马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6及其应用

马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物检测领域，具体涉及马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6，还涉及单克隆抗体pvx-6的应用。


背景技术：

2.马铃薯(solanum tuberosum l.)起源于南美洲安第斯山脉，茄科，一年生草本植物，无性繁殖、块茎可粮菜兼用，是全世界最重要的高产作物之一，仅次于小麦、水稻和玉米。我国是马铃薯第一生产大国，马铃薯种植面积及总产量均居世界首位，但单产水平远低于欧美等发达国家。
3.我国在2015年实施马铃薯主粮化战略以来，马铃薯战略地位得到进一步提升，而提高脱毒种薯质量及普及率成为产业健康发展的重要保障。而马铃薯作为无性繁殖作物，感染了病毒之后的马铃薯，由于连年种植，病毒将通过块茎世代传递，导致发病率逐年增加，产量迅速下降。在田间，马铃薯病毒可以通过汁液摩擦、蚜虫传毒等方式使无毒的马铃薯感染病毒，造成马铃薯的减产、退化。马铃薯感染病毒后会终生带毒，病情随着种植代数逐年加重，最后失去种植价值。
4.长期以来，病毒病一直困扰科研工作者，目前在马铃薯作物上发现的病毒种类有40多种，还包括一种类病毒。其中pvx是马铃薯x病毒属(potexvirus)的成员，又称马铃薯普通花叶病毒或马铃薯轻花叶病毒，寄主范围较广，主要侵染茄科作物，pvx作为影响马铃薯种薯质量的主要有害生物之一，是判定马铃薯种薯质量是否合格的关键指标之一。
5.pvx单一侵染植株后，植株症状轻微花叶或潜隐，有时叶面稍有皱缩、叶缘波状，会造成少量的减产。但在田间种植时，常常发生复合侵染，当与pvy复合侵染马铃薯，症状加剧，使马铃薯产量大幅度降低，严重时可造成减产80％，导致严重的经济损失。
6.因此，建立简便、快速、灵敏、经济、准确的马铃薯病毒病检测技术，满足马铃薯种薯田间质量检测服务的需要，为马铃薯种薯质量检测认证工作的全面推进提供技术支持。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6；本发明的目的之二在于提供分泌抗马铃薯x病毒的单抗pvx-6的杂交瘤细胞；本发明的目的之三在于提供所述马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6在制备检测马铃薯x病毒的试剂盒中的应用；本发明的目的之四在于提供所述马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6在制备检测马铃薯x病毒的抗体中的应用；本发明的目的之五在于提供含有所述马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6的试剂盒。
8.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
9.1、马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6，所述单克隆抗体pvx-6包括重链和轻链，所述重链氨基酸序列如seq id no.3所示；所述轻链氨基酸序列如seq id no.5所示。
10.本发明优选的，编码所述单克隆抗体pvx-6的重链的核苷酸序列如seq id no.4所
示，编码所述轻链的核苷酸序列如seq id no.6。
11.2、分泌所述抗马铃薯x病毒的单抗pvx-6的杂交瘤细胞，其特征在于：所述杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：c2022279，分类命名为杂交瘤细胞株3d6d9b5。
12.3、所述马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6在制备检测马铃薯x病毒的试剂盒中的应用。
13.4、所述马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6在制备检测马铃薯x病毒的抗体中的应用。
14.5、含有所述马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6的试剂盒。
15.本发明优选的，所述试剂盒为elisa试剂盒、免疫化学试剂盒、免疫荧光试剂盒或western blot检测试剂盒。
