罗丹明类荧光染料及其应用

1.本发明涉及生物荧光成像技术领域，具体而言，涉及一种罗丹明类荧光染料及其应用。


背景技术：

2.随着显微镜技术的不断革新，生物荧光成像技术是目前研究生物问题的重要手段之一。普通的光学显微镜到荧光显微镜再到共聚焦显微镜，人们对成像的时空分辨率、所包含的信息要求越来越高。超分辨成像技术在2014年获得了诺贝尔化学奖之后，在纳米级别的超高分辨率下，很多未知的结构及其相互联系也随之被揭示，成像领域正式迎来了超分辨的时代。超分辨荧光成像的发展依赖与显微镜的硬件和荧光染料协同优化。例如：随机光学重建显微镜(stochastic optical resolution microscopy,storm)需要荧光染料能够在一定时间内高效多次发成光转化的性质；受激发射损耗荧光显微镜(stimulated emission depletion microscopy，sted)需要一束超强的损光来实现分辨率的降低，这无疑对染料的光稳定性有了更高的要求。
3.在此之前受限于仪器和染料的发展，很多成像的数据都来自于固定的生物样品。对于超分辨成像的未来一定是活细胞、组织水平上的长时程、大视野成像。无论是对于storm还是sted来说，反复激发染料分子或者使用超强的损耗光，不仅仅对染料本身造成损伤，对活的生物样本来说更是致命的打击。在成像过程中，产生的活细胞、组织等样品的损伤，称为光毒性。例如：在长时间观察线粒体的动态活动中，线粒体常常会随着观察时间的延长，出现肿胀变圆，继而破裂引发细胞凋亡。
4.光毒性是一种普遍现象，主要来源于发色团三线态激发态高活性物种与环境中基态的三线态氧气分子通过碰撞发生了能量的转移，从而产生了单线态氧及其他活性氧物种(reactive oxygen species,ros)。这些活性氧物种会与生物大分子如脂质、蛋白质、dna发生反应破坏其正常的生理结构和功能。光毒性这一问题无疑对荧光染料提出了一个全新维度的要求。除了要求荧光染料具有抗漂白的光稳定性，还要求其具备对样品的低光毒性来匹配活样品的生物相容性。因此降低荧光染料的光毒性的解决思路是降低荧光的三线态激发态的组分。
5.荧光染料的三线态是导致染料光漂白和光毒性的关键因素。因此降低三线态的寿命，尽可能地将处于三线态的染料拉回到基态是唯一的解决的策略，目前主要有以下几种技术：
6.1.体系除氧：在单分子体系中，为了增加染料分子的光稳定性通常会采用除氧的方式，来抑制高活性的三线态激发态染料分子与氧气发生。
7.2.成像体系中添加三线态猝灭剂(triplet state quenchers,tsqs)：三线态猝灭剂在溶剂中通过与染料分子三线态碰撞，使其发生光物理或光化学的猝灭，荧光团以一种分子间的形式受到保护。其中，光物理的三线态猝灭剂有环辛四烯(cot)，二苯基己三烯，或镍离子，它们都是通过染料和猝灭剂之间的能量转移来实现光保护作用的。光化学的三线
态猝灭剂需要一个同时具有氧化和还原能力的试剂。例如：trolox(tx)，抗坏血酸，二茂铁，对硝基苯甲醇，硝基苯丙氨酸，甲基紫精。染料的三线态是通过光致电子转移(pet)的机理被猝灭，从而形成自由基阴离子或阳离子中间体，再经过连续的氧化还原反应恢复到染料的基态。
8.3.自修复染料：现有的技术是将三线态猝灭剂环辛四烯(cot)共价连接在花菁类染料(主要是cy5、cy3)分子内部，染料的三线态会和三线态猝灭剂发生分子内的猝灭，减少了三线态-三线态的能量传递，实现染料分子自修复的能力，这类染料称为自修复染料。在除氧条件下，cy5-cot偶联物的三线态寿命在0.15μs左右，而cy5的三线态寿命约为110μs，并且cy5-cot在有氧条件下的光稳定较cy5提高了5倍左右。将两个cot分子对称的连接在cy3和cy5的两端，得到的分子分别将光毒性降低了3和5倍。
9.然而，上述除氧体系不适用于活细胞成像，成像体系中添加三线态猝灭剂的方法中，猝灭效率依赖于分子间的碰撞，因此体系中需要较高浓度的三线态猝灭剂。如此高浓度会存在细胞毒性，生物相容性差。自修复染料也存在一定的缺陷，比如：(1)不具备普适性：cot与不同母核的花菁类染料共价连接，其对染料分子的三线态猝灭程度大不相同，有些无明显改善。(2)活细胞染料的局限性：花菁类染料天然带有一个正电荷，会累积在富负电荷的线粒体内膜上，不适合做其他细胞器以及蛋白、dna的成像。
10.因此，仍需要对降低荧光染料的光毒性提供新的解决方案。


技术实现要素：

11.本发明的主要目的在于提供一种罗丹明类荧光染料及其应用，以提供一种新的降低现有技术中荧光染料的光毒性的方案。
12.为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种罗丹明类荧光染料，该罗丹明类荧光染料包括罗丹明类染料分子以及与罗丹明类染料分子共价偶联的三线态猝灭剂环辛四烯。
13.进一步地，罗丹明类染料分子通过底环与环辛四烯共价偶联；优选地，通过底环上的邻位与环辛四烯共价偶联。
14.进一步地，罗丹明类染料分子选自如下任一种：氧罗丹明类、碳罗丹明类或硅罗丹明类；优选地，氧罗丹明类包括如下任意一种或多种：tmr、rho110、map555、jf503、jf525、jf536、jf549、jf522、jf571、500r、510r或515r；优选地，碳罗丹明类包括如下任意一种或多种：6-cpy、5-cpy、crhp、580cp、jf585、jf612、jf608或map618；优选地，硅罗丹明类包括如下任意一种或多种：sir、jf626、jf629、jf630、jf635、jf646、jf669或sirh。
