用于治疗阿尔兹海默症的鼻内免疫疗法

用于治疗阿尔兹海默症的鼻内免疫疗法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年10月30日提交的美国临时专利申请号63/107,496的权益，其内容通过引用全文纳入本技术。
技术领域
3.本发明整体涉及用于治疗疾病和紊乱的药物组合物。更具体地，本公开涉及用于治疗阿尔茨海默病的免疫疗法，包括使用针对il-12p40同二聚体的中和单克隆抗体(mab)的鼻内免疫疗法。


背景技术：

4.阿尔茨海默病是一种进行性神经退行性疾病，伴有典型的记忆障碍和认知障碍。阿尔茨海默病的病理特征是大脑皮层和海马中存在老年斑块(sp)，其含有低聚淀粉样蛋白β(aβ40/42)，和由tau蛋白过度磷酸化引起的神经原纤维缠结(nft)组成。参见takahashi等,“阿尔茨海默病的并发突触处的β-淀粉样蛋白和tau蛋白病理(co-occurrence of alzheimer's diseaseβ-amyloid and tau pathologies at synapses),”(2010)neurobiol aging 31,1145-1152；li等,“胞内淀粉样蛋白β在阿尔茨海默病中的作用(the role of intracellular amyloid beta in alzheimer's disease),”(2007)prog neurobiol 83,131-139。
5.人们普遍认为ad是一种多因素病症，其受遗传、环境和生活方式因素的混合影响。然而，阿尔茨海默病的主要原因为aβ的异常积累和nft的形成会诱导神经炎症和随后的神经元损失。参见citron,m.,teplow,d.b.,和selkoe,d.j.(1995)淀粉样蛋白β蛋白的前体产生具有序列特异性(generation of amyloid beta protein from its precursor is sequence specific).neuron 14,661-670。
6.已经尝试了许多类型的治疗来最大限度地减少或逆转这种疾病的损害。目前使用的大多数既定治疗方法都试图平衡这种疾病的神经递质失衡。多奈哌齐、加兰他敏和利瓦斯汀是被批准用于治疗ad的乙酰胆碱酯酶抑制剂(achei)。它们的发展是基于最初的胆碱能假说，该假说表明ad患者边缘和新皮质胆碱能神经支配的逐渐丧失对于记忆、学习、注意力和其他高级大脑功能的下降至关重要。此外，基底前脑的神经原纤维变性可能是该区域胆碱能神经元功能障碍和死亡的主要原因，导致广泛的突触前胆碱能去神经支配。achei增加了突触乙酰胆碱的可用性，并已被证明在临床上有助于延缓ad的认知能力下降。参见例如，yiannopoulou等,“阿尔茨海默病的当前和未来治疗：最新进展(current and future treatments in alzheimer disease:an update),”7.(2020)j cent nerv syst dis.12:1179573520907397。
8.除了achei之外，还使用了其他方法。例如，低至中等亲和力的非竞争性n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)受体拮抗剂美金刚被批准用于中度至重度ad。出处同上。美金刚(memantine)优先与开放的nmda受体操作的钙通道结合，阻断nmda介导的离子通量，并减轻
导致神经元功能障碍的病理性谷氨酸水平升高的危险影响。出处同上。
9.在临床试验中，aβ和tau蛋白都是ad疾病改良治疗(dmt)的主要靶点。从这个角度来看，ad可以通过以下方式来预防或有效治疗：减少aβ和tau蛋白的产生；防止这些蛋白质的聚集或错误折叠；中和或去除这些蛋白质的毒性聚集体或错误折叠形式；或者这些策略的组合。出处同上。
10.对于ad疾病的炎症机制也有广泛的研究。研究表明，神经胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞的激活会诱导炎性细胞因子的产生，主要是白细胞介素1β(il-1β)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)。tnf-α信号转导已被证明在体内加剧aβ聚集和tau蛋白磷酸化，而在ad患者的大脑和血浆中发现其水平升高。参见alam等,“阿尔茨海默病和帕金森病的炎症过程：细胞因子的中心作用(inflammatory process in alzheimer’s and parkinson’s diseases:central role of cytokines),”(2016)curr pharm des.22:541-548；chang等,“肿瘤坏死因子α对阿尔茨海默病的抑制作用(tumor necrosis factorαinhibition for alzheimer’s disease),”(2017)j cent nerv syst dis.9:1179573517709278.