16.本发明的有益效果在于：本发明公开了马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6，pvx-6重链氨基酸序列如seq id no.3所示；轻链氨基酸序列如seq id no.5所示。该抗体能够与pvx的cp蛋白(pvx-cp)和pvx病毒粒子发生特异性反应，不与pvy病毒粒子或健康植株发生反应。进一步通过das-elisa方法检测配对情况，pvx-6为包被抗体时，能与其他抗体配对成功，如pvx-1、pvx-3和pvx-6；经灵敏度检测结果表明，pvx单克隆抗灵敏度均可以达到1:10240(w/v，g/ml)倍稀释，能够作为检测马铃薯x病毒抗体和检测试剂盒。
附图说明
17.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
18.图1为pvx-cp基因片段扩增(m：2k plusii marker；1、2：pvx-cp基因片段(714bp))；
19.图2为pvx-cp表达(m：marker；1：蛋白沉淀；2：蛋白上清；3：总蛋白；4：阴性对照)；
20.图3为pvx-cp纯化(a：不同浓度咪唑洗脱pvx-cp，m：marker，1:50mm咪唑洗脱，2:100mm咪唑洗脱，3：300mm咪唑洗脱。b：pvx-cp纯化结果，m：marker，4：浓缩后蛋白)；
21.图4为western blot分析pvx单克隆抗体特异性(m：蛋白marker，1：健康马铃薯组培苗，2：感染pvx的马铃薯组培苗，3：感染pvy的马铃薯组培苗)；
22.图5为pvx单克隆抗体灵敏度分析。
23.生物保藏：
24.将分泌pvx-6和pvx-2抗体的杂交瘤细胞送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，分别命名为3d6d9b5、4c10f4f5；3d6d9b5保藏日为2022年9月1日，保藏号为cctcc no：c2022279，分类命名为杂交瘤细胞株3d6d9b5；4c10f4f5保藏日为2022年9月1日，保藏号为cctcc no：c2022280，分类命名为杂交瘤细胞株4c10f4f5。
具体实施方式
25.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
26.实施例1、病毒cp蛋白表达
27.(1)表达载体构建
28.在生物技术信息中心(national center for biotechnology information，ncbi)上检索pvx的基因序列，根据pvx的cp蛋白基因全长序列设计扩增cp蛋白基因全长的引物(表1)，将引物在ncbi上进行比对，比对后由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其中用pvx-cp-f与pvx-cp-r的引物扩增pvx-cp基因，扩增产物为714bp。
29.表1、pvx-cp扩增引物
[0030][0031]
以提取植物病毒总rna为模板，按照试剂盒的说明进行操作合成cdna，以合成的cdna为模板，以表1中的引物进行扩增，反应体系为系为50μl，cdna模板2μl，病毒上、下游引物(0.1μmol
·
l-1
)各2μl，2
×
taq酶25μl，ddh2o补足至50μl。反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次，72℃延伸10min。
[0032]
pvx-cp基因经pcr扩增后，利用琼脂糖凝胶电泳分析，检测到长度为714bp的dna片段(图1)，通过胶回收得到pvx-cp基因片段，将其连接到pet28a载体上，并转入bl21感受态细胞中，37℃倒置平板过夜培养后，挑选单克隆菌斑送至生工进行测序，经过序列比对，选择测序结果正确的菌液进行蛋白表达。
[0033]
(2)大肠杆菌中表达及纯化
[0034]
大肠杆菌中表达目的蛋白的方法如下：
[0035]
a.将测序正确的大肠杆菌菌液加入5ml的lb液体培养基中，放入37℃恒温振荡培养箱，250rpm/min过夜培养16-18h，作为种子液；
[0036]
b.按1:100转接到新鲜的200ml lb培养基中，37℃，250rpm/min条件培养，当菌液od600＝0.6时，补加iptg诱导剂，分别于18℃继续诱导培养；
[0037]
c.4℃，5000rpm/min，15min，收集菌体；
[0038]
d.将菌体用裂解buffer(50mm tris、0.5m nacl，ph 8.0)重悬后进行超声破碎。超声条件为：work 3s，off 2s，时间15min，重复一遍；
[0039]
e.超声后的样品，4℃，5000rpm/min，15min，分别取上清液和沉淀用sds-page胶进行蛋白分析，结果如图2所示。结果显示，重组蛋白pvx-cp可以表达。
[0040]
病毒cp蛋白纯化的方法如下：
[0041]