15.进一步地，罗丹明类荧光染料的单线态氧产率为0.0014～0.018。
16.根据本技术的第二个方面，提供了一种荧光检测试剂盒，该试剂盒包括上述任一种罗丹明类荧光染料。
17.根据本技术的第三个方面，提供了一种生物标记分子，该生物标记分子包括生物分子及标记生物分子的荧光染料，其中，生物分子的荧光染料为前述任一种罗丹明类荧光染料。
18.根据本技术的第四个方面，提供了一种生物荧光成像方法，该方法采用前述任一种罗丹明类荧光染料标记细胞。
cot-dna。
具体实施方式
30.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
31.如背景技术中所提到的，现有的降低荧光染料光毒性的方案存在或适用范围受限或生物相容性差等问题，为了改善这一状况，本技术提供了一种的新的改进思路，具体详述如下。
32.根据现有的技术中的上述缺陷，本技术将cot偶联的方法应用在了罗丹明类染料上，以实现在活细胞层面的各种细胞器和蛋白的低光毒性成像。其中，选择罗丹明类染料作为研究的母体，主要有以下两点原因：
33.第一，罗丹明类染料是活细胞成像的流行工具。迄今为止报道的大多数适用于活细胞显微镜的荧光探针都是基于罗丹明的衍生物。其关键在于罗丹明以及衍生物都存在非荧光的螺环内酯形式和有荧光的两性离子形式的动态平衡。乍一看，这种动态平衡的存在似乎是不利的，因为它会降低荧光团的亮度。然而，疏水、无荧光的螺环内酯结构比起两性离子结构具有更高的细胞渗透性，并且探针与其靶标的结合通常将平衡向荧光两性离子移动，使此类探针具有荧光性，从而有效地降低了成像的背景信号。
34.第二，罗丹明的空间构象使其能够进一步拉近生色团与三线态猝灭剂的距离。根据之前的研究结构，三线态-三线态能量转移的速率随着三线态猝灭剂与荧光染料的距离的缩短而增加。由于花菁类染料的平面片状结构，导致了cot与花菁染料的生色团距离较远。罗丹明的底环可以自由旋转，这一扭转角度就拉近了底环取代基与共轭生色团的空间距离，而且罗丹明的底环不同位置的取代，使得三线态猝灭剂基团与生色团的空间位置有所改变。
35.因此，本技术中，首先以n，n四甲基罗丹明(tmr)为例，分别在tmr的底环的3，4，5号位以酯键的形式偶联cot，得到化合物o-tmr-cot,m-tmr-cot和p-tmr-cot。为了比较不同三线态猝灭剂相对罗丹明类染料光毒性的改善效果，本技术中也合成了o-tmr-nb(图1a)进行平行比较。结果发现与市售的线粒体染料四甲基罗丹明甲酯(tmrm)，四甲基罗丹明乙酯(tmre)相比，化合物o-tmr-cot,m-tmr-cot，p-tmr-cot均表现出了较低的单线态氧产率。且在罗丹明的3号碳原子上连接cot的策略，单线态氧产率相比tmrm降低6倍左右。
36.进一步地，通过细胞实验发现tmrm在2分钟左右，hela存活率下降至50％，o-tmr-cot大约10分钟左右hela存活率下降至50％。与体外的单线态氧的产率结果一致，均表明在罗丹明底环3号碳上连接cot，能将光毒性降低5-6倍。
37.为了进一步拓宽低光毒性荧光染料的光谱，本技术中将cot偶联的策略应用在其他罗丹明染料上，同样发现能够降低光毒性。
38.在上述研究结果的基础上，申请人提出了本技术的一系列方案。在一种典型的实施方式中，提供了一种罗丹明类荧光染料，该罗丹明类荧光染料包括罗丹明类染料分子以及与罗丹明类染料分子共价偶联的三线态猝灭剂环辛四烯。
39.由于罗丹明能够应用于所有活细胞，而拓宽了染料的适用范围。此外，罗丹明的空间构象使其能够进一步拉近生色团与三线态猝灭剂的距离，从而能够更有效地降低光毒
性，因此，本技术的将三线态猝灭剂环辛四烯共价偶联到罗丹明类染料分子上的罗丹明类荧光染料，能够实现在活细胞层面的各种细胞器和蛋白的低光毒性成像。
40.罗丹明类染料分子，如氧罗丹明类(如tmr、rho110、map555、jf503、jf525、jf536、jf549、jf522、jf571、500r、510r、515r等)、碳罗丹明类(如6-cpy、5-cpy、crhp、580cp、jf585、jf612、jf608、map618等)，硅罗丹明(如sir，jf626、jf629、jf630、jf635、jf646、jf669、sirhp等)(结构式如下)，其底环(即连有羧酸基团或羧酸酯基团的苯环)可以自由旋转，该扭转角度能够拉近底环取代基与共轭生色团的空间距离。根据之前的研究结果：三线态-三线态能量转移的速率随着三线态猝灭剂与荧光染料的距离的缩短而增加，因而距离的缩短，有助于提高氧化猝灭效果，更有助于降低光毒性。而且罗丹明的底环不同位置的取代，使得三线态猝灭剂基团与生色团的空间位置有所改变。因而，在本技术一种优选的实施例总，通过底环与环辛四烯共价偶联；更优选地，通过底环上的邻位与环辛四烯共价偶联。本技术中通过实验证明，将环辛四烯共价偶联至底环上的邻位，比在对位和间位，具有更优异的低光毒性能。
41.(氧罗丹明：以rho110为例)
42.(硅罗丹明类：以sir为例)
43.(碳罗丹明：以map 618为例)
44.在一种优选的实施例中，罗丹明类染料分子选自如下任一种：氧罗丹明类(tmr、rho110、map555、jf503、jf525、jf536、jf549、jf522、jf571、500r、510r、515r等)、碳罗丹明类(6-cpy、5-cpy、crhp、580cp、jf585、jf612、jf608、map618等)或硅罗丹明(sir，jf626、jf629、jf630、jf635、jf646、jf669、sirhp等)
