吡蚜酮残留，该方法包括以下步骤：
[0017]
(1)将以上所述的半抗原与载体蛋白偶联得到包被原；
[0018]
(2)将步骤(1)的包被原稀释后包被固相载体；
[0019]
(3)利用保藏号为cctcc no:c20222366的杂交瘤细胞py-d8制备单克隆抗体；
[0020]
(4)将单克隆抗体稀释后配制成单克隆抗体工作液；
[0021]
(5)将待测样品用有机溶剂提取并配制成待测样品溶液；
[0022]
(6)向固相载体中加入待测样品溶液和单克隆抗体工作液并进行孵育；
[0023]
(7)接着加入酶标二抗并进行孵育；
[0024]
(8)加入底物液和终止液，用酶标仪测定od值并计算含量。
[0025]
其中，所述包被原稀释后的浓度为0.25μg/ml。
[0026]
所述单克隆抗体工作液的浓度为4μg/ml。
[0027]
当待测样品是鱼肉、鸡肉、小龙虾、西兰花、卷心菜，所述提取溶剂是含有氨水的乙腈；当待测样品是玉米、大米、小麦，所述提取溶剂是二氯甲烷。
[0028]
所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg。
[0029]
所述载体蛋白是ova。
[0030]
本发明通过对检测条件进行优化，进一步提高了检测准确性和灵敏度，最终本发明建立的方法检测范围可达2.5～40ng/ml，方法的ic50为10ng/ml，灵敏度高于大多数目前已知的方法。
[0031]
本发明的有益效果是：
[0032]
本发明提供的抗体和检测方法具有灵敏度高、特异性强的特点，能更好地应用于农产品中的吡蚜酮残留检测，防止农药进入人体产生安全无危害。本发明还具有检测效率高，操作简便快速等优点，适用于大量样本的现场快速检测。
附图说明
[0033]
图1为间接竞争酶联免疫方法(ic-elisa)检测吡蚜酮的标准抑制曲线。x轴为吡蚜酮标准溶液浓度，y轴为标准品溶液的光密度值除以空白孔的光密度值(b/b0)。
具体实施方式
[0034]
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的
精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0035]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037]
实施例1、免疫原和包被原的合成
[0038]
1.制备吡蚜酮半抗原
[0039]
将1mol氨基三嗪酮盐酸盐溶解在3-4mol n，n-二甲基甲酰胺中，加入1.1mol 5-甲酰基吡啶-3-羧酸，反应体系60℃加热回流4～6小时，待反应体系冷却至室温，氮吹除去n，n-二甲基甲酰胺后得到吡蚜酮半抗原。反应式如下：
[0040][0041]
经高分辨质谱进行结构鉴定，所得化合物确为目标产物。
[0042]
2.制备吡蚜酮完全抗原
[0043]
1)将20μmol吡蚜酮半抗原溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入60μmol二环己基碳二亚胺和60μmol n-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌18-24小时得到a液；
[0044]
2)将载体蛋白(bsa)溶于碳酸盐缓冲液(ph值7.0)中，得到载体蛋白浓度为5mg/ml的b液；
[0045]
3)将上述a液滴加到b液中并于4℃搅拌10-12小时，得到c液；
[0046]
4)将c液置于透析袋并于磷酸缓冲液中透析，每8小时换液一次，共透析12次，收集透析袋中的溶液，即为免疫原溶液，﹣20℃保存。
[0047]
3.制备吡蚜酮包被抗原：
[0048]
用ova代替bsa，其它步骤同上，得到吡蚜酮包被抗原。
[0049]
实施例2吡蚜酮单克隆抗体的制备
[0050]
1.动物免疫
[0051]
用实施例2制备的吡蚜酮完全抗原免疫balb/c小鼠，四次免疫后第7天采尾尖静脉血清进行检测，判断所制备的吡蚜酮抗原是否具有免疫活性。
[0052]
选择的5～6周龄的balb/c小鼠进行免疫，将以上制得的1mg/ml的完全抗原与等量弗氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫小鼠，每只100μl。首次免疫采用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，冲刺免疫时与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；第一次免疫和第二次免疫间隔3周，加强免疫间隔为2周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在冲击免疫后3天冲刺免疫，准备融合。