11.尽管进行了深入的研究，到目前为止还没有针对ad的有效治疗方法。因此，开发一种有效的神经保护治疗方法来减缓或阻止疾病进展至关重要。本公开解决了这一需求。
12.发明概述
13.细胞因子p40家族有四个成员，包括白细胞介素-12(il-12)、p40单体(p40)、p40-同二聚体(p402)和il-23。此前，在异二聚体规则和同二聚体仅作为旁观者的认识背景下，本领域技术人员认为只有il-23和il-12被赋予生物功能。p402和p40都被认为是功能未知的无活性分子。在wo2012159100中，本发明人证明了针对小鼠p402和p40的中和单克隆抗体(mab)，包括重组p40和/或针对p402的单克隆抗体(单克隆抗体-p40
2 a3-1d)，可用于治疗多发性硬化症和类风湿性关节炎。
14.鼻腔药物给予已被证明比标准的全身给予系统具有许多优点，例如其非侵入性、起效快，并且在许多情况下由于更有针对性的给予而减少了副作用。鼻内给予被认为是治疗神经或神经退行性疾病的一种特别有吸引力的给予途径。全身给予方法通常不能有效地为中枢神经系统提供药物。参见例如keller等,“鼻内给药：药物开发过程中的机遇和毒理学挑战(intranasal drug delivery:opportunities and toxicologic challenges during drug development),”(2021)drug delivery and translational research https://doi.org/10.1007/s13346-020-00891-5.
15.发明人已经发现，在5xfad小鼠中利用ad的小鼠模型，通过鼻内途径以非常低的剂量用p402(mab-p40
2 a3-1d)处理能够减少来自海马的淀粉样斑块的负荷。因此，本公开涉及可用于治疗阿尔茨海默病和其中淀粉样蛋白沉积存在于大脑中的相关疾病的方法和药物组合物和/或制剂。更具体地，本公开涉及方法和药物组合物和/或制剂，包括向有需要的患者鼻内给予有效量的包含p402(mab-p40
2 a3-1d)抗体的药物组合物。
16.在一些实施方式中，公开了ad的治疗，其包括向患者给予至少一种针对p402的单克隆抗体(mab-p40
2 a3-1d)。
17.在另一个实施方式中，公开了一种降低脑中淀粉样斑块负荷的方法，其包括向患者给予至少一种抗p402单克隆抗体(mab-p40
2 a3-1d)。
18.在另一个实施方式中，公开了阿尔茨海默病的治疗方法，其包括向患者给予重组
p40和至少一种针对p402的单克隆抗体(mab-p40
2 a3-1d)的组合。
19.在另一个实施方式中，公开了一种用于减少脑中淀粉样斑块负荷的方法，其包括向患者给予重组p40和至少一种抗p402单克隆抗体(mab-p40
2 a3-1d)的组合。
20.在任何实施方式中，药物组合物通过注射、口服、透皮贴剂和/或鼻内给予患者。在一些实施方式中，药物组合物优选由患者吸入。
21.在其他实施方式中，所述药物组合物与药学上可接受的运载体或赋形剂一起配制。例如，在一些实施方式中，药物组合物与盐水一起配制。
22.在任何实施方式中，所需治疗剂可以作为单剂给予。在其它实施方式中，所需治疗剂以多剂给予。
23.通过参见以下说明书、附图和权利要求，本公开的这些和其他实施方式和特征将变得更加明显。此外，应理解，本文所描述的各种实施方式的特征不是相互排斥的，并且可以以各种组合和排列存在。
24.附图简要说明
25.图1a-d显示了用p402maba3-1d每周鼻内处理降低5xfad小鼠血清和海马体中aβ1-40和aβ1-42水平的结果。6月龄的5xfad-tg小鼠(每组n＝6)用p402maba3-1d(25ng/小鼠/周)鼻内处理，每周一次。简言之，将25ng p402mab溶于2μl生理盐水中，将小鼠保持仰卧姿势，并使用移液管将1μl体积注入每个鼻孔。对照5xfad小鼠仅接受2μl生理盐水作为载剂。在30天处理后(每周5剂)，在血清(图1a和图1b)和(tbs+triton x-100)(图1c和图1d)提取的海马组织中进行aβ1-40(图1a、图1c)和aβ1-42(图1b和图1d)的elisa定量。结果为每组六只小鼠的平均值+sem。***p《0.001；**p《0.01；*p《0.05。
26.图2a-e显示了用p40
2 maba3-1d每周鼻内处理改善5xfad小鼠的空间学习和记忆的结果。6月龄的5xfad-tg小鼠(每组n＝6)用p40
2 mab a3-1d(25ng/小鼠/周)鼻内处理，每周一次。简言之，将25ng p40
2 mab溶于2μl生理盐水中，将小鼠保持仰卧姿势，并使用移液管将1μl体积注入每个鼻孔。对照5xfad小鼠仅接受2μl生理盐水作为载剂。在30天处理后(每周5剂)，对小鼠进行巴恩斯迷宫(图2a，热图；图2b，延迟；图2c，错误)和t迷宫(图2d，正确转弯；图2e，错误转弯)测试。结果为每组六只小鼠的平均值+sem。***p《0.001；**p《0.01；*p《0.05。