45.本技术所提供的罗丹明类荧光染料的单线态氧产率较现有的此类自修复染料的单线态氧产率低，在0.0014～0.018的范围内。通过该指标可能检测本技术的罗丹明类荧光染料的性能。
46.在本技术第二种典型的实施方式中，提供了一种生物标记分子，该生物标记分子为带有上述任一种罗丹明类荧光染料的生物分子。此类生物标记分子能够在相对长时间和/或高光照强度的显微镜下进行荧光成像。具体的生物分子可以是蛋白质或核酸等大分
子。此类生物分子在细胞上的分布可以是在细胞膜、细胞质、细胞核或线粒体等细胞器中。
47.在本技术第三种典型的实施方式中，提供了一种荧光检测试剂盒，该试剂盒包括上述任一种罗丹明类荧光染料。采用该试剂盒的染料进行荧光标记成像，能够实现在活细胞层面上的各种细胞亚显微结构的荧光成像。
48.在本技术第四种典型的实施方式中，提供了一种生物荧光成像方法，该方法采用上述任一种罗丹明类荧光染料标记细胞。采用罗丹明类荧光染料标记细胞进行荧光成像，能够实现在活细胞层面上的各种细胞亚显微结构的荧光成像。
49.因此，优选地，细胞为活细胞；更优选地，本技术的罗丹明类荧光染料标记细胞内的细胞器，其中细胞器包括但不限于如下任意一种或多种：线粒体、细胞核、细胞骨架、高尔基、内质网、溶酶体、内含体、核糖体或迁移体等。在另一些优选的实施例中，罗丹明类荧光染料标记细胞上的分子标记物，具体的分子标记物为蛋白分子、糖分子或核酸分子。
50.需要说明的是，本技术的具有低光毒性的罗丹明类荧光染料在标记细胞器时，其具体的标记原理是基于：不同细胞器的微环境，如ph值的不同，带电性质的不同，亲疏水性不同。如溶酶体、早期内含体、晚期内含体的ph在4.0-5.5之间，而除此之外的细胞器环境都是ph＝7.4左右；线粒体内外膜具有内负外正的电势差；内质网、高尔基体、脂滴具有较疏水的环境。其具体标记的方式是：通过在罗丹明类荧光染料上进一步偶联各细胞器特异性的基团，进而使得该染料能够特异性标记某一种或几种细胞器。下面以线粒体、溶酶体和内质网为例进行示例性说明：带有正电荷的罗丹明类分子可以靶向线粒体内膜实现线粒体定位；将罗丹明染料上偶联格列本脲这一药物分子，就可以通过与内质网上的磺脲类受体结合实现内质网定位；将罗丹明类分子添加上一些弱碱性胺，这样该分子就可以聚集在低ph的小室内实现酸性细胞器定位，通过调节不同胺的碱性，可实现不同酸性细胞器的特异定位。
51.而用于标记分子标记物时，则是通过将罗丹明类荧光染料与相应的标记分子进行偶联来实现标记。比如，与蛋白质分子进行标记时，可以与蛋白上携带的标签进行偶联，从而标记蛋白。与核酸分子进行标记时，通过偶联特异性嵌入dna分子链中的小分子来实现标记。
52.由于罗丹明类荧光染料具有低光毒性，因而不仅适用于常规的荧光显微镜，比如普通光学显微镜或激光共聚焦显微镜，而且在应用于超分辨成像显微镜方面更具优势，比如随机光学重建显微镜或受激发射损耗荧光显微镜。
53.在本技术第五种典型的实施方式中，提供了上述任一种罗丹明类荧光染料，或上述试剂盒，或者上述任一种生物荧光成像方法在活细胞成像研究中的应用。优选地，成像是在如下任意一种或多种显微镜下成像：共聚焦显微镜、随机光学重建显微镜或受激发射损耗荧光显微镜。
54.下面将结合具体的实施例进一步说明本技术的有益效果。
55.实施例1
56.利用有机合成手段，先合成环辛四烯(cot)的醇衍生物，用以后续和罗丹明染料的偶联。以下合成步骤中用的化合物或操作步骤的简称及其对应的全称分别如下：
57.cdin，n'-羰基二咪唑
58.dmfn，n-二甲基甲酰胺
59.thf四氢呋喃
60.cot环辛四烯
61.dcm二氯甲烷
62.meoh甲醇
63.pe石油醚
64.ea乙酸乙酯
65.mgso4硫酸镁
66.na2so4硫酸钠
67.tsoh对甲苯磺酸
68.n-buli正丁基锂
69.hatu2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐
70.tea三乙胺
71.ddq2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌
72.edci.hcl1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐
73.hobt1-羟基苯并三唑
74.hplc高压液相色谱
75.cubr2溴化铜
76.rt室温
77.mass质量
[0078]1h nmr
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
核磁共振氢谱
[0079]
chloroform-d 氘代氯仿。
[0080]
1.1环辛四烯(cot)的醇衍生物的合成：
[0081][0082]
将35.38mg，221mmol的液溴溶于150ml的dcm，在-78℃的条件下，缓慢加入市售化合物1(23g，221mmol)的dcm溶液中并搅拌1小时后，逐滴加入300ml，30mmol的叔丁醇钾。反应混合溶液在-60℃条件下继续搅拌4小时，再升温至-10℃，滴入冰水中。用少量mgso4裂解乳液相，去除有机相，用乙醚(3x 200ml)萃取水相。萃取出来的水相经mgso4干燥，过滤，浓缩，得到黄色油状物质(40g,产率99％，即化合物2)，无需进一步纯化，用于下一步。
[0083]1h nmr(400mhz,chloroform-d):δ6.21(s,1h),5.77-5.92(m,5h),5.62(s,1h).
