评价被验物质通过人肝细胞样细胞而排出的方法与流程

1.本发明涉及一种评价被验物质通过人肝细胞样细胞而排出的方法及具有人肝细胞样细胞的膜的囊状物的制造方法。
2.本技术基于2020年11月25日在日本技术的特愿2020－195476号主张优先权，并将其内容援引于此。


背景技术：

3.肝脏由负责肝功能主体的肝实质细胞和支持肝实质细胞的增殖、生存的肝非实质细胞群构成。肝实质细胞也称为肝细胞。肝非实质细胞群由肝星状细胞、肝窦内皮细胞、kupffer细胞以及胆管上皮细胞等构成。
4.肝细胞将外因性的药物、代谢时产生的物质变换为毒性低的物质，从如下所示的2个排出路径排出。第一个是将被变换的毒性低的物质与胆汁一起排出到毛细胆管内，经由胆囊、肠道作为粪便排出到体外的路径。第二个是将被变换的毒性低的物质排出到肝窦血管内，到达肾脏后，作为尿排出到体外的路径。在这两个排出路径中，已知将外因性的药物、代谢时产生的物质获取到肝细胞内的转运子以及排出被变换的毒性低的物质的转运子均不同。
5.在药物研发中，预筛确定的候选药物大多数在前临床试验的阶段就落选。并且，落选的候选药物多的情况会导致患者的治疗机会的丧失。另外，前临床试验由候选药物的有效性的筛选和候选药物的安全性试验构成，在这些筛选中，使用体外的前临床模型很有用(例如参照非专利文献1～非专利文献3等)。
6.现有技术文献
7.非专利文献
8.非专利文献1：oshikatamaetal.,“developmentofanoxygenationculturemethodforactivatingtheliver-specificfunctionsofhepg2cellsutilizingacollagenvitrigelmembranechamber.”,cytotechnology,vol.68,pp.1801-1811,2016.
9.非专利文献2：jangkjetal.,“reproducinghumanandcross-speciesdrugtoxicitiesusingaliver-chip”,sci.transl.med.,vol.11,issue517,eaax5516,2019,doi:10.1126/scitranslmed.aax5516.
10.非专利文献3：swiftbetal.,“sandwich-culturedhepatocytes:aninvitromodeltoevaluatehepatobiliarytransporter-baseddruginteractionsandhepatotoxicity”,vol.42,issue3,pp.446-471,2010


技术实现要素：

11.本发明鉴于上述情况而完成，提供一种使用用于评价基于人肝细胞样细胞的排出的评价模型来评价被验物质通过人肝细胞样细胞而排出的方法、以及上述评价模型的制造方法。
12.即本发明包括以下的方式。
13.(1)一种方法，是评价被验物质通过人肝细胞样细胞而排出的方法，包括如下步骤：
14.准备含囊状物液体，所述含囊状物液体含有在体外制成的具有人肝细胞样细胞的膜的囊状物以及0～10体积％的悬浮的细胞外基质；
15.在上述含囊状物液体中放入被验物质，使上述被验物质与上述囊状物接触；以及，
16.从上述含囊状物液体取出上述囊状物，测定排出到上述囊状物的内腔的被验物质或其代谢物的浓度。
17.(2)根据(1)所述的方法，其中，上述人肝细胞样细胞是能够进行类器官培养的细胞。
18.(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，上述人肝细胞样细胞具有选自bsep、mrp2、p－gp、mate以及bcrp中的至少1种转运子。
19.(4)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，在上述工序3中，将上述囊状物分解而进行排出到上述囊状物的内腔的被验物质或其代谢物的浓度的测定。
20.(5)根据(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，在上述工序3中，通过液相色谱质谱法进行排出到上述囊状物的内腔的上述被验物质或其代谢物的浓度的测定。
21.(6)根据(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，在上述囊状物的内腔中包含胆汁作为内容物。
22.(7)根据(1)～(6)中任一项所述的方法，其中，上述人肝细胞样细胞的膜为单层膜。
23.(8)一种制造方法，是具有人肝细胞样细胞的膜的囊状物的制造方法，包括如下步骤：
24.将人肝前体细胞或者人肝脏细胞包埋于细胞外基质进行培养，形成培养物；
25.使上述培养物分散而形成分散物；以及，
26.用悬浮有相对于培养基的总体积为0～10体积％的细胞外基质的培养基对上述分散物进行浮游培养，形成上述囊状物。