[0053]
2.细胞融合
[0054]
在冲刺免疫三天后，按照常规peg(分子量为2000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用匀浆器适度研磨并通过40μm细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用rpmi-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀
释到一定体积，计数，备用；
[0055]
收集sp2/0细胞：融合前7-10天，将sp2/0瘤细胞用含10％pan(胎牛血清)rpmi-16 40培养基在5％co2培养箱中培养。融合前要求sp2/0瘤细胞数量达到1-4x107，保证融合前sp2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；
[0056]
将脾细胞和sp2/0细胞按照计数比1：10的比例混合，离心后用50％peg融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入rpmi-1640基础培养液，离心后悬浮于含20％胎牛血清、2％的50
×
hat的rpmi-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5％co2的培养箱中培养。
[0057]
3.细胞筛选
[0058]
在细胞融合的第3天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清、1％的100
×
ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接elisa筛选出阳性细胞孔，第二步以吡蚜酮作为标准品，用间接竞争elisa对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得一株产生吡蚜酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株。申请人将其命名为py-d8，并于2022年12月9日保藏于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctcc.no:c20222366。
[0059]
4.单克隆抗体的制备
[0060]
取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1
×
106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，采用购自servicebio公司的鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对本发明所得到的单克隆抗体的亚型进行鉴定，测定结果为igg1亚型。经过bca蛋白浓度试剂盒测定，该抗体的浓度为33.3mg/ml。收集的腹水放置于-20℃冰箱保藏。
[0061]
实施例3ic-elisa操作程序及检测条件优化
[0062]
1试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配制)；
[0063]
磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，pbs，ph 7.4)：称取8.00g nacl，0.20gkh2po4，2.90g na2hpo4·
12h2o，0.20g kcl，少量去离子水溶解，定容至1000ml(注：文中未注明ph情况下，所述pbs均为ph 7.4)；
[0064]
包被液：称取1.59g na2co3，2.93g nahco3，少量去离子水溶解，定容至1000ml；
[0065]
洗涤液：8.0g nacl，0.2g kh2p04，2.9g na2hpo4·
12h2o，0.2g kcl，0.5ml tween 20，加三蒸水至1000ml，调节ph至7.4；
[0066]
封闭液：称取卵清蛋白10.00g溶于1000ml磷酸盐缓冲液中；
[0067]
底物a液：称取160mg tmb，加入10ml二甲基乙酰胺溶解混匀；
[0068]
底物b液：称取13.70g柠檬酸，10.14g柠檬酸三钠和282.00mg过氧化氢脲，少量去离子水溶解，定容至1000ml；