[0084]
[0085]
将40g的化合物2溶于50ml的超干四氢呋喃中，在冰浴和氩气保护下逐滴加入事先打磨好的镁条(15.7g，655mmol)中。反应混合物在室温下搅拌3个小时后直到出现深蓝绿色的溶液。将得到的溶液冷却到-78℃，然后加入过量的固体干冰，生成cot的羧酸盐衍生物。随后用250ml水溶液猝灭反应，用1m的盐酸溶液酸化至ph＝2。用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，合并有机相，经mgso4干燥，抽滤，浓缩，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)得到黄色油状化合物3(17.2g，产率53％)。
[0086]1h nmr(400mhz,chloroform-d)7.16(s,1h),6.06
–
5.96(m,1h),5.93(d,j＝10.9hz,3h),5.90
–
5.84(m,1h),5.81(s,1h).
[0087][0088]
400mg，2.70mmol化合物3溶于5ml的meoh溶液中，室温下逐滴加入磺酰氯中。滴加完毕，反应混合物升温至60℃，搅拌5小时后，旋干得到440mg的粗产物化合物4，用于下一步反应。
[0089][0090]
将440mg，2.7mmol的化合物4溶解于10ml的thf溶液中，在冰浴、氮气保护下加入至150mg，4.05mmol氢化铝锂中。搅拌30分钟后，升至室温继续搅拌2小时。依次加入150ul的水，15％的naoh溶液，和450ul的水，继续搅拌5小时。过滤，用20ml乙酸乙酯洗滤饼，浓缩，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝20:1)，得到无色油状物质5(260mg，产率72％)。
[0091]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ5.81～5.94(s,7h),4.04(d,j＝5.6hz,2h).
[0092]
cot磺酰胺的制备
[0093][0094]
向热风枪干燥的玻璃烧瓶中加入磁力搅拌子及活化镁带0.4g(～6eq)，氮气保护下加入溴代环辛四烯(化合物2)500mg(1eq.)(按已有文献方法制备，nat.methods 2012,9,68.)的无水thf溶液2ml，室温搅拌10-15min后体系颜色变深至深墨绿色，继续搅拌4h使grignard试剂完全生成，随后冷却至-78℃。向另一氮气保护的干燥圆底烧瓶中加入so2cl2的二氯甲烷(dcm)溶液(1-2m)，冷却至-78℃。以注射器吸取上述grignard试剂的thf溶液，-78℃下逐滴缓慢加入上述so2cl2溶液，滴加完成后在-78℃搅拌15min。体系恢复至室温，常温真空干燥得到黄色胶状粗品cot磺酰氯。产物不经进一步纯化直接用于后续转化。加入5ml dcm配制上述粗品磺酰氯的溶液及氨的thf溶液5ml(1.5m)，分别冷却至-78℃，在此温
度下混合并搅拌1h。旋转蒸发除去溶剂及过量氨，硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝5:1～3:1)得到棕色油状物cot磺酰胺130mg，收率25％(按cot-br计)。
[0095]1h nmr(400mhz,methanol-d4)δ6.78(d,j＝3.6hz,1h),6.16(dd,j＝11.3,3.5hz,1h),6.04(d,j＝11.4hz,1h),5.90(m,4h).
[0096]
1.2化合物o-tmr-cot的合成
[0097]
取80mg，0.21mmol化合物6于3.0ml的dmf溶液，依次加入118mg，0.310mmol的hatu，42.5mg,0.42mmol的ea，以及41.6mg，0.310mmol的化合物5。室温搅拌24小时后，浓缩，硅胶柱层析，用dcm:meoh＝20:1的展开剂洗脱，得到36mg的产物。将其再次溶解于2.5ml dcm，缓慢滴加于25ml的mtbe中重结晶，抽滤，浓缩得到20mg红色固体(产率：19％)。
[0098]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ8.27(d,j＝7.6hz,1h),7.81(t,j＝7.5hz,1h),7.74(t,j＝7.5hz,1h),7.35(d,j＝7.7hz,1h),7.09(d,j＝10.0hz,2h),6.87(m,4h),5.74(m,7h),4.39(s,2h),3.31(s,12h).