27.发明效果
28.根据上述方式的方法，可以提供一种使用了用于通过人肝细胞样细胞评价排出的评价模型来评价被验物质通过人肝细胞样细胞而排出的方法。根据上述方式的制造方法，可以提供一种用于通过人肝细胞样细胞评价排出的评价模型。
附图说明
29.图1是实验例1中的评价模型的亮视野图像。
30.图2是在实验例1中的囊状物内获取rho123的评价模型的图像。(a)是亮视野图像，(b)是荧光图像。
31.图3是在实验例5中的培养物的内腔获取rho123的培养物的图像。(a)是亮视野图像，(b)是荧光图像。
32.图4是囊状物的光学显微镜图像。
33.图5是在实验例6中的培养物的内腔获取rho123的培养物的图像。
具体实施方式
34.以下，示出实施方式来进一步详细说明本发明，本发明并不受以下的实施方式任何限定。
35.本说明书中例示的各成分、例如培养基中包含的成分、各工序中使用的成分只要没有特别提及，可以分别单独使用1种，或者可以并用采用2种以上。
36.在本说明书中，表示“a～b”等数值范围的表述与“a以上、b以下”含义相同。另外，在本说明书中，“a～b，优选为a～b”等的表示数值范围的表述与“a以上、b以下”、“a以上、b以下”、“a以上、b以下”以及“a以上、b以下”含义相同。
37.在本说明书中，“包含物质x的培养基”、“物质x的存在下”是指添加有外源性(exogenous)的物质x的培养基、包含外源性的物质x的培养基、或者外源性的物质x的存在下。即，存在于该培养基中的细胞或者组织内源性(endogenous)表达、分泌或者产生该物质x的情况下，内源性的物质x与外源性的物质x被区别开，不包含外源性的物质x的培养基即使包含内源性的物质x也不属于“包含物质x的培养基”的范围。
38.[评价被验物质通过人肝细胞样细胞而排出的方法]
[0039]
本实施方式的方法是评价被验物质(以下，也称为“底物”)通过人肝细胞样细胞而排出的方法(以下，也称为“本实施方式的评价方法”)，具有以下的工序1～工序3。
[0040]
准备含有在体外制成的具有人肝细胞样细胞的膜的囊状物(以下，也称为“本评价模型”)以及0～10体积％的悬浮的细胞外基质的含囊状物液体(以下，也称为“工序1”)；
[0041]
在上述含囊状物液体中放入被验物质，使上述被验物质与上述囊状物接触(以下，也称为“工序2”)；
[0042]
从上述含囊状物液体中取出上述囊状物，测定被排出到上述囊状物内的被验物质或其代谢物的浓度(以下，也称为“工序3”)。
[0043]
本评价模型适合用作评价被验物质通过人肝细胞用细胞而排出的生物体仿生模型(micro physiological system，mps)。生物体仿生模型为了模仿生物体内的人肝组织的结构，需要使人肝细胞具有取向性而配置成薄膜状。为了使人肝细胞具有取向性而配置成薄膜状，以往需要在包埋于细胞外基质的状态下培养人肝前体细胞、人肝脏细胞。如此得到的囊状物处于包埋于细胞外基质的状态。
[0044]
为了对由排出而获取到囊状物内的被验物质的浓度进行定量，在取出获取到囊状物内的被验物质时，需要物理性地除去细胞外基质或使用酶等化学性地除去细胞外基质。然而，在除去细胞外基质时，囊状物的人肝细胞样细胞膜被破坏，囊状物内的被验物质有可能漏出。另一方面，在不除去细胞外基质而从囊状物取出被验物质，由lc－ms等定量被验物质的浓度的情况下，细胞外基质变成噪声，无法正确地测定被验物质的量。根据以上的理由可知在现有的由细胞外基质包埋的状态的囊状物中，难以对排出到囊状物内的被验物质进行定量。
[0045]
与此相对，本实施方式的评价方法中，虽然在含囊状物液体中存在有0～10体积％的细胞外基质，但囊状物并未包埋于细胞外基质。因此，能够从含囊状物液体中不破坏该囊状物并将其取出，容易地定量获取到该囊状物内的被验物质的浓度。
[0046]
通过本实施方式的评价方法，能够从以往针对基于人肝细胞样细胞的被验物质的代谢、药物相互作用、肝毒性、以及转运子活性等使用具有荧光标志的底物、胆汁利用荧光
强度进行的精度低的评价，变为基于液相色谱质谱法进行精度高的定量的评价。
[0047]
〈工序1〉
[0048]
工序1中，准备含有在体外制成的本评价模型、以及0～10体积％的悬浮的细胞外基质的含囊状物液体。
[0049]
本评价模型的囊状物也称为包囊(cyst)，如图4所示，具有由人肝细胞样细胞的膜形成的袋这样的结构。
[0050]
本评价模型优选在人肝细胞样细胞之间构建毛细胆管样结构。通过在人肝细胞样细胞之间具有毛细胆管样结构，从而能够具有紧密连接。
[0051]