[0069]
底物混合液：吸取10ml底物b液，加入100μl底物a液，混匀，现配现用；
[0070]
终止液：量取100ml浓硫酸，缓慢滴加到800ml去离子水中；
[0071]
2包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定
[0072]
根据方阵滴定法初步确定包被原浓度和抗体工作浓度。选择上述合成的包被原进
行包被，用cbs稀释成4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml 6个浓度，然后将每种浓度纵向加入酶标板中，每孔100μl，4℃包被过夜，洗涤3次。酶标孔内加入250μl1％ova溶液，37℃孵育2h后取出，洗涤3次。酶标孔内加入50μl pbs，用pbs将实施例2制备的单克隆抗体分别稀释成8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml共6个浓度，横向加入酶标板，每孔50μl，于37℃孵育40min后取出，洗涤3次。用pbs将hrp标记羊抗鼠二抗稀释成工作浓度1:10000(批号pa174421，赛默飞世尔科技有限公司)，每孔100μl，37℃孵育40min后取出，洗涤3次。向酶标孔中加入100μl的显色液，37℃避光显色15min，加入50μl终止液，用酶标仪在450nm波长下测定光密度值(od值)，选择od值接近2.0，与相邻孔od值差异较显著的孔对应的抗原包被浓度和抗体稀释度组合。
[0073]
实验结果如表1所示，通过方阵滴定确定包被浓度为0.25μg/ml，抗体工作浓度为4μg/ml时，空白孔od
450
值为2.047，与邻近值相差较大，再进行下一步的优化。
[0074]
表1吡蚜酮单克隆抗体方阵滴定
[0075][0076][0077]
3包被抗原浓度和抗体工作浓度的确定
[0078]
根据表1结果，另选几组od
450
值在2.0左右的包被抗原浓度和抗体工作浓度的组合，组合如表2所示。结果如表2所示，包被抗原浓度为0.25μg/ml，抗体工作浓度为4μg/ml时，ic
50
值最低，因此确定最佳包被浓度为0.25μg/ml，最佳抗体工作浓度为4μg/ml。
[0079]
表2包被抗原浓度和抗体工作浓度的确定
[0080]
包被抗原浓度(μg/ml)抗体工作浓度(μg/ml)ic
50
值(μg/l)4235.502215.200.25410.20
[0081]
4标准曲线的建立
[0082]
将吡蚜酮(py)配制成2.5、5、10、20、40μg/l 5个系列标准浓度，按照已经优化的ic-elisa条件建立吡蚜酮标准曲线。以吡蚜酮溶液浓度的对数值为横坐标，b/b0为纵坐标绘制标准曲线并计算ic
50
值。结果如图1所示。标准曲线的回归方程为y＝0.87209-0.37919x，r2＝0.9961，ic
50
值为9.58
±
0.60μg/l，线性范围为2.5-40μg/l。
[0083]
实施例4交叉反应率试验
[0084]
将苯嗪草酮、环嗪酮、嗪草酮、啶虫脒、烯啶虫胺、吡虫啉这6种三嗪酮类杀虫剂配
制成适当浓度，按照优化好的ic-elisa条件分别建立该类药物的标准曲线并计算ic
50
，以吡蚜酮准品的ic
50
值为标准，比较并计算其他化合物的交叉反应率。结果如表3所示，该抗体对这6种三嗪酮类杀虫剂均无交叉反应而不能被识别。
[0085]
表3单克隆抗体对6种三嗪酮类杀虫剂的交叉反应率
[0086][0087][0088]
ni表示在2000μg/l的分析物中未观察到抑制作用。
[0089]
实施例5elisa试剂盒的组装
[0090]
1.本发明elisa试剂盒由下述部分组成；
[0091]
1)包被有吡蚜酮包被原的固相载体(酶标板)；
[0092]
2)吡蚜酮标准溶液5瓶，浓度分别为2.5、5、10、20、40μg/l；
[0093]
3)杂交瘤细胞py-d8分泌的单克隆抗体浓缩液400μg/ml；
[0094]
4)辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鼠igg抗体工作液；
[0095]
5)浓缩磷酸盐缓冲液：80.0g nacl，2.0g kh2p04，29.0g na2hpo4·
12h2o，2.0g kcl，加去离子水至1000ml；
[0096]
6)浓缩洗涤液：80.0g nacl，2.0g kh2p04，29.0g na2hpo4·
12h2o，2.0g kcl，加双蒸水至1000ml；5ml tween 20，加去离子水至1000ml；