[0099]
1.3化合物o-tmr-nb的合成
[0100][0101]
取100mg，0.258mmol化合物6于5.0ml的dmf溶液，依次加入147mg，0.356mmol的hatu，78.3mg,0.774mmol的tea,以及51.4mg，0.356mmol的市售化合物7，于室温条件搅拌18小时。浓缩，硅胶柱层析，用dcm:meoh＝50:1的展开剂洗脱，得到40mg的红色固体(产率：41％)
[0102]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.31(dd,j＝7.7,1.5hz,1h),8.06
–
8.01(m,2h),7.92(td,j＝7.5,1.5hz,1h),7.87(td,j＝7.6,1.5hz,1h),7.49(dd,j＝7.4,1.4hz,1h),7.25
–
7.19(m,2h),7.04(dd,j＝9.5,2.4hz,2h),6.97(d,j＝9.4hz,2h),6.80(d,j＝2.3hz,2h),5.08(s,2h),3.26(s,12h).
[0103]
1.4化合物m-tmr-cot的合成
[0104]
[0105]
685mg 5.00mmol的化合物8，375mg，2.5mmol的化合物9，76mg，0.441mmol的tsoh分别溶于15ml的丙酸溶液中，65℃搅拌16小时。反应液冷却至室温后滴加至100ml 3mol/l的醋酸钠溶液中，用dcm萃取，合并有机相经饱和食盐水洗，na2so4干燥，过滤，浓缩得到剩余物。剩余物溶解于50ml的meoh:dcm＝3：2溶液，然后加入295mg，1.20mmol的ddq，室温搅拌2小时，随后真空浓缩得到剩余物，经硅胶柱层析(dcm:meoh＝50:1)得到红色固体(化合物10，100mg，产率10％)。
[0106][0107]
与化合物o-tmr-cot的合成步骤相同，化合物10与化合物5偶联反应得到化合物m-tmr-cot。
[0108]1h nmr(300mhz,acetonitrile-d3)δ8.27(d,j＝7.9hz,1h),8.01(s,1h),7.79(t,j＝7.7hz,1h),7.66(d,j＝7.2hz,1h),7.25(d,j＝9.5hz,2h),6.94(dd,j＝9.5,2.4hz,2h),6.79(d,j＝2.4hz,2h),6.06
–
5.68(m,7h),4.75(s,2h),3.24(s,12h).
[0109]
1.5化合物p-tmr-cot的合成
[0110][0111]
与化合物m-tmr-cot类似，不再赘述。
[0112]1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ8.27(d,j＝7.9hz,1h),7.48(d,j＝8.2hz,1h),7.33
–
7.19(m,1h),6.92(dd,j＝9.4,2.2hz,1h),6.84(d,j＝2.3hz,1h),5.92(m,,7h),4.81(s,2h),3.32(s,12h).
[0113]
1.6化合物rho110-cot的合成
[0114][0115]
将市售的100mg，0.272mmol化合物13溶于5.0ml的dmf溶液中，依次加入67mg,0.354mmol,47.9mg,0.354mmol的edci.hcl，47.9mg，0.354mmol的hobt，110mg，1.09mmol的tea,室温搅拌15分钟后，再加入43.8mg，0.327mmol的化合物5，继续搅拌24小时后，真空浓缩，经碳十八反向hplc(0.5％hcl)纯化得到红色固体(8.0mg,产量：7％)
[0116]
1.7化合物sir-coome和sir-cot的合成
[0117][0118]
1.7.1化合物16的合成
[0119][0120]
2.0g,10.0mmol的化合物14溶于30ml thf中，在-78℃氮气保护下滴加至6.9ml，11.0mmol的n-buli中，搅拌1小时，然后加入645mg，5.0mmol的化合物15,继续搅拌十分钟。反应液缓慢恢复至室温，继续搅拌2小时。在反应体系中加入10ml水，再用3次30ml的ea萃取，将混合的有机相干燥、抽滤、真空浓缩，硅胶柱层析(pe:ea＝20:1至10：1的展开剂洗脱)得到无色油状物质(460mg，产率：31％)
[0121]
1.7.2化合物18的合成
[0122]
将化合物16(50mg，0.167mmol)，化合物17(75mg，0.501mmol)，以及cubr2(3.5mg，0.017mmol)加入到高压釜中，氩气保护下120℃反应6小时。缓慢冷却至室温，利用硅胶柱层析(dcm:meoh＝30:1)分离纯化得到蓝色固体(12mg，产率：17％)
[0123]
1.7.3化合物19的合成
[0124][0125]
10mg，0.023mmol的化合物18溶于2.0ml的超干dcm中，再加入草酰氯(148mg，
1.17mmol)，dmf(1.0ul)，室温搅拌8小时。真空浓缩得到剩余物再次溶解于2.0ml的超干dcm中，无需纯化，下一步直接使用。
[0126]
1.7.4化合物sir-coome的合成
[0127][0128]
在冰浴和氮气保护下，取1.0ml上一步的粗产物的化合物19(5.5mg，0.012mmol)，再加入1.0ml的meoh。加完反应物之后，将反应体系缓慢恢复至室温，搅拌30分钟后真空浓缩得到剩余固体。利用硅胶柱层析(dcm:meoh＝10:1)分离产物，得到蓝色固体(1.8mg，产率：34％)。
[0129]
mass:[m]
+
＝443.25。
[0130]1h nmr(400mhz,methanol-d4)δ8.25(dd,j＝7.8,1.5hz,1h),7.78(td,j＝7.5,1.4hz,1h),7.71(td,j＝7.7,1.4hz,1h),7.34(d,j＝2.8hz,2h),7.30(dd,j＝7.5,1.4hz,2h),6.97(d,j＝9.6hz,2h),6.73(dd,j＝9.6,2.8hz,2h),3.62(s,3h),3.33(s,12h)。
[0131]
1.7.5化合物sir-cot的合成
[0132][0133]
在冰浴和氮气保护下，取1.0ml上一步的粗产物的化合物19(5.5mg，0.012mmol)，再加入化合物7(1.90mg，0.014mmol)。加完反应物之后，将反应体系缓慢恢复至室温，搅拌3小时后，经真空浓缩得到剩余固体。利用硅胶柱层析(dcm:meoh＝10:1)分离产物，得到蓝色固体(1.2mg，产率：18％)。
[0134]
mass:[m]
+
＝545.12。
[0135]1h nmr(400mhz,acetonitrile-d3)δ7.97(dd,j＝7.8,1.4hz,1h),7.53(td,j＝7.5,1.5hz,1h),7.47(td,j＝7.6,1.4hz,1h),7.07(d,j＝1.3hz,1h),7.03(d,j＝2.8hz,2h),6.70(d,j＝9.6hz,2h),6.41(dd,j＝9.7,2.8hz,2h),5.63-5.24(m,7h),4.17(s,2h),3.03(s,12h),0.36(s,6h).
