抑制非特异性核酸扩增的方法与流程

1.本发明涉及扩增核酸的方法。例如，本发明涉及对于由核糖核酸(rna)模板扩增核酸有用的组合物和方法，具体而言，涉及用于使用阴离子性聚合物由逆转录反应进行核酸扩增的组合物和方法。更具体而言，涉及在阴离子性聚合物存在下通过实时逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)进行的核酸扩增。本发明的方法能够特异性检测例如咽拭液、唾液试样、痰液试样、粪便试样、血液试样、环境擦拭试样等中的rna病毒来源的rna、生物试样等中的生物体来源rna。本发明能用于生命科学研究、临床诊断、食品卫生检查、环境检查等。


背景技术：

2.核酸扩增法是将数个拷贝的靶核酸扩增到能可视化水平、即数亿个拷贝以上的技术，不仅广泛用于生命科学研究领域，还广泛用于基因诊断、临床检查之类的医疗领域、或食品和环境中的微生物检查等中。代表的核酸扩增法为pcr(聚合酶链式反应，polymerase chain reaction)。pcr是以下述步骤为一个循环并通过重复进行该循环来扩增试样中的靶核酸的方法，所述步骤为：(1)基于热处理的dna变性(由双链dna解离为单链dna)，(2)引物与模板单链dna的退火，(3)使用了dna聚合酶的前述引物的延伸。有时在相同温度下分2步进行退火和延伸。
3.对rna进行分析时，作为该pcr的前段，实施将模板rna转化为cdna的逆转录(reverse transcription；rt)。将其称为rt-pcr。该rt-pcr大致分为：(1)非连续地实施rt、pcr的两步式rt-pcr、(2)连续地实施rt、pcr的一步式rt-pcr这2种。在rt-pcr中，一步式rt-pcr由于在基因检查和病毒检查中处理能力高、避免反应过程中开关反应容器所致的污染而优选。
4.一步式rt-pcr的检测灵敏度与逆转录酶的逆转录效率和dna聚合酶的dna合成效率有很大关系。迄今为止，为了提高逆转录酶的逆转录效率和dna聚合酶的dna合成效率，研究了酶活性得到改善的氨基酸突变体(专利文献1)、各种添加剂等的利用(专利文献2)。还已知在包含逆转录酶和dna聚合酶的双酶体系中的一步式rt-pcr中，逆转录酶本身抑制pcr，作为降低由逆转录酶所致的抑制的方法，还已知添加核酸聚合物的方法(专利文献3)。
5.除了逆转录酶的逆转录效率和dna聚合酶的dna合成效率之外，非特异性基因扩增也会影响检测灵敏度。非特异性基因扩增是指pcr中对靶基因以外的核酸序列进行扩增。已知pcr易受色素、蛋白质、糖类等夹杂物的影响，夹杂物抑制反应或发生非特异性核酸扩增。因此通常由试样进行核酸扩增的情况，需要事先对核酸进行纯化。然而核酸纯化的操作繁杂且花费时间，有在操作中发生污染的危险性。另外，试样中的目标核酸含量较少时，有时也无法进行回收。基于这些原因，需求即使在使用未纯化的试样的情况下也抑制非特异反应、简便且高效地扩增靶核酸的方法。
6.另外，想要同时检测多个核酸扩增产物的情况下、想要节约试剂、耗材、时间等的情况下、模板样品量受限的情况下等，有时进行使用多个引物组在1个反应液中同时扩增2个以上的靶区域的pcr法、即所谓多重pcr法。然而，多重pcr中，有时容易产生引物二聚体、
发生非特异反应，难以高灵敏度地扩增靶核酸。因此，需要开发出即使在进行多重pcr的情况下也抑制非特异反应、简便且高效地扩增靶核酸的方法。
7.进而，一步式rt-pcr中，由于在同一反应容器中实施所有反应，因此发生非特异性扩增会使原本要发生的靶基因扩增所需的脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)等底物耗尽。由此而无法扩增出充足量的靶基因，从而导致检测灵敏度降低。