本评价模型的内腔优选包含胆汁作为内容物。并且，本评价模型的人肝细胞样细胞优选具有选自bsep(胆盐输出泵，bile salt export pump)、mrp2(多药抗性相关蛋白，multidrug resistance－associated protein2)、p－gp(p-糖蛋白，p－glycoprotein)、mate(多药及毒性化合物外排转运体，multidrug and toxin extrusion)以及bcrp(乳腺癌耐药相关蛋白，breast cancer resistance protein)中的至少1种转运子。这些转运子分别作为针对不同的物质的胆汁排出转运子所公知。
[0052]
通过本评价模型具有毛细胆管样结构，并且本评价模型的人肝细胞样细胞具有上述的转运子，从而能够将获取到人肝细胞样细胞内的被验物质或其代谢物通过上述的转运子从人肝细胞样细胞内经由毛细胆管样结构向人肝细胞样细胞外排出，与胆汁一起积蓄到囊状物的内腔。
[0053]
本评价模型的人肝细胞样细胞除了上述的转运子之外，可以进一步具有ntcp(钠离子/牛磺胆酸盐共转运多肽，na
+
－taurocholate cotransporting polypeptide)、oatp(有机阴离子转运多肽，organic anion transporting polypeptide)家族转运子、oct1(有机阳离子转运蛋白，organic cation transporter 1)等获取转运子。
[0054]
本评价模型的人肝细胞样细胞进一步表达cyp1a2、cyp2a6、cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6、cyp2e1以及cyp3a4等代谢酶的基因。
[0055]
本评价模型的人肝细胞样细胞的膜优选为单层膜。由于人肝细胞样细胞的膜为单层膜，所以通过本评价模型能够评价每一细胞的被验物质的影响。
[0056]
本评价模型的体积为4e
－6
～3e
－2
mm3，优选为3e
－5
～1e
－2
mm3，更优选为1e
－4
～4e
－3
mm3。
[0057]
本评价模型的人肝细胞样细胞从功能和性状的稳定性的观点考虑优选是能够进行类器官培养的细胞。类器官培养是指干细胞的三维自组织化培养，通过类器官培养得到的细胞也称为类器官。
[0058]
含囊状物液体中包含的、囊状物的含有比例为10～2000个/ml，优选为50～1000个/ml，更优选为100～500个/ml。
[0059]
作为细胞外基质，可举出基底膜中包含的成分、细胞间隙中存在的糖蛋白质等。作为基底膜中包含的成分，可举出iv型胶原、层粘连蛋白、硫酸类肝素多糖蛋白以及巢蛋白(entactin)等。
[0060]
含囊状物液体中的细胞外基质的含有比例相对于含囊状物液体的总体积为0～10体积％，优选为0.001～5体积％，更优选为0.1～4体积％，进一步优选为1～3体积％。
[0061]
含囊状物液体优选是包含后述的“具有人肝细胞样细胞的膜的囊状物的制造方
法”中的用于浮游培养的培养基、细胞外基质以及具有人肝细胞样细胞的膜的囊状物的液体。
[0062]
〈工序2〉
[0063]
工序2中，向工序1中准备的含囊状物液体中放入被验物质，使被验物质与本评价模型接触。
[0064]
作为被验物质，可举出天然化合物库、合成化合物库、现有药物库和代谢物库等。被验物质中可以使用各种分子尺寸的有机化合物或者无机化合物。作为有机化合物的例子，可举出核酸、肽、蛋白质、脂质(单纯脂质、复合脂质(磷酸甘油酯、鞘脂、糖基甘油酯和脑苷脂等)、前列腺素、类异戊二烯、萜烯、类固醇、多酚、儿茶素、以及维生素(b1、b2、b3、b5、b6、b7、b9、b12、c、a、d以及e等)等。
[0065]
作为被验物质，可举出医药品、营养食品等中包含的成分。作为被验物质，可举出植物提取液、细胞提取液以及培养上清液等。通过同时添加两种以上的被验物质，由此也能够调查被验物质间的相互作用、协同作用等。作为被验物质，可以来自于天然物，也可以人工合成。
[0066]
使被验物质与本评价模型接触的期间通常为10分钟以上3天以下，优选为30分钟以上到1天时间。被验物质与本评价模型的接触可以分多次进行。
[0067]
被验物质被获取到本评价模型的人肝细胞样细胞，接着，被获取的被验物质排出到本评价模型的内腔，或被获取的被验物质通过本评价模型的人肝细胞样细胞的代谢酶代谢而被排出到本评价模型的内腔。
[0068]
〈工序3〉
[0069]
工序3中，从工序2后的含囊状液体取出本评价模型，测定排出到本评价模型的内腔的被验物质或其代谢物的浓度。
[0070]
在测定浓度前，优选使用磷酸缓冲食盐水(pbs)等清洗从含囊状液体取出的本评价模型。由此，能够减少细胞外基质向浓度测定环境的代入。
[0071]
取出的本评价模型优选通过分解该人肝细胞样细胞的膜而取出本评价模型的内腔的被验物质。作为分解人肝细胞样细胞的膜的方法，例如可举出使用甲醇等的化学方法以及均化等的物理方法。
[0072]