[0136]
1.8化合物map555-cot-halo的合成
[0137][0138]
将25mg的化合物20溶解在1ml的dmf中，加入16μl三乙胺(2eq)和16mg碳酸钾(2eq)。将反应冷却至0℃并加入7.5μl的烯丙溴(1.5eq)，将反应体系升至室温并反应2h后结束反应。将反应液水洗并用dcm萃取后，旋干溶剂并用硅胶柱层析分离(dcm：meoh＝10:1)，最终得到25mg目标产物，产率90％。
[0139]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ8.28(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),8.11(d,j＝7.8hz,1h),7.84(d,j＝1.4hz,1h),6.65(d,j＝8.9hz,2h),6.53(d,j＝2.5hz,2h),6.45(dd,j＝8.9,2.5hz,2h),5.98(ddt,j＝16.6,10.4,5.9hz,1h),5.36(dq,j＝17.2,1.5hz,1h),5.27(dq,j＝10.4,1.3hz,1h),4.78(dt,j＝6.0,1.3hz,2h),3.03(s,12h).
[0140][0141]
将上一步所得的25mg的化合物21溶解于5ml dcm中，加入100μl三氯氧磷(20eq)后，40℃回流4h，将溶剂真空旋干后，加入3ml乙腈溶解，再43mg cot磺酰胺(4.4eq)，65μl dipea(7eq)后50℃过夜反应，无需进一步分离，再旋干溶剂后重新用3ml(dcm：meoh＝5:1)的溶剂溶解，加入30mg的1,3二甲基巴比妥酸(4.5eq)，25mg四(三苯基膦)钯(0.5eq)，反应4h后用hplc进行分离，最终得到3.8mg产物，产率12％。
[0142]
mass:[m+h]
+
＝596.21。
[0143][0144]
将1mg上述所得分子溶于1ml dmf中，加入2mg halo-nh2
·
hcl(4.6eq)，1.5mg卡特缩合剂(2eq)和6μl的dipea(20eq)，反应过夜后，将反应液以hplc分离，可以得到最终产物34μg，产率3％。
[0145]
mass:[m+h]
+
＝801.38。
[0146]
1.9化合物map555-cot-tmp的合成
[0147][0148]
将1mg上述所得分子溶于1ml dmf中，加入1mg tmp3-nh2
·
hcl(1eq)，1.5mg卡特缩合剂(2eq)和6μl的dipea(20eq)，反应过夜后，将反应液以hplc分离，可以得到最终产物85μg，产率5％
[0149]
mass:[m+h]
+
＝1070.34。
[0150]
需要说明的是，1.9步骤中化合物map555-cot-tmp与1.8步骤中化合物map555-cot-halo均是通过与蛋白的标签偶联实现蛋白的标记，的唯一区别在于，蛋白标签halo与tmp的不同，因此两者连接同一种蛋白时，荧光效果类似(参见实施例5及图4a和4b)。
[0151]
2.0化合物map555-cot-dna的合成
[0152][0153]
化合物24：1h nmr(400mhz,methanol-d4)δ8.93(d,j＝1.5hz,1h),8.46(dd,j＝7.9,1.7hz,1h),7.57(d,j＝7.9hz,1h),7.14(d,j＝9.5hz,2h),7.06(dd,j＝9.5,2.4hz,2h),6.99(d,j＝2.3hz,2h),6.15(ddt,j＝16.2,10.9,5.7hz,1h),5.49(dq,j＝17.1,1.7hz,1h),5.36(dq,j＝10.5,1.4hz,1h),4.95(d,j＝5.7hz,2h),3.31(s,12h).
[0154]
化合物25：1h nmr(400mhz,methanol-d4)δ8.53(d,j＝1.5hz,1h),8.40(d,j＝7.8hz,1h),7.52(s,1h),7.20
–
6.74(m,6h),3.24(s,12h),2.63(s,6h).