8.降低一步式rt-pcr的非特异扩增的方法已有很多报道。例如已知：扩增条件(提高退火温度、循环数的降低、酶量的减量、酶的种类变更、dntp浓度的降低、mg浓度、mn浓度的降低、模板dna浓度的降低等)的最适化、引物的设计变更、利用了抗体、适体的热启动法的利用、利用认为可提高特异性的修饰寡核苷酸(pna、lna等)。
9.然而，尽管上述方法有时在抑制非特异扩增方面是有效的，但效果并不充分，或也会抑制特异性扩增的情况较多。进而，由于需要rt-pcr条件的研究、引物设计的研究等，因此费时的情况也较多。因此，期望开发出能够抑制一步式rt-pcr中非特异扩增的简便的进一步方法。
10.现有技术文献
11.专利文献
12.专利文献1：国际公开第2018096961a号小册子
13.专利文献2：日本特开2018-000138号公报
14.专利文献3：日本专利第4777497号公报
15.专利文献4：日本特开2012-24039号公报
16.专利文献5：日本特开2017-023110号公报
17.专利文献6：日本特开2016-182112号公报
18.非专利文献
19.非专利文献1：journal of clinical microbiology，nov.2005，p.5452-5456
20.非专利文献2：j virol methods.2004sep 1；120(1)：33-40.
21.非专利文献3：published online january29，2020，https：//doi.org/10.1016/s0140-6736(20)30251-8
22.非专利文献4：世界卫生组织(who)主页
23.非专利文献5：国立感染症研究所主页“病原体检测手册2019-ncov”(https：//www.niid.go.jp/niid/images/lab-manual/2019-ncov20200217.pdf)
24.非专利文献6：j.animal science and biotechnology，第5卷、2014年、第45页


技术实现要素：

25.发明要解决的问题
26.本发明是鉴于上述现有技术而完成的，提供：在由模板rna利用一步式rt-pcr进行核酸扩增时进一步有用的手段，所述手段虽然为简便的方法，例如即使是由未纯化试样进行核酸扩增、利用多重pcr的核酸扩增，也能够有效地抑制非特异性核酸扩增，能够高灵敏度地进行靶核酸的特异性检测。
27.用于解决问题的方案
28.本发明人等鉴于上述情况而进行了深入研究，结果发现：通过使用阴离子性聚合
物，从而能够抑制一步式rt-pcr中非特异性核酸扩增，能够高灵敏度地进行靶核酸的特异性检测，以至完成了本发明。
29.代表的本发明如下所述。
30.[项目1]一种核酸扩增方法，其为由试样利用一步式rt-pcr法进行核酸扩增的方法，所述方法包括以下的工序：
[0031]
(1)制备一步式rt-pcr反应液的工序，所述一步式rt-pcr反应液包含试样、阴离子性聚合物、及(i)逆转录酶和dna聚合酶或(ii)具有逆转录活性的dna聚合酶；以及
[0032]
(2)将反应容器密闭后，实施一步式rt-pcr反应的工序；
[0033]
前述一步式rt-pcr反应液中的阴离子性聚合物的浓度为0.001％以上。
[0034]
[项目2]根据项目1所述的核酸扩增方法，其中，前述工序(1)中使用的试样为未经纯化工序的生物体来源试样、环境试样或细胞来源试样。
[0035]