被验物质或其代谢物的浓度的测定可以根据被验物质或其代谢物的种类，采用质量分析、液相色谱、免疫学方法等。作为免疫学方法，例如可举出荧光免疫测定法(fia法)、酶免疫测定法(eia法)等。其中，从定量性优异考虑，被验物质或其代谢物的浓度的测定优选通过液相色谱质量分析(lc－ms)法进行。
[0073]
通过工序3，能够评价被验物质的毒性。例如调查使被验物质接触后的人肝细胞样细胞的状态，评价被验物质的毒性。作为人肝细胞样细胞的评价方法，可以通过生存率、细胞形态、培养液中的肝损伤标志物(例如got、gpt)的存在量进行。
[0074]
[具有人肝细胞样细胞的膜的囊状物的制造方法]
[0075]
本实施方式的具有人肝细胞样细胞的膜的囊状物的制造方法(以下，也称为“本实施方式的制造方法”)具有以下的工序a～工序c。
[0076]
将人肝前体细胞或者人肝脏细胞包埋于细胞外基质进行培养，形成培养物(以下，也称为“工序a”)；
[0077]
使上述培养物分散而形成分散物(以下，也称为“工序b”)；
[0078]
用悬浮有相对于培养基的总体积为0～10体积％的细胞外基质的培养基对上述分散物进行浮游培养，形成具有人肝细胞样细胞的膜的囊状物(以下，也称为“工序c”)。
[0079]
通过本实施方式的制造方法制造的具有人肝细胞样细胞的膜的囊状物可以用作本实施方式的评价方法的本评价模型。
[0080]
对于本实施方式的制造方法的各工序，以下说明详细内容。
[0081]
〈工序a〉
[0082]
工序a中，将人肝前体细胞或者人肝脏细胞包埋于细胞外基质进行培养，形成培养物。形成的培养物含有人肝细胞样细胞。
[0083]
对于人肝前体细胞而言，通过从人多能性干细胞，在例如包含选自wnt、nodal、激活素a等tgfβ信号转导促进剂及它们任意的组合中的因子的培养基中进行培养，从而分化诱导成胚体内胚层。接着，通过在包含选自fgf、bmp以及它们的任意的组合中的因子的培养基中进行培养，从而能够得到人肝前体细胞。作为人多能性干细胞，可举出人胚性干细胞(hesc)和人类人工多能性干细胞(hipsc)。
[0084]
人肝脏细胞中通常包含肝实质细胞以及胆管细胞、肝窦内皮细胞、kupffer细胞、中皮细胞以及肝星状细胞等肝非实质细胞。这些细胞中，优选包含肝非实质细胞。
[0085]
由于能够得到基因的表现型接近于野生型的人肝细胞的人肝细胞样细胞，因此作为工序a，优选使用人肝脏细胞。
[0086]
人肝前体细胞或者人肝脏细胞通过包埋于细胞外基质进行培养，从而使其增殖和成熟化，形成人肝细胞样细胞。作为细胞外基质，可举出与工序1中例示的物质同样的物质。
[0087]
作为将人肝前体细胞或者人肝脏细胞包埋于细胞外基质进行培养的方法，可举出将人肝前体细胞或者人肝脏细胞与细胞外基质前体进行混合，使细胞外基质前体聚合而形成细胞外基质，接着，将培养基重叠多层进行培养的方法。
[0088]
作为工序a的培养条件，通常是30℃～40℃，优选为37℃的温度。作为其它培养条件，通常在5体积％左右的co2浓度条件气氛下进行。
[0089]
培养时间可以根据细胞数、细胞的状态等适当地进行调整。培养基可以每隔1天～3天更换一次。另外，在工序a中，通过多次进行传代培养，可得到功能和性状稳定的培养物。
[0090]
优选工序a的培养为类器官培养。通过类器官培养得到的类器官的转运子的表达量、代谢酶的基因的表达量多，另外，囊状物的人肝细胞样细胞的膜的经上皮电阻高，能够形成紧密连接。
[0091]
(培养基)
[0092]
作为工序a中使用的培养基，优选包含选自分裂促进性增殖因子、wnt信号转导促进剂、rho激酶(rock)信号转导抑制剂、il－6家族细胞因子以及烟酰胺等涉及增殖的因子；转化生长因子β(tgf－β)信号转导抑制剂等抑制分化的因子；维生素甲酸、dapt(γ-分泌酶抑制剂，γ－secretase inhibitor)、二甲基亚砜(dmso)以及地塞米松(dex)等涉及成熟化的因子；以及毛喉素(forskolin)等涉及细胞受体的活化的因子中的至少1种以上。
[0093]
在对人肝前体细胞进行培养的情况下，优选培养基中含有涉及成熟化的因子，优选含有选自dapt、dmso以及dex中的至少1种因子。
[0094]
在培养人肝脏细胞的情况下，优选培养基中含有涉及成熟化的因子、涉及增殖的
因子、抑制分化的因子以及涉及细胞受体的活化的因子，作为涉及成熟化的因子，优选含有dapt，作为涉及增殖的因子，优选含有il－6家族细胞因子、分裂促进性增殖因子、wnt信号转导促进剂以及rock信号转导抑制剂。
[0095]
(1)分裂促进性增殖因子
[0096]
分裂促进的增殖因子是诱导细胞分裂开始的因子。作为分裂促进性增殖因子，可举出上皮生长因子(egf)、线维芽细胞增殖因子(fgf)、肝细胞增殖因子(hgf)等。作为fgf，优选能够与fgf受体2(fgfr2)或者fgf受体4(fgfr4)结合的物质，优选为fgf2、fgf4、fgf7或者fgf10，特别优选为fgf10。其中，优选为egf、fgf10或者hgf，更优选全部包含egf、fgf10以及hgf。