a.取培养后的菌体，加入裂解buffer(50mm tris、0.5m nacl，ph 8.0)重悬后进行超声破碎；超声条件为：work 3s，off 2s，时间15min，重复一遍；
[0042]
b.将超声破碎后的菌液于低温离心机内离心，4℃，5000rpm/min，15min，收集上清，由于上清直接挂柱，为了使其不挂柱，故向上清中加入变性剂尿素，终浓度为8m，溶解后，于4℃静置1h，离心取上清；
[0043]
c.将上述获得的上清液，用0.45μm滤膜过滤，通过ni亲和层析柱进行蛋白纯化。步骤如下：
[0044]
d.用5倍柱体积的去离子水洗涤，去除空气和20％乙醇；
[0045]
e.5～10倍柱体积buffer a平衡柱子，(buffer a：50mm tris、0.15m nacl、8m尿素，ph 8.0)；
[0046]
f.将样品以0.5ml/min的速度流穿ni柱；
[0047]
g.用buffer a平衡柱子；
[0048]
h.分别用50mm咪唑、100mm、300mm咪唑洗脱。
[0049]
i.将洗脱下来的样品分别进行sds-page胶分析是否有目的蛋白，结果如图3中a所示。
[0050]
结果显示，不同浓度的咪唑均能将病毒cp蛋白洗脱下来，且100mm、300mm洗脱下来的病毒cp蛋白纯度更高。因此选择100mm、300mm咪唑洗脱的蛋白收集后稀释透析后浓缩，并用sds-page胶检测目的蛋白纯度，结果如图3中b所示，结果显示纯度很高。
[0051]
实施例2、马铃薯x病毒单克隆抗体血清制备
[0052]
(1)免疫小鼠
[0053]
以实施例1制备的重组病毒cp蛋白为免疫原，选取健康balb/c小鼠3只。首次免疫分别使用抗原50μg，每只分别与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，腹部多点皮下注射免疫小鼠。第一次免疫后，每隔14d，用抗原50μg，每只和等体积的弗氏不完全佐剂乳化后，腹部多点皮下注射免疫小鼠，免疫3次。第三次免疫开始，每次免疫后7d进行小鼠眼眶静脉丛(或尾静脉)取血，通过间接elisa测定小鼠血液抗体效价，检测方法如下：
[0054]
(1)蛋白包被：实验组分别用elisa包被液稀释pvx、pvy抗原蛋白至5μg/ml，对照组加elisa包被液，100μl/孔，4℃包被过夜，pbst清洗2遍；
[0055]
(2)封闭：配制3％脱脂奶粉，380μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗2遍；
[0056]
(3)加样：取血清稀释至指定浓度，100μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗2遍；
[0057]
(4)二抗：兔抗鼠igg-hrp 1:1000,100μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗3遍；
[0058]
(5)显色：tmb显色液a液：b液＝1:1，100μl/孔，室温反应20min；
[0059]
(6)终止：elisa终止液，50μl/孔；
[0060]
(7)读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果，结果如表2所示。
[0061]
表2、小鼠血清效价
[0062][0063]
结果显示，2号小鼠的免疫效价最高。因此选择2号小鼠腹腔注射50μg抗原加强免疫，加强免疫3～7天，进行细胞融合实验。
[0064]
(2)病毒单克隆杂交瘤细胞制备
[0065]
细胞融合：
[0066]
a.在生物安全柜中，收集生长旺盛、形态良好的骨髓瘤细胞(sp2/0)约107个于50ml离心管中，不添加血清的dmem(glu 4.5g/l)培养基重悬，37℃培养箱预热；
[0067]
b.加强免疫后3至7天的免疫合格小鼠，无菌条件下，取脾脏研磨过筛后离心收集脾细胞；
[0068]
c.脾细胞与sp2/0混匀离心后，用融合剂peg1450进行化学融合，添加dmem终止反应；
[0069]
d.离心收集融合细胞，用添加nbs(新生牛血清)和hat的高糖dmem进行培养和筛选，约8天后用间接elisa进行融合初筛，阳性细胞孔进行融合复筛；
[0070]
e.选择稳定表达抗体的单克隆杂交瘤细胞，细胞扩大培养后，取细胞进行腹水生
产，并冻存细胞。
[0071]
细胞融合筛选
[0072]
采用bsa竞争elisa方法检测，步骤如下：
[0073]
a.蛋白包被：分别用elisa包被液稀释pvx抗原或x病毒研磨液至指定浓度，100μl/孔，4℃包被过夜，pbst清洗2遍；
[0074]
b.封闭：配制3％脱脂奶粉，380μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗2遍；
[0075]