[0097]
7)底物a液：准确称取160mg tmb，加入10ml二甲基乙酰胺溶解混匀；
[0098]
8)底物b液：准确称取13.70g柠檬酸，10.14g柠檬酸三钠和282.00mg过氧化氢脲，少量去离子水溶解，定容至1000ml；底物混合液：准确吸取10ml底物b液，加入100μl底物a液，混匀，现配现用；
[0099]
9)终止液：准确量取100ml浓硫酸，缓慢滴加到800ml去离子水中；
[0100]
2.酶标板的制备
[0101]
用包被液将包被原稀释成0.25μg/ml，每孔加入100μl，4℃过夜孵育。甩去包被液，每孔加入250μl pbst洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入1％ova封闭液200μl，37℃孵育2h，倾去孔内液体，洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。
[0102]
实施例6酶联免疫试剂盒的测定程序
[0103]
1.试剂的配制
[0104]
1)样品提取液：取2ml氨水，加入1000ml乙腈，混匀。
[0105]
2)磷酸盐缓冲液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用去离子水稀释10倍后使用。
[0106]
3)洗涤液：将试剂盒中提供的洗涤液用三蒸水稀释10倍后使用。
[0107]
4)单克隆抗体工作液：将单克隆抗体浓缩液用磷酸盐缓冲液稀释100倍(终浓度为4μg/ml)
[0108]
2.样品前处理
[0109]
鱼肉、鸡肉、小龙虾、西兰花和卷心菜：取4g的匀浆物于50ml离心管中，加入20ml样品提取液，加入4.0g氯化钠，震荡5min，静置20min，在8000r/min离心10min，取上清液15ml，置于氮气吹干仪上吹干。然后加1ml正己烷复溶，加入3ml pbs，混匀，静置5min，取下层水相进行检测。
[0110]
玉米、大米和小麦：取4g的匀浆物于50ml离心管中，加入20ml二氯甲烷，加入4.0g氯化钠，震荡5min，静置20min，在8000r/min离心10min，取上清液15ml，置于氮气吹干仪上吹干。然后加1ml正己烷复溶，加入3ml pbs，混匀，静置5min，取下层水相进行检测。
[0111]
3.测定步骤
[0112]
1)加样：向酶标板微孔中加入吡蚜酮系列浓度标准溶液或样品提取液50μl，然后加入单克隆抗体工作液50μl，置于湿盒中，37℃恒温孵育40min；
[0113]
2)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μl洗涤3次并拍干；
[0114]
3)加辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鼠igg抗体工作液：每孔中加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鼠igg抗体工作液100μl，置于湿盒中，37℃恒温孵育40min；
[0115]
4)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μl，洗涤3次并拍干；
[0116]
5)加底物：每孔中加入底物混合液100μl，置于湿盒中，37℃恒温孵育15min；
[0117]
6)加终止液：每孔中加入终止液50μl；
[0118]
7)测定：用酶标仪在450nm波长处测定每孔的光密度值(od值)。
[0119]
4.结果判断
[0120]
标准曲线：
[0121]
以所测定的标准品od值除以空白孔od值(b/b0)为纵坐标，药物浓度的对数值为横坐标作标准曲线，并进行线性回归，得出回归方程。
[0122]
样品中吡蚜酮的浓度计算：
[0123]
计算样品的抑制率(所获得的样品的od值除以空白孔od值)，代入标准曲线的回归方程中，计算出样品中吡蚜酮的浓度。
[0124]
实施例7试剂盒的灵敏度、精密度、准确度、重复性试验
[0125]
1试剂盒的灵敏度试验；
[0126]
以标准曲线的ic
50
值和西兰花、卷心菜、小麦、玉米、大米、鸡肉、鱼和小龙虾最低检测限(lod)作为本发明检测试剂盒的灵敏度指标。将吡蚜酮标准品稀释成为40μg/l、20μg/l、10μg/l、5μg/l、2.5μg/l、0μg/l 6个浓度，每个浓度5个复孔，按照ic-elisa方法重复测定5次，取5次测定的ic
50