[0097]
培养基中包含的egf和hgf的各自浓度通常为10ng/ml～500ng/ml，优选为15ng/ml～100ng/ml，更优选为20ng/ml～80ng/ml，进一步优选为25ng/ml～50ng/ml。
[0098]
培养基中包含的fgf的浓度通常为20ng/ml～500ng/ml，优选为50ng/ml～300ng/ml，更优选为80ng/ml～150ng/ml，进一步优选为90ng/ml～110ng/ml。
[0099]
(2)wnt信号转导促进剂
[0100]
wnt信号是涉及干细胞的增殖、未分化性的维持的信号。通过wnt信号转导促进剂，能够上调控制wnt信号。作为wnt信号转导促进剂，例如可举出wnt激动剂、lgr5激动剂、糖原合成酶(gsk)抑制剂等。
[0101]
作为wnt激动剂，可举出wnt1、wnt2、wnt2b、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt8a、wnt8b、wnt9a、wnt9b、wnt10a、wnt10b、wnt11以及wnt16等wnt家族成员。这些中，优选为wnt3a。
[0102]
已知afamin蛋白有助于wnt家族成员的稳定化和可溶化。作为wnt激动剂，可以作为wnt家族成员与afamin蛋白的复合体使用。
[0103]
培养基中包含的wnt激动剂的含有比例优选相对于培养基的总体积通常为1体积％～50体积％，优选为10体积％～30体积％，更优选为15体积％～25体积％。
[0104]
作为lgr5激动剂，可举出r－spondin1、r－spondin2、r－spondin3以及r－spondin4等。这些激动剂中，优选为r－spondin1。
[0105]
培养基中包含的lgr5激动剂的含有比例相对于培养基的总体积通常为1体积％～50体积％，优选为5体积％～30体积％，进一步优选为5体积％～15体积％。
[0106]
作为gsk抑制剂，可举出chir99021(cas编号：252917－06－9)、sb216763(cas编号：280744－09－4)、sb415286(cas编号：264218－23－7)、chir98014(cas编号：252935－94－7)、azd1080(cas编号：612487－72－6)以及ly2090314(cas编号：603288－22－8)等。这些中，优选为chir99021。
[0107]
培养基中包含的gsk抑制剂的浓度通常为0.1μm～10μm。应予说明，这里“m”表示mol/l，之后同样。
[0108]
作为wnt信号转导促进剂，优选组合wnt激动剂和lgt5激动剂而使用。
[0109]
(3)rock信号转导抑制剂
[0110]
通过rock信号的下调控制，肝细胞能够获得增殖能力。作为rock信号转导抑制剂，可举出y－27632(cas编号：146986－50－7)、法舒地尔(fasudil)(cas编号：105628－07－7)、y39983(cas编号：203911－26－6)、wf－536(cas编号：539857－64－2)、slx－2119(cas
编号：911417－87－3)、氮杂苯并咪唑－氨基呋咱(azabenzimidazole－aminofurazans)(cas编号：850664－21－0)、de－104、h－1152p(cas编号：872543－07－6)、rho激酶α抑制剂(rokαinhibitor)、xd－4000、hmn－1152、4－(1－氨基烷基)－n－(4－吡啶基)环己烷羧酰胺(4－(1－aminoalkyl)－n－(4－pyridyl)cyclohexane－carboxamides)、rho抑制素(rhostain)、ba－210，ba－207，ki－23095以及vas－012等。这些中，优选为y－27632。
[0111]
培养基中包含的rock信号转导抑制剂的浓度通常为1μm～20μm，优选为5μm～15μm。
[0112]
(4)tgf－β信号转导抑制剂
[0113]
通过tgf－β信号的下调控制，能够抑制分化。作为tgf－β信号转导抑制剂，可举出伴随着smad2/3的磷酸化的tgf－β抑制剂和伴随着smad1/5/9的磷酸化的bmp抑制剂等。
[0114]
作为tgf－β抑制剂，可举出a83－01(cas编号：909910－43－6)、sb－431542(cas编号：301836－41－9)、sb－505124(cas编号：694433－59－5)、sb－525334(cas编号：356559－20－1)、ly364947(cas编号：396129－53－6)、sd－208(cas编号：627536－09－8)、sjn2511(cas编号：446859－33－2)等。这些中优选为a83－01。