[0155]
以化合物23为原料合成化合物25，与1.8中化合物20-22的合成步骤完全一致，无需赘述。
[0156][0157]
称量20mg，0.038mmol的化合物26溶于1ml的dmf中，再加入k2co3(30mg,0.218mmol)
后，室温搅拌30分钟。化合物27(12.3mg，0.049mmol)加入到反应液中，60℃搅拌过夜。
[0158]
将反应液经hplc纯化(a液:h2o+0.1％tfa,b液：acn),最终得到18mg，产率为75％。
[0159][0160]
将1mg上述所得分子溶于1ml dmf中，加入1.6mg 28(2eq)，1.5mg卡特缩合剂(2eq)和6μl的dipea(20eq)，反应过夜后，将反应液以hplc分离，可以得到最终产物map555-cot-dna(此结构式中的dna实质是指靶向dna的小分子hoechst，即化合物28。小分子hoechst通过嵌入dna小沟发出荧光)321μg，产率17.8％。
[0161]1h nmr(400mhz,methanol-d4)δ8.42(d,j＝1.7hz,1h),8.36(d,j＝1.7hz,1h),8.21(dd,j＝8.0,1.8hz,1h),8.11(d,j＝8.6hz,2h),8.02(dd,j＝8.5,1.7hz,1h),7.86(d,j＝8.6hz,1h),7.71(d,j＝9.0hz,1h),7.47(d,j＝7.9hz,1h),7.38(dd,j＝9.0,2.3hz,1h),7.31(d,j＝2.4hz,1h),7.18(d,j＝8.5hz,2h),6.98(d,j＝9.4hz,2h),6.89(dd,j＝9.3,2.4hz,2h),6.82(d,j＝2.5hz,2h),6.64(s,1h),6.02
–
5.93(m,1h),5.91
–
5.84(m,1h),5.75
–
5.59(m,4h),4.21(t,j＝5.7hz,2h),4.03-3.87(s,2h),3.75-3.62(m,2h),3.58(t,j＝6.4hz,2h),3.44-3.34(m,2h),3.21(s,12h),3.16-3.08(m,2h),3.02(s,3h),2.01
–
1.89(m,4h)。
[0162]
实施例2单线态氧产率测试
[0163]
对于前述在tmr的底环的3，4，5号位以酯键的形式偶联cot，得到的化合物o-tmr-cot,m-tmr-cot，p-tmr-cot以及作为对照的o-tmr-nb(图1a)在体外测量了溶液的单线态氧产率。单线态氧产率是通过1,3-二苯基异苯丙呋喃(dpbf)来定量测定的。
[0164]
如图1b和图1c所示，与市售的线粒体染料四甲基罗丹明甲酯(tmrm)，四甲基罗丹明乙酯(tmre)相比，化合物o-tmr-cot,m-tmr-cot，p-tmr-cot均表现出了较低的单线态氧产率。根据文献调研，已知tmre的单线态氧产率为0.012。根据参比法，tmrm的单线态产率为0.0087，而化合物o-tmr-cot的绝对单线态氧产率仅为0.0014，是tmrm的1/6。因此可以得出结论，在罗丹明的3号碳原子上连接cot的策略，能把单线态氧产率降低6倍左右。
[0165]
实施例3
[0166]
本实施例以hela(人宫颈癌细胞)细胞为例，测试了这一系列染料的光毒性。
[0167]
将所有的化合物用培养基稀释到250nm的浓度，在37℃、5％二氧化碳的条件下孵育细胞15分钟，用于后续实验。利用高内涵活细胞成像系统，将不同孔的细胞用561nm激光进行时间序列成像，以10秒的曝光时间，采集梯度的时间点。成像结束1小时后，加入碘化丙啶(pi)染色，统计pi阳性的信号数目计为死细胞数目＝a，曝光之前的细胞数目计为b，即可得到细胞存活率＝(b-a)/b*100％，该数值是评价染料光毒性的重要指标。
[0168]
光毒性数据分析结果见图2，tmrm在2分钟左右，存活率下降至50％，o-tmr-cot大约10分钟左右存活率下降至50％，这一结果与体外的单线态氧的产率十分吻合。两方面的数据共同印证了在罗丹明底环3号碳上连接cot，能将光毒性降低5-6倍。
[0169]
实施例4
[0170]
为了进一步拓宽本技术的低光毒性荧光染料的光谱，本实施例将cot偶联的策略应用在其他罗丹明染料上，得到了相似结构的绿色荧光探针化合物rho110-cot(见实施例1中的1.6)，商业的绿色线粒体膜电位探针rho123可作为化合物rho110-cot的对照化合物(如图3a所示)；以及远红荧光的探针化合物sir-coome和sir-cot(实施例1中的1.7)(其中化合物sir-coome为化合物sir-cot的对照化合物，如图3a所示)，经体外的ros水平检测和细胞内光毒性检测，化合物rho110-cot和化合物sir-cot与对照化合物相比都有显著的光毒性降低，其中rho110-cot与rho123的光毒性是通过其指示的线粒体膜电位变化来表征的(参见图3b,3c,3d,3e和3f)。
[0171]
实施例5
[0172]