27.图3a-e描述了在5xfad小鼠中用p40
2 mab a3-1d进行的每周鼻内处理不改变运动活性。6月龄的5xfad-tg小鼠(每组n＝6)用p40
2 mab a3-1d(25ng/小鼠/周)鼻内处理，每周一次。简言之，将25ng p40
2 mab溶于2μl生理盐水中，将小鼠保持仰卧姿势，并使用移液管将1μl体积注入每个鼻孔。对照5xfad小鼠仅接受2μl盐水作为载剂。在30天处理后(每周5剂)，测试小鼠的运动活性(图3a，开放场热图；图3b，总距离；图3c，移动时间；图3d，速度；图3e，休息时间)。结果为每组六只小鼠的平均值+sem。ns，不显著。
具体实施方式
28.在本发明中，各种量(例如数量、大小、尺寸、比例等)以范围形式表示。应当理解，量的范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对任何实施方式范围的硬性限制。因此，除非上下文另有明确规定，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各数值。例如，应当认为诸如1至6的范围描述已具体公开了子范围，
如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各数字，如1.1、2、2.3、4.62、5和5.9。这普遍适用，与范围广度无关。所述中间范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于本发明范围，受到所述范围明确排除的限值制约。设定范围包含一个或两个限值时，除非上下文另有明确规定，本发明也包括排除所述限值之一个或两个的范围。
29.本文所用的术语仅仅用来描述具体的实施方式，而不是用于限制任何实施方式。如本文所用，单数形式的“一个”，“一种”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确说明。还应当理解，本说明书所用的术语“包括”、“包含”、“含有”和/或“含”特指存在所陈述的特征、整数、步骤、操作、元件和/或部件，但不排除存在或添加有一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、部件和/或其组合。如本文所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关联的所列项目的任何一项及所有组合。此外，应当理解，以“a、b和c中的至少一个”的形式包括在列表中的项目可以表示(a)；(b)；(c)；(a和b)；(b和c)；(a和c)；或(a、b和c)。类似地，以“a、b和c中的至少一个”的形式包括在列表中的项目可以表示(a)；(b)；(c)；(a和b)；(b和c)；(a和c)；或(a、b和c)。
30.除非上下文中明确说明或显而易见，如本文所用，提及数字或数字范围的术语“约”应理解为指所述数字和数字+/-其10％，或范围值的所列下限以下10％和所列上限以上10％。
31.本公开基于发明人已经在5xfad小鼠中使用ad小鼠模型的发现，通过鼻内途径以非常低的剂量用p402(mab-p40
2 a3-1d)处理能够减少来自海马体的淀粉样斑块的负荷。因此，本公开涉及可用于治疗阿尔茨海默病和其中淀粉样蛋白沉积存在于大脑中的相关疾病的方法和药物组合物和/或制剂。更具体地，本公开涉及方法和药物组合物和/或制剂，包括向有需要的患者鼻内给予有效量的包含p402(mab-p40
2 a3-1d)抗体的药物组合物。
32.细胞因子p40家族有四个成员，包括白细胞介素-12(il-12)、p40单体(p40)、p40-同二聚体(p402)和il-23。此前，在异二聚体规则和同二聚体仅作为旁观者的认识背景下，本领域技术人员认为只有il-23和il-12被赋予生物功能。p402和p40都被认为是功能未知的无活性分子。在wo2012159100中，本发明人证明了针对小鼠p402和p40的中和单克隆抗体(mab)，包括重组p40和/或针对p402的单克隆抗体(单克隆抗体-p40
2 a3-1d)，可用于治疗多发性硬化症和类风湿性关节炎。
33.鼻内组合物
34.鼻内药物给予已被证明比标准的全身给予系统具有许多优点，例如其非侵入性、起效快，并且在许多情况下由于更有针对性的给予而减少了副作用。鼻内给予被认为是治疗神经或神经退行性疾病的一种特别有吸引力的给予途径。全身给予方法通常不能有效地为中枢神经系统提供药物。参见例如keller等,“鼻内给药：药物开发过程中的机遇和毒理学挑战(intranasal drug delivery:opportunities and toxicologic challenges during drug development),”(2021)drug delivery and translational research https://doi.org/10.1007/s13346-020-00891-5.