[0115]
培养基中包含的tgf－β抑制剂的浓度通常为0.05μm～50μm，优选为0.5μm～30μm，更优选为1μm～15μm，更优选为4μm～6μm。
[0116]
作为bmp抑制剂，可举出noggin(nog)、differential screening－selected gene aberrative in neuroblastoma(dan)以及dan样蛋白质等。这些中优选为noggin。
[0117]
培养基中包含的bmp抑制剂的浓度通常为10ng/ml～100ng/ml，优选为15ng/ml～50ng/ml，更优选为20ng/ml～30ng/ml。
[0118]
(5)il－6家族细胞因子
[0119]
通过il－6家族细胞因子，可以增强人肝前体细胞的增殖。作为il－6家族细胞因子，可举出白介素－6(il－6)、白介素－11(il－11)、抑瘤素m(osm)、白血病抑制因子(lif)、心肌营养素－1(ct－1)、以及睫状神经营养因子(cntf)等。这些中，优选为il－6。
[0120]
培养基中包含的il－6家族细胞因子的浓度通常为10ng/ml～1.0μg/ml，优选为50ng/ml～500ng/ml，更优选为80ng/ml～200ng/ml，进一步优选为90ng/ml～110ng/ml。
[0121]
(6)维生素甲酸
[0122]
通过在培养基中含有维生素甲酸，由此能够增大毛细胆管并增大细胞的取向性。
[0123]
培养基中包含的维生素甲酸的浓度通常为1μm～30μm。
[0124]
(7)烟酰胺
[0125]
通过在培养基中含有烟酰胺，从而能够提高细胞增殖能力。
[0126]
培养基中包含的烟酰胺的浓度通常为5mm以下。
[0127]
(8)毛喉素
[0128]
通过在培养基中进一步包含毛喉素(forskolin)，从而能够提高amp的细胞内浓度，其结果是能够使细胞受体再活化。
[0129]
培养基中包含的毛喉素的浓度通常为0.1μm～100μm，优选为1μm～50μm，更优选为5μm～15μm。
[0130]
(9)dapt、dmso以及dex
[0131]
通过在培养基中含有dapt、dmso、dex，从而能够增加向人肝细胞样细胞的成熟化。
[0132]
(10)其它成分
[0133]
培养基除了包含上述成分之外，可以进一步包含胃泌素、神经生物系补充剂以及n－乙酰半胱氨酸等。
[0134]
作为神经生物系补充剂，可举出b27补充剂(thermo fisher scientific公司)和n2补充剂(thermo fisher scientific公司)等的包含胰岛素的补充剂。
[0135]
培养基可以在基本培养基中添加上述的各成分进行制备。作为基本培养基，可举出dulbecco改良eagle培养基(dmem)、基础培养基(mem)、基因敲除－dmem(ko－dmem)、glasgow基本培养基(g－mem)、eagle基础培养基(bme)、dmem/ham f12、advanced dmem/ham f12(advanced dmem/f12)、iscove改良dulbecco培养基、ham f－10、ham f－12、199培养基、rpmi1640培养基以及人血浆模拟培养基等。
[0136]
〈工序b〉
[0137]
工序b中，使工序a中形成的培养物分散而形成分散物。
[0138]
工序a中形成的培养物由细胞外基质包埋。工序b中，将细胞外基质粉碎而取出培养物。作为对细胞外基质进行粉碎的方法，可举出将细胞外基质物理性地粉碎的方法以及使用酶化学性地粉碎的方法。这些方法中，由于对细胞的损伤少，优选物理性地粉碎细胞外基质的方法。
[0139]
接着，使从细胞外基质取出的培养物分散而形成分散物。分散是指通过对细胞进行酶处理、物理处理等分散处理，分离成100个以下的细胞基团、优选为50个以下的细胞基团、更优选为单一细胞。作为分散处理，可举出机械分散处理、细胞分散液处理以及细胞保护剂添加处理等。这些处理可以适当地进行组合。这些处理中优选为细胞分散液处理。
[0140]
作为用于细胞分散液处理的细胞分散液，例如可举出包含胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、dnase以及木瓜蛋白酶等酶类；乙二胺四乙酸等螯合剂中的任一者的溶液。作为市售的细胞分散液，可举出thermo fisher scientific公司制的tryple select、tryple express等。作为机械分散处理，可举出移液处理或者用刮刀的刮擦操作。
[0141]
在进行分散处理前，为了防止细胞死亡，利用细胞保护剂进行处理。作为细胞保护剂，可举出线维芽细胞增殖因子(fibroblast growth factor，以下，也称为“fgf”)、肝素、rock抑制剂、胰岛素样生长因子(insulin－like growth factor，以下也称为“igf”)、血清以及血清代替物等。