将cot偶联的策略与蛋白标签技术联用，可以实现活细胞内特定蛋白的低毒性成像。以细胞核区高丰度的组蛋白h2b为例，分别用map555-cot-halo和已报道的化合物map555-halo标记稳定表达h2b-halo的稳转细胞系u2os为例进行实验。(参见图4a)由于h2b紧密缠绕了dna，当h2b周围产生单线态氧等活性氧物种，将迅速引发dna损伤。通过dna修复蛋白人类x射线交错互补修复因子(xrcc1)来表征dna的损伤情况，当细胞核内dna无损伤时或损伤较少时，xrcc1均匀分布在核区或极少量点状聚集；当dna损伤较多时，核区内明显观察到xrcc1的点状聚集分布(参见图4b)。
[0173]
经比较，map555-cot-halo标记的实验组中xrcc1的聚集情况(聚集点数增长约5倍)明显少于map555-halo(聚集点数增长约20倍)标记的对照组。将halo-tag的蛋白标签换成tmp-tag标签后，map555-cot-tmp同样表现出了在光照条件下对蛋白损伤更少的性质，效果参见图4c。
[0174]
此外，除了连接蛋白质标签的配体，还可以连接其他标记物分子，以核酸为例，合成了化合物map555-cot-dna(以市售的spy555-dna作为对照分子)，利用上述的评测体系，可得到相同的结论，在相同标记强度和相同光照条件下，map555-cot-dna表现出更低的dna毒性(参见图5)。
[0175]
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
[0176]
1.本发明可应用于活细胞成像系统，无需通过除氧来改善染料的光稳定性和光毒性。
[0177]
2.本发明大大提高了成像的生物相容性。一方面，分子内共价连接三线态猝灭剂增加了反应速率，降低了高浓度的三线态猝灭剂产生的细胞毒性；另一方面，三线态猝灭剂与染料的有效碰撞更高效降低了染料分子产生的光毒性。
[0178]
3.本发明应用范围十分广泛。该策略可以应用于细胞内各个细胞器以及各种蛋白的特异性标记，以实现超长时程的超分辨成像。
[0179]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种罗丹明类荧光染料，其特征在于，所述罗丹明类荧光染料包括罗丹明类染料分子以及与所述罗丹明类染料分子共价偶联的三线态猝灭剂环辛四烯。2.根据权利要求1所述的罗丹明类荧光染料，其特征在于，所述罗丹明类染料分子通过底环与所述环辛四烯共价偶联；优选地，通过所述底环上的邻位与所述环辛四烯共价偶联。3.根据权利要求2所述的罗丹明类荧光染料，其特征在于，所述罗丹明类染料分子选自如下任一种：氧罗丹明类、碳罗丹明类或硅罗丹明类；优选地，所述氧罗丹明类包括如下任意一种或多种：tmr、rho110、map555、jf503、jf525、jf536、jf549、jf522、jf571、500r、510r或515r；优选地，所述碳罗丹明类包括如下任意一种或多种：6-cpy、5-cpy、crhp、580cp、jf585、jf612、jf608或map618；优选地，所述硅罗丹明类包括如下任意一种或多种：sir、jf626、jf629、jf630、jf635、jf646、jf669或sirh。4.根据权利要求1至3中任一项所述的罗丹明类荧光染料，其特征在于，所述罗丹明类荧光染料的单线态氧产率为0.0014～0.018。5.一种荧光检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至4中任一项所述的罗丹明类荧光染料。6.一种生物标记分子，所述生物标记分子包括生物分子及标记所述生物分子的荧光染料，其特征在于，所述生物分子的荧光染料为1至4中任一项所述的罗丹明类荧光染料。7.一种生物荧光成像方法，其特征在于，采用权利要求1至4中任一项所述的罗丹明类荧光染料标记细胞。8.根据权利要求7所述的生物荧光成像方法，其特征在于，所述细胞为活细胞；优选地，所述罗丹明类荧光染料标记细胞是标记所述细胞内的细胞器，其中所述细胞器包括如下任意一种或多种：线粒体、细胞核、细胞骨架、高尔基、内质网、溶酶体、内含体、核糖体或迁移体；优选地，所述罗丹明类荧光染料标记细胞是标记细胞内的分子标记物，所述分子标记物为蛋白分子、糖分子或核酸分子；优选地，所述生物荧光成像方法还包括将所述罗丹明类荧光染料标记的细胞置于显微镜下成像观察，所述显微镜包括如下任意一种或多种：共聚焦显微镜、随机光学重建显微镜或受激发射损耗荧光显微镜。9.权利要求1至4中任一项所述的罗丹明类荧光染料，或权利要求5所述的试剂盒，或者权利要求7或8所述的生物荧光成像方法，在活细胞成像研究中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述成像是在如下任意一种或多种显微镜下成像：共聚焦显微镜、随机光学重建显微镜或受激发射损耗荧光显微镜。

技术总结
本发明提供了一种罗丹明类荧光染料及其应用。该罗丹明类荧光染料包括罗丹明类染料分子以及与罗丹明类染料分子共价偶联的三线态猝灭剂环辛四烯。由于罗丹明能够应用于所有活细胞，而拓宽了染料的适用范围；此外罗丹明的空间构象使其能够进一步拉近生色团与三线态猝灭剂的距离，从而能够更有效地降低光毒性，因此，本申请的将三线态猝灭剂环辛四烯共价偶联到罗丹明类染料分子上的罗丹明类荧光染料，能够实现在活细胞层面的各种细胞器和蛋白的低光毒性成像。低光毒性成像。低光毒性成像。


技术研发人员：陈知行 刘天妍 杨中天 张源 陈朋 张昊霖
受保护的技术使用者：北京大学
技术研发日：2022.01.25
技术公布日：2023/8/4