[项目3]根据项目1或2所述的核酸扩增方法，其中，前述工序(1)中使用的试样为选自由唾液、痰液、咽拭液、鼻拭液、漱口液、粪便、肺吸出物、脑脊液、漱口液、泪液、培养细胞、培养上清液、擦拭检查试样、土壌试样、和污水试样组成的组中的至少1种。
[0036]
[项目4]根据项目1～3中任一项所述的核酸扩增方法，其中，前述工序(1)中使用的试样为悬浮于选自由水、生理盐水、缓冲液、和sputazyme酶液组成的组中的至少1种的悬浮液、或者它们的离心上清液或浓缩物。
[0037]
[项目5]根据项目1～4中任一项所述的核酸扩增方法，其中，前述工序(1)中使用的试样为可能包含rna病毒的试样。
[0038]
[项目6]根据项目1～5中任一项所述的核酸扩增方法，其中，利用1个一步式rt-pcr反应液特异性扩增2个以上的靶区域。
[0039]
[项目7]根据项目6所述的核酸扩增方法，其中，2个以上的靶区域为试样中可能包含的rna病毒的基因组rna中的靶区域。
[0040]
[项目8]根据项目5～7中任一项所述的核酸扩增方法，其中，rna病毒为具有包膜的rna病毒。
[0041]
[项目9]根据项目8所述的核酸扩增方法，其中，具有包膜的rna病毒为选自由冠状病毒科病毒、黄病毒科病毒、披膜病毒科病毒、正粘病毒科病毒、弹状病毒科病毒、本雅病毒科病毒、副粘病毒科病毒、和丝状病毒科病毒组成的组中的至少1种。
[0042]
[项目10]根据项目8或9所述的核酸扩增方法，其中，具有包膜的rna病毒为选自由sars(严重急性呼吸综合征)冠状病毒、mers(中东呼吸综合征)冠状病毒、和sars-ncov-2冠状病毒组成的组中的至少1种。
[0043]
[项目11]根据项目5～7中任一项所述的核酸扩增方法，其中，rna病毒为不具有包膜的rna病毒。
[0044]
[项目12]根据项目11所述的核酸扩增方法，其中，不具有包膜的rna病毒为选自由杯状病毒科病毒、星状病毒科病毒、小核糖核酸病毒科病毒、戊肝病毒科病毒、和呼肠孤病毒科病毒组成的组中的至少1种。
[0045]
[项目13]根据项目1～12中任一项所述的核酸扩增方法，其中，阴离子性聚合物是使具有选自由磺酸基、羧基、磷酸基、硫酸基、和膦酸基组成的组中的至少1种阴离子性官能团的单体聚合而得到的聚合物。
[0046]
[项目14]根据项目1～13中任一项所述的核酸扩增方法，其中，阴离子性聚合物为选自由聚肌苷酸、聚胞苷酸、聚鸟苷酸、聚腺苷酸、聚脱氧肌苷酸、聚脱氧胞苷酸、聚脱氧鸟苷酸、聚脱氧腺苷酸、卡拉胶、肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素、透明质酸、硫酸乙酰肝素、软骨素、硫酸皮肤素、聚乙烯基磺酸、聚乙烯基膦酸、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚丙烯酸/磺酸共聚物、和聚丙烯酸/马来酸共聚物组成的组中的至少1种。
[0047]
[项目15]根据项目1～14中任一项所述的核酸扩增方法，其中，阴离子性聚合物的平均分子量为1000～5000000。
[0048]
[项目16]根据项目1～15中任一项所述的核酸扩增方法，其中，dna聚合酶为选自由taq、tth和它们的突变体组成的组中的至少1种。
[0049]
[项目17]根据项目1～16中任一项所述的核酸扩增方法，其特征在于，逆转录酶的来源为选自由莫洛尼氏鼠白血病病毒(mmrv)、禽成髓细胞瘤病毒(amv)和它们的突变体组成的组中的至少1种。
[0050]
[项目18]根据项目1～17中任一项所述的核酸扩增方法，其中，前述工序(1)中的一步式rt-pcr反应液还包含对应于靶区域的1个以上的引物对。