[0142]
〈工序c〉
[0143]
在工序c中，用悬浮有相对于培养基的总体积为0～10体积％的细胞外基质的培养基对工序b中形成的分散物进行浮游培养，形成具有人肝细胞样细胞的囊状物。
[0144]
作为工序c中的细胞外基质，可举出与上述工序1中例示的细胞外基质同样的物质。
[0145]
作为工序c中的培养基中包含的细胞外基质的含有比例，相对于培养基的总体积为0～10体积％，优选为0.001～5体积％，更优选为0.1～4体积％，进一步优选为1～3体积％。
[0146]
作为细胞外基质的悬浮方法，可举出将培养基和细胞外基质前体混和，接着，使细胞外基质前体凝胶化而得到细胞外基质的方法。作为使细胞外基质前体混和的方法，可举
出在冰浴上移液的方法。混和是指以目视观察在培养基中观察不到细胞外基质的状态。
[0147]
作为工序c中的培养基，可举出上述工序a中例示的培养基。
[0148]
作为工序c中的培养条件，可以是在动物细胞的培养中一般采用的条件。例如可举出30℃～40℃，优选为37℃的温度，5体积％的co2浓度气氛条件下。
[0149]
培养时间可以根据细胞数、细胞的状态等适当地调整。从培养开始通常为1天以上1周以下。
[0150]
在将由本实施方式的制造方法制造的具有人肝细胞样细胞的膜的囊状物用作本实施方式的评价方法的本评价模型的情况下，由于在工序c的培养后的培养基中包含本评价模型和0～10体积％的悬浮的细胞外基质，因此能够将该培养基用作本实施方式的评价方法的工序1的含囊状物液体。
[0151]
实施例
[0152]
以下，通过实验例说明本发明，但本发明并不限于以下的实验例。
[0153]
[实验例1]
[0154]
(人肝脏细胞的培养物的制作)
[0155]
在37℃的水浴中融解人初代冻结浮游肝细胞(bioprridic公司制，hep187－s)，在加入了无血清培养基(在advanced dmem/f12中加入了hepes、glutamax、penicilin/stereptomycin的培养基)的50ml管中进行悬浮并离心。离心后，除去上清液，然后，在无血清培养基中悬浮，制备人肝脏细胞悬浮液。将来自该悬浮液的20000个人肝脏细胞与50μl的基质胶(bd biosciences公司)进行混合，接种于24孔组织培养板，在37℃下孵育10分钟直到基质胶完全聚合。聚合后，将下述表1所示的500μl的培养基重叠多层，在37℃、5体积％co2存在下进行培养，得到人肝脏细胞的培养物。得到的培养物形成了由人肝细胞样细胞构成的膜所形成的内腔。得到的培养物重复同样的操作进行传代培养。
[0156]
[表1]
[0157][0158]
[实验例2]
[0159]
(囊状物(本评价模型)的制造)
[0160]
在6孔培养板(住友电木公司制，ms―8006r)中，添加实验例1的传代培养后的人肝脏细胞的培养物、表1的培养基、相对于培养基为2体积％的基质胶，在5体积％co2存在下，在37℃下浮游培养3天时间，形成囊状物。将用光学显微镜(倍率：400倍(keyence公司制，bz－x700))拍摄囊状物而得到的本评价模型的亮视野图像示于图1。
[0161]
[实验例3]
[0162]
(本评价模型的rho123的排出)
[0163]
在实验例2中，在浮游培养后的培养液中加入作为p糖蛋白质(p－gp)的底物的rho123(10μm)。在5体积％co2存在下，在37℃下进行30分钟的rho123向本评价模型的内腔的获取。利用移液在低吸附15ml管中放入包含本评价模型的培养液进行离心。离心后，除去上清液，利用pbs进行清洗后，利用光学显微镜(倍率：400倍(keyence社制，bz－x700))，确认到在本评价模型的内腔排出了rho123。将亮视野图像(图2(a))和荧光图像(图2(b))示于图2。
[0164]
如图2所示，确认到在本评价模型的内腔中排出了rho123。
[0165]
[实验例4]
[0166]
(获取到本评价模型的内腔的rho123的定量)
[0167]
将实验例3的获取了rho123的本评价模型与甲醇混和并使人肝细胞样细胞灭亡。混和后进行离心，提取上清液。对于上清液，进行基于液相色谱质量分析(lc/ms)计(shimadzu公司制，lcmstm－8040)的分析，根据获取到内腔的rho123的浓度和量以及培养液中的rho123的浓度，算出向本评价模型的内腔输送的比例。将lc/ms分析条件示于以下，将结果示于表3。
[0168]
(lc条件)
[0169]
柱：xbridge c18 3.5μm，2.1mm
×
50mm
[0170]
柱温度：40℃
[0171]
内部标准物质：甲苯磺丁脲
[0172]
洗脱溶剂：a液(0.1质量％的甲酸溶液)，b液(乙腈)
[0173]
梯度条件：参照表2