c.加样：原倍加入细胞上清，80μl，室温孵育1h，pbst清洗2遍；
[0076]
d.二抗：兔抗鼠igg-hrp 1:1000，100μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗3遍；
[0077]
e.显色：tmb显色液a液：b液＝1:1，100μl/孔，室温反应20min；
[0078]
f.终止：elisa终止液，50μl/孔；
[0079]
g.读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果；
[0080]
h.选择生活力良好，进行第一次亚克隆。
[0081]
本次细胞融合获得20株阳性细胞，具体见表3：
[0082]
表3、2号小鼠融合筛选
[0083][0084]
细胞亚克隆筛选：
[0085]
用有限稀释法进行细胞克隆化。将阳性细胞重悬取细胞计数，以每200μl培养基含1个细胞为准则，按计数结果将阳性细胞稀释，每孔200μl加入96孔板中。7至9天后镜检观
察，标记出现单一细胞簇孔。进行间接elisa法检测阳性细胞。检测方法如下：
[0086]
a.蛋白包被：实验组分别用elisa包被液稀pvx或pvy抗原蛋白至1μg/ml，对照组加elisa包被液，100μl/孔，4℃包被过夜，pbst清洗2遍；
[0087]
b.封闭：配制3％脱脂奶粉，380μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗2遍；
[0088]
c.加样：取原倍细胞上清，80μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗2遍；
[0089]
d.二抗：兔抗鼠igg-hrp 1:1000，100μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗3遍；
[0090]
e.显色：tmb显色液a液：b液＝1:1，100μl/孔，室温反应20min；
[0091]
f.终止：elisa终止液，50μl/孔；
[0092]
g.读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果；
[0093]
h.选择稳定表达抗体的单克隆杂交瘤细胞，细胞扩大培养后，取细胞进行腹水生产，并冻存细胞。
[0094]
经过2次细胞亚克隆，仅挑选镜检单克隆和二克隆进行检测，获得6株阳性单克隆杂交瘤细胞株(表4)，进行细胞扩大培养，取细胞进行腹水生产，并冻存细胞。
[0095]
表4、亚克隆结果
[0096][0097]
(3)马铃薯病毒单克隆抗体制备
[0098]
腹水制备：
[0099]
腹腔注射致敏剂液体石蜡0.5ml/只，7天后腹腔注射阳性杂交瘤细胞，每株细胞打一只小鼠。每只小鼠注射105～106个细胞，离心收集的细胞用1
×
pbs缓冲液重悬后进行注射。直至第8天起可观察到小鼠腹腔微隆，继续饲养至腹腔涨圆到行动不便时，用引流法多次收集腹水，离心后于-80℃冻存。
[0100]
腹水纯化：取腹水，用pbs稀释并过滤(0.22μm)，取过滤后的样品，通过protein g柱进行蛋白纯化。步骤如下：
[0101]
a)用5倍柱体积的去离子水洗涤，去除空气和20％乙醇；
[0102]
b)5～10倍柱体积buffer平衡柱子，buffer：pb缓冲液；
[0103]
c)将样品以0.5ml/min的速度流穿protein g柱；
[0104]
d)用上述buffer平衡柱子；
[0105]
e)用甘氨酸洗脱，并用tris中和。
[0106]
f)收集上述甘氨酸洗脱的样品，于4℃透析(透析buffer：pbs)过夜。
[0107]
g)取透析后的样品，用超滤法(超滤管)浓缩，并用sds-page胶检测目的蛋白纯度。
[0108]
h)对纯度达到要求的抗体进行性能检测。
[0109]
单克隆抗体性能检测：
[0110]
a)蛋白包被：用elisa包被液分别稀释pvx-cp、x病毒研磨液、y病毒研磨液、健康组织研磨液，100μl/孔，4℃包被过夜，pbst清洗2遍；
[0111]
b)封闭：配制3％脱脂奶粉，380μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗2遍；
[0112]
c)加样：取pvx单克隆抗体稀释至指定浓度，100μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗2遍；
[0113]
d)一抗：兔抗鼠igg-hrp 1:1000，100μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗3遍；
[0114]