35.在一些实施方式中，可以滴鼻剂(鼻内地)或使用雾化技术向患者给予药物组合物。雾化器可用于将药物组合物的液体溶液变为可被患者吸入的细雾。发明人确定了这些技术的大量益处。
36.例如，当使用雾化或滴鼻剂作为递送方法时，可显著降低药物组合物的剂量。在某
plaque burden),”(2015)j alzheimers dis.46(1):55
–
61。因此，研究了通过鼻内途径用非常低剂量的p40
2 mab处理是否能够减少5xfad小鼠海马体淀粉样斑块的负荷。
49.6月龄的5xfad tg小鼠(每组n＝6)用p40
2 mab a3-1d以25ng/小鼠的剂量进行鼻内治疗，每周一次，持续一个月。血清(图1a，图1b)和tbs加triton x-100提取的海马部分(图1c，图1d)的elisa显示，与非tg小鼠相比，5xfad小鼠中aβ1-40和aβ1-42显著增加。然而，采用p40
2 mab的处理中，aβ1-40和aβ1-42均显著降低，但对照igg未见该情况(图1a，图1d)。
50.这些结果表明，p40
2 mab的鼻内免疫疗法能够减少5xfad小鼠海马体中的aβ负荷，可能是减少大脑中淀粉样斑块负荷的有用治疗方法，也是阿尔茨海默病的可能治疗方法。
51.实施例2
52.用p40
2 mab对5xfad小鼠进行鼻内处理可改善记忆和空间学习
53.ad中神经保护的最终目的是改善和/或保护记忆。海马体的主要功能是产生和组织长期记忆和空间学习。因此，研究了每周p40
2 mab处理是否也能保护5xfad小鼠的记忆和学习。通过巴恩斯迷宫监测小鼠的空间学习和记忆(图2a-e)。在这里，小鼠被连续训练两天，然后在第三天进行检查。在训练期间，隔夜被剥夺食物的小鼠被置于迷宫中央10厘米高的圆柱形启动室中。10秒后，移除启动室，使小鼠在迷宫中移动，以找出诱饵通道中的彩色食物芯片。与鼠龄匹配的非tg小鼠相比，在5xfad小鼠中观察到显著的认知障碍(图2a-c)。与非tg小鼠相比，5xfad经处理小鼠花费了更长的时间来找到正确的洞(图2a-b)并且产生了更多的错误(图2c)。然而，使用p40
2 mab的每周鼻内免疫疗法显著降低了5xfad小鼠到达目标洞的延迟和错误(图2a-c)。类似地，t迷宫测试也表现出5xfad小鼠的行为表现的显著改善，如正确转弯次数的增加(图2d)和错误转弯次数的减少(图2e)所示。
54.由于巴恩斯迷宫或t迷宫测试中延迟的降低可能与动物运动的增加相混淆，因此还通过开放场检查了这些动物的运动活性，结果如图3a-d所示。在经处理或未处理的5xfad小鼠中，在移动的总距离(图3a、图3b)、速度(图3c)和休息时间(图3d)方面没有观察到显著差异，消除了海马体依赖性行为中运动增加所造成的干扰的可能性。
55.因此，综合来看，目前的结果提供了证据，证明使用针对il-12p40同二聚体的中和mab进行鼻内免疫治疗可对ad患者有益。
56.从本文的描述中可以理解，本公开考虑了多种方面和实施方式，其实例包括但不限于以下列出的方面和实施方式：
57.方法和药物组合物和/或制剂，包括向有需要的患者给予有效量的药物组合物，所述药物组合物包括含有p402(mab-p402a3-1d)抗体的药物组合物。
58.用于治疗阿尔茨海默病和大脑中存在淀粉样蛋白沉积的相关疾病的方法、药物组合物和/或制剂，包括向有需要的患者鼻内给予有效量的包含p402(mab-p40
2 a3-1d)抗体的药物组合物。
59.治疗ad的方法，包括向患者给予至少一种针对p402的单克隆抗体(mab-p40
2 a3-1d)。
60.公开了一种降低脑中淀粉样斑块负荷的方法，其包括向患者给予至少一种抗p402单克隆抗体(mab-p40
2 a3-1d)。
61.公开了阿尔茨海默病的治疗方法，其包括向患者给予重组p40和至少一种针对p402的单克隆抗体(mab-p40
2 a3-1d)的组合。
62.公开了一种降低脑中淀粉样斑块负荷的方法，其包括向患者给予重组p40和至少一种抗p402单克隆抗体(mab-p40
2 a3-1d)的组合。
63.方法和组合物，其中所述药物组合物通过注射、口服、透皮贴剂和/或鼻内给予患者。在一些实施方式中，药物组合物优选由患者吸入。