[0174]
运行时间：7分钟
[0175]
流速：0.4ml/分钟
[0176]
进样量：3μl
[0177]
[表2]
[0178][0179]
(ms条件)
[0180]
模式：正(
※
标准物质表示负)
[0181]
[表3]
[0182]
本评价模型内的rho123的浓度615.4nm本评价模型内的rho123的量0.123nmol培养液中的rho123的浓度10μm输送到本评价模型内的比例1.23％
[0183]
如表3所示，能够对获取到本评价模型的内腔的rho123的量进行定量，另外，能够算出培养液中的rho123中的、输送到本评价模型的内腔的比例。
[0184]
[实验例5]
[0185]
在实验例1中制成的、包含培养后的由基质胶包埋的培养物的培养液中添加rho123(10μm)，在5体积％co2存在下在37℃下进行30分钟的rho123向培养物的内腔内的获取。用光学显微镜(倍率：400倍(keyence公司制，bz-x700))确认到在培养物的内腔获取了rho123。将亮视野图像(图3(a))和荧光图像(图3(b))示于图3。
[0186]
为了测定获取的rho123的量，通过移液和酶处理(corning(注册商标)细胞回收液)分解聚合的基质胶，其结果与基质胶的分解同时地由肝脏类器官获取的rho123泄露，无法测定被获取的rho123的量。
[0187]
[实验例6]
[0188]
(本评价模型的cdfda的排出)
[0189]
在实验例2中，向浮游培养后的培养液中加入2μm、5μm或者10μm的作为mrp2的底物的cdfda(羧基二氯荧光素二乙酸酯，carboxydichlorofluorescein diacetate)。在5体积％co2存在下，在37℃下进行30分钟的cdfda向本评价模型的内腔的获取。通过移液向低吸附15ml管中放入包含本评价模型的培养液，进行离心。离心后，除去上清液，利用pbs清洗后，利用光学显微镜(倍率：400倍(keyence公司制，bz-x700))确认到向本评价模型的内腔
排出了cdfda。将结果示于图5。
[0190]
工业上的可利用性
[0191]
根据本实施方式的方法，可以提供使用了用于通过人肝细胞样细胞评价排出的评价模型的、评价被验物质通过人肝细胞样细胞而代谢或排出的方法。

技术特征：
1.一种方法，是评价被验物质通过人肝细胞样细胞而排出的方法，具有如下步骤：准备含囊状物液体，所述含囊状物液体含有在体外制成的具有人肝细胞样细胞的膜的囊状物以及0～10体积％的悬浮的细胞外基质；在所述含囊状物液体中放入被验物质，使所述被验物质与所述囊状物接触；以及，从所述含囊状物液体取出所述囊状物，测定被排出到所述囊状物的内腔的被验物质或其代谢物的浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人肝细胞样细胞是能够进行类器官培养的细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述人肝细胞样细胞具有选自bsep、mrp2、p－gp、mate以及bcrp中的至少1种转运子。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，在所述工序3中，将所述囊状物分解而进行排出到所述囊状物的内腔的被验物质或其代谢物的浓度的测定。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，在所述工序3中，通过液相色谱质谱法进行排出到所述囊状物的内腔的所述被验物质或其代谢物的浓度的测定。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，在所述囊状物的内腔中包含胆汁作为内容物。7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述人肝细胞样细胞的膜为单层膜。8.一种制造方法，是具有人肝细胞样细胞的膜的囊状物的制造方法，具有如下步骤：将人肝前体细胞或者人肝脏细胞包埋于细胞外基质进行培养，形成培养物；使所述培养物分散而形成分散物；以及，用悬浮有相对于培养基总体积为0～10体积％的细胞外基质的培养基对所述分散物进行浮游培养，形成所述囊状物。

技术总结
评价被验物质通过人肝细胞样细胞而排出的方法具有如下步骤：准备含囊状物液体，所述含囊状物液体含有在体外制成的具有人肝细胞样细胞的膜的囊状物以及0～10体积％的悬浮的细胞外基质；在上述含囊状物液体中放入被验物质，使上述被验物质与上述囊状物接触；以及，从上述含囊状物液体取出上述囊状物，测定排出到上述囊状物的内腔的被验物质或其代谢物的浓度。度。


技术研发人员：增田范生 荻原琢男
受保护的技术使用者：一般社团法人健大翻译研究中心
技术研发日：2021.11.24
技术公布日：2023/8/4