e)显色：tmb显色液a液：b液＝1:1，100μl/孔，室温反应20min；
[0115]
f)终止：elisa终止液，50μl/孔；
[0116]
g)读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果，结果如表5所示。
[0117]
表5、pvx单克隆抗体性能检测
[0118][0119]
结果显示，pvx-cp与x病毒吸光度均大于阴性对照2倍，并且y病毒不与pvx单克隆抗体产生交叉反应，pvx单克隆抗体性能可用。
[0120]
单克隆抗体特异性检测：
[0121]
a)总蛋白提取：分别取0.1g植物组织，液氮研磨，加入250μl总蛋白提取液与5μl 50
×
蛋白酶抑制剂；
[0122]
b)13000rpm，4℃离心15min，吸取上清液；
[0123]
c)上清液加入loading buffer后混匀，沸水煮10min，冷却5min，4℃13000rpm离心10min；
[0124]
d)配制10％sds-page分离胶和5％浓缩胶，加样后180v电泳至loading buffer跑出；
[0125]
e)电泳结束前将pvdf膜在甲醇中浸泡15s；
[0126]
f)电泳结束后，将胶在转膜液中浸泡15min，进行转膜。100v转膜1～1.5h；
[0127]
g)转好膜后用tbst清洗一次，用丽春红染色拍照，再用tbst清洗几次后，用tbst配制的5％脱脂奶粉进行封闭，室温封闭1h；
[0128]
h)封闭完后加入1:5000稀释的一抗，4℃孵育过夜；
[0129]
i)一抗反应完全后，用tbst进行洗膜，4次，每次15min；
[0130]
j)加入1:5000稀释的二抗，室温孵育1h；
[0131]
k)二抗反应完全后用tbst洗膜，4次，每次10min；
[0132]
l)加入ecl显色液进行拍照，结果如图4所示。
[0133]
结果显示，pvx-1、pvx-2、pvx-3、pvx-4、pvx-5和pvx-6单克隆抗体进均可以与感染pvx的马铃薯组培苗的蛋白提取液发生特异性免疫反应，不与感染pvy的马铃薯组培苗蛋白提取液发生特异性免疫反应，也不与健康的马铃薯组培苗蛋白提取液发生特异性免疫反应。
[0134]
单克隆抗体配对检测：
[0135]
a)蛋白包被：分别用elisa包被液稀释pvx单克隆抗体至1μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜，pbst清洗2遍；
[0136]
b)封闭：配制3％脱脂奶粉，380μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗2遍；
[0137]
c)加样：pvx组织500倍稀释，阴性组织500倍稀释，100μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗2遍；
[0138]
d)一抗：分别将标生物素的pvx、pvy抗体稀释至1μg/ml，100μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗2遍；
[0139]
e)二抗：avidin-hrp 1:10000，100μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗3遍；
[0140]
f)显色：tmb显色液a液：b液＝1:1，100μl/孔，室温反应20min；
[0141]
g)终止：elisa终止液，50μl/孔；
[0142]
h)读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果，结果如表5所示。
[0143]
表5、pvx单克隆抗体配对结果
[0144][0145]
注：*为配对成功
[0146]
单克隆抗体灵敏度检测：
[0147]
a)蛋白包被：用elisa包被液稀马铃薯病毒组培苗研磨液，1：10～1：163840倍梯度稀释，对照组加elisa包被液，100μl/孔，4℃包被过夜，pbst清洗2遍；
[0148]
b)封闭：配制3％脱脂奶粉，380μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗2遍；
[0149]
c)加样：取血清稀释至指定浓度，100μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗2遍；
[0150]
d)二抗：兔抗鼠igg-hrp 1:1000，100μl/孔，室温孵育1h，pbst清洗3遍；
[0151]
e)显色：tmb显色液a液：b液＝1:1，100μl/孔，室温反应20min；
[0152]
f)终止：elisa终止液，50μl/孔；
[0153]