的平均值。lod通过以下步骤决定，测定20份空白西兰花、卷心菜、小麦、玉米、大米、鸡肉、鱼和小龙虾样品的od值，根据标准曲线的回归方程计算出相应的bap浓度，然后计算出吡蚜酮浓度的平均值(x)和标准差(sd)，根据公式z＝c+3
×
sd计算出西兰花、卷心菜、小麦、玉米、大米、鸡肉、鱼和小龙虾中的最低检测限，根据公式z＝c+10
×
sd计
算出西兰花、卷心菜、小麦、玉米、大米、鸡肉、鱼和小龙虾中的定量限(loq)。本发明的ic
50
值为9.58
±
0.60μg/l，吡蚜酮在西兰花、卷心菜、小麦、玉米、大米、鸡肉、鱼和小龙虾中的最低检测限详见表4。
[0127]
表4吡蚜酮的最低检测限
[0128]
样品lod(μg/kg)loq(μg/kg)西兰花2.674.49卷心菜2.504.25小麦1.663.58玉米1.623.07大米1.622.98鸡肉2.726.57鱼1.774.07小龙虾1.562.95
[0129]
2试剂盒的精密度试验
[0130]
将吡蚜酮标准品稀释成为40μg/l、20μg/l、10μg/l、5μg/l、2.5μg/l、0μg/l6个浓度，每个浓度5个复孔，按照ic-elisa方法重复测定5次，应用标准曲线的回归方程计算出各浓度标准溶液的测定值，计算板内和板间变异系数，结果见表5。
[0131]
表5标准曲线的板内及板间变异系数
[0132]
[0133][0134]
3本发明试剂盒的准确度、重复性试验
[0135]
根据残留限量向西兰花、卷心菜、小麦、玉米、大米、鸡肉、鱼和小龙虾中添加不同的药物浓度，根据公式1计算其回收率和变异系数，结果如表6所示。在八种样品的平均回收率为77％
–
103％，变异系数小于12％。
[0136]
回收率(％)＝实测浓度/添加浓度
×
100％(公式1)
[0137]
表6吡蚜酮的添加回收率
[0138]

技术特征：
1.一种抗吡蚜酮的单克隆抗体，它是由保藏号为cctcc no:c20222366的杂交瘤细胞py-d8所分泌的。2.权利要求1中所述的杂交瘤细胞py-d8，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c20222366。3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测吡蚜酮的试剂盒中的应用。4.包含权利要求1所述的单克隆抗体的试剂盒。5.如权利要求4所述的试剂盒，该试剂盒是检测吡蚜酮的酶联免疫试剂盒。6.一种检测食品中吡蚜酮残留的酶联免疫方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将半抗原与载体蛋白偶联得到包被原；(2)将步骤(1)的包被原稀释后包被固相载体；(3)利用保藏号为cctcc no:c20222366的杂交瘤细胞py-d8制备单克隆抗体；(4)将单克隆抗体稀释后配制成单克隆抗体工作液；(5)将待测样品用有机溶剂提取并配制成待测样品溶液；(6)向固相载体中加入待测样品溶液和单克隆抗体工作液并进行孵育；(7)接着加入酶标二抗并进行孵育；(8)加入底物液和终止液，用酶标仪测定od值并计算含量，所述半抗原的结构式如下：7.如权利要求6所述检测食品中吡蚜酮残留的酶联免疫方法，其特征在于：所述包被原稀释后的浓度为0.25μg/ml。8.如权利要求6所述检测食品中吡蚜酮残留的酶联免疫方法，其特征在于：所述单克隆抗体工作液的浓度为4μg/ml。9.如权利要求6所述检测食品中吡蚜酮残留的酶联免疫方法，其特征在于：当待测样品是鱼肉、鸡肉、小龙虾、西兰花、卷心菜，所述提取溶剂是含有氨水的乙腈；当待测样品是玉米、大米、小麦，所述提取溶剂是二氯甲烷。10.如权利要求6所述检测食品中吡蚜酮残留的酶联免疫方法，其特征在于：所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg。

技术总结
本发明公开了一种抗吡蚜酮的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C20222366的杂交瘤细胞PY-D8所分泌的。本发明还公开了所述抗体在制备检测吡蚜酮的试剂盒中的应用以及一种检测农产品中吡蚜酮残留的酶联免疫方法。本发明提供的抗体和检测方法具有灵敏度高、特异性强的特点，能更好地应用于农产品中的吡蚜酮残留检测，防止农药进入人体产生安全无危害。本发明还具有检测效率高，操作简便快速等优点，适用于大量样本的现场快速检测。适用于大量样本的现场快速检测。适用于大量样本的现场快速检测。


技术研发人员：彭大鹏 陈建军 殷晓阳 范小慧 任万强
受保护的技术使用者：南通优尔测生物科技有限公司
技术研发日：2023.01.06
技术公布日：2023/8/4