64.方法，其中所述药物组合物与药学上可接受的运载体或赋形剂一起配制。
65.根据《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》的规定，申请人已于2020年12月3日将包括二十五(25)小瓶抗体(mab)a3-1d的杂交瘤的生物材料保藏于美国弗吉尼亚州马纳萨斯10801大学大道(10801university blvd,manassas,va 20110)的国际保藏机构，美国典型培养物保藏中心(atcc)，分配保藏号pta-126900。保藏的杂交瘤包含针对p402同二聚体的单克隆抗体，其包括mab-p40
2 a3-1d。
66.虽然本文描述了本公开的实施方式，但本领域技术人员理解这些实施方式仅以举例方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可以作出多种改变、变化和替代。应理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代形式可用于实施本发明。所附权利要求书确定了本发明范围，这些权利要求范围内的方法和结构以及其等同物均为本发明所涵盖。

技术特征：
1.一种治疗患者阿尔茨海默病的方法，所述方法包括：向所述患者给予重组p40单体蛋白和至少一种针对p402同二聚体的单克隆抗体的组合，其中所述至少一种针对p402同二聚体的单克隆抗体包括mab-p40
2 a3-1d。2.如权利要求1所述的方法，其中所述重组p40单体蛋白以多个剂量给予。3.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种针对p402同二聚体的单克隆抗体以单剂量给予。4.如权利要求1所述的方法，其中所述重组p40单体以多剂量给予，并且所述至少一种针对p402同二聚体的单克隆抗体以单剂量给予。5.如权利要求1所述的方法，其中所述给予改善阿尔茨海默病的一种或多种症状，所述一种或更多种症状包括记忆力丧失和/或学习缺陷。6.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种针对p402同二聚体的单克隆抗体以多剂量给予。7.如权利要求1所述的方法，其中所述重组p40单体以多剂量给予，并且所述至少一种针对p402同二聚体的单克隆抗体以多剂量给予。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述重组p40单体蛋白和/或至少一种针对p402同二聚体的单克隆抗体鼻内给予所述患者。9.一种降低淀粉样斑块负荷治疗患者阿尔茨海默病的方法，所述方法包括：向所述患者给予重组p40单体蛋白和至少一种针对p402同二聚体的单克隆抗体的组合，其中所述至少一种针对p402同二聚体的单克隆抗体包括mab-p40
2 a3-1d。10.如权利要求9所述的方法，其中所述重组p40单体蛋白以多个剂量给予。11.如权利要求9所述的方法，其中所述至少一种针对p402同二聚体的单克隆抗体以单剂量给予。12.如权利要求9所述的方法，其中所述重组p40单体以多剂量给予，并且所述至少一种针对p402同二聚体的单克隆抗体以单剂量给予。13.如权利要求9所述的方法，其中所述给予改善脑组织中淀粉样蛋白斑块增加的一种或多种症状，所述一种或更多种症状包括记忆力丧失和/或学习缺陷。14.如权利要求9所述的方法，其中所述至少一种针对p402同二聚体的单克隆抗体以多剂量给予。15.如权利要求9所述的方法，其中所述重组p40单体以多剂量给予，并且所述至少一种针对p402同二聚体的单克隆抗体以多剂量给予。16.如权利要求9-15中任一项所述的方法，其中所述重组p40单体蛋白和/或至少一种针对p402同二聚体的单克隆抗体鼻内给予所述患者。

技术总结
本发明整体涉及用于治疗疾病和紊乱的药物组合物。更具体地，本公开涉及用于治疗阿尔茨海默病的免疫疗法，包括使用针对IL-12p40同二聚体的中和单克隆抗体(mAb)的鼻内免疫疗法。法。法。


技术研发人员：K
受保护的技术使用者：拉什大学医学中心
技术研发日：2021.10.27
技术公布日：2023/8/4