g)读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果，结果如图5所示。
[0154]
结果显示，用pvx进行包被，应用直接elisa方法检测，pvx单克隆抗体灵敏度可以达到1:10240倍稀释。
[0155]
为确定各个单克隆抗体的灵敏度，按照上述方法，区别是分别使用不同浓度的pvx-1、pvx-2、pvx-3、pvx-4、pvx-5和pvx-6单克隆抗体的进行检测，结果如表6所示。
[0156]
表6、pvx单克隆抗体灵敏度检测
[0157][0158][0159]
结果显示，pvx-6单克隆抗体的灵敏度最高，其次为pvx-2单克隆抗体，后续选择pvx-6和pvx-2。
[0160]
对pvx-6和pvx-2进行测序，pvx-6的重链氨基酸序列如seq id no.3所示，编码该氨基酸的核苷酸序列如seq id no.4所示，pvx-6的轻链氨基酸序列如seq id no.5所示，编码该氨基酸的核苷酸序列如seq id no.6所示。pvx-2的重链氨基酸序列如seq id no.7所示，编码该氨基酸的核苷酸序列如seq id no.8所示，pvx-2的轻链氨基酸序列如seq id no.9所示，编码该氨基酸的核苷酸序列如seq id no.10所示。
[0161]
选择产生pvx-6和pvx-2抗体的杂交瘤细胞送中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，分别命名为3d6d9b5、4c10f4f5；3d6d9b5保藏日为2022年9月1日，保藏号为cctcc no：c2022279，分类命名为杂交瘤细胞株3d6d9b5；4c10f4f5保藏日为2022年9月1日，保藏号为cctcc no：c2022280，分类命名为杂交瘤细胞株4c10f4f5。
[0162]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

技术特征：
1.马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6，其特征在于：所述单克隆抗体pvx-6包括重链和轻链，所述重链氨基酸序列如seq id no.3所示；所述轻链氨基酸序列如seq id no.5所示。2.马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6，其特征在于：编码所述单克隆抗体pvx-6的重链的核苷酸序列如seq id no.4所示，编码所述轻链的核苷酸序列如seq id no.6。3.分泌权利要求1或2所述抗马铃薯x病毒的单抗pvx-6的杂交瘤细胞，其特征在于：所述杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：c2022279，分类命名为杂交瘤细胞株3d6d9b5。4.权利要求1所述马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6在制备检测马铃薯x病毒的试剂盒中的应用。5.权利要求1所述马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6在制备检测马铃薯x病毒的抗体中的应用。6.含有权利要求1所述马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6的试剂盒。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为elisa试剂盒、免疫化学试剂盒、免疫荧光试剂盒或western blot检测试剂盒。

技术总结
本发明公开了马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6及其应用，单克隆抗体PVX-6包括重链和轻链，重链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，该抗体能够与PVX的CP蛋白(PVX-CP)和PVX病毒粒子发生特异性反应，不与PVY病毒粒子或健康植株发生反应。进一步通过DAS-ELISA方法检测配对情况，PVX-6为包被抗体时，能与其他抗体配对成功，如PVX-1、PVX-3和PVX-6；经灵敏度检测结果表明，PVX单克隆抗灵敏度均可以达到1:10240(w/v，g/mL)倍稀释，能够作为检测马铃薯X病毒抗体和检测试剂盒。盒。盒。


技术研发人员：吕典秋 杨宇 琚熙三 荐红举 蒋锐 黄振霖 赵雨佳 王开周 王文华 张国栋
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：2022.11.30
技术公布日：2023/8/4