[0051]
[项目19]根据项目1～18中任一项所述的核酸扩增方法，其中，前述工序(1)中的一步式rt-pcr反应液还包含对应于靶区域的杂交探针。
[0052]
[项目20]根据项目1～19中任一项所述的核酸扩增方法，其中，前述工序(1)中的一步式rt-pcr反应液还包含选自由具有在氨基酸中的氨基上连接有3个甲基的结构的季铵盐(以下称为“甜菜碱样季铵盐”)、牛血清白蛋白、甘油、二醇、明胶、和极性有机溶剂组成的组中的至少1种。
[0053]
[项目21]根据项目20所述的核酸扩增方法，其中，甜菜碱样季铵盐为甜菜碱或l-肉碱。
[0054]
[项目22]根据项目1～21中任一项所述的核酸扩增方法，其中，前述工序(1)中的一步式rt-pcr反应液中的阴离子性聚合物的浓度为0.0025～0.05％。
[0055]
[项目23]一种抑制非特异扩增的方法，其特征在于，由未经纯化工序的试样通过一步式rt-pcr进行核酸扩增时，使一步式rt-pcr反应液中共存阴离子性聚合物。
[0056]
[项目24]根据项目23所述的抑制非特异扩增的方法，其中，一步式rt-pcr反应液中以0.001％以上的量共存阴离子性聚合物。
[0057]
[项目25]一种核酸扩增方法，其特征在于，为通过利用1个反应液由试样特异性扩增2个以上的靶区域的一步式rt-pcr进行核酸扩增的方法，使该反应液中共存阴离子性聚合物。
[0058]
[项目26]一种含有阴离子性聚合物的试剂，其用于在由未经纯化工序的试样通过一步式rt-pcr进行的核酸扩增中抑制非特异扩增。
[0059]
[项目27]根据项目26所述的试剂，其中，将一步式rt-pcr反应液中的阴离子性聚合物的浓度调整为0.001％以上的量而使用。
[0060]
[项目28]一种试剂，其含有阴离子性聚合物，所述试剂用于项目1～25中任一项中记载的基于一步式rt-pcr反应的核酸扩增方法。
[0061]
[项目29]一种试剂盒，其含有项目26～28中任一项所述的试剂，所述试剂盒用于基于一步式rt-pcr反应的核酸扩增方法。
[0062]
发明的效果
[0063]
根据本发明，通过在反应液中共存阴离子性聚合物而能够抑制一步式rt-pcr反应中的非特异性核酸扩增，由此能够增加刻意扩增的靶核酸的特异性扩增产物的产生量，因此能够改善检测灵敏度。
[0064]
例如，根据本发明，对于可能包含以2019年产生的sars-ncov-2为主的rna病毒的试样也可以获得同样优异的效果。另外，根据本发明，即使不事先从包括血液、粪便(排泄便、直肠粪便)、呕吐物、尿液、痰液、淋巴液、血浆、射精液体、肺吸出物、脑脊液、咽喉擦拭液、鼻腔擦拭液、漱口液、唾液、泪液在内的生物体来源试样、环境擦拭试样、包含培养细胞或培养上清液的试样等包含大量夹杂物的试样中对核酸进行纯化的情况下，也能够实现这些试样中包含的冠状病毒等rna病毒等的高灵敏度检测。本发明能用于生命科学研究、临床诊断、食品卫生检查、环境检查等。
附图说明
[0065]
图1是示出阴离子性聚合物对唾液待检体(3μl)所致的rt-pcr抑制的效果的图。
[0066]
图2是示出阴离子性聚合物对唾液待检体(8μl)所致的rt-pcr抑制的效果的图。
[0067]
图3是示出对于唾液待检体所致的rt-pcr抑制而言阴离子性聚合物对灵敏度所产生的影响的图。
具体实施方式
[0068]
以下，示出本发明的实施方式对本发明进行进一步详细说明，但本发明不受这些实施方式限定。需要说明的是，本说明书中使用的术语只要没有特别声明，则应当理解为该领域中通常使用的含义。
[0069]
另外，本说明书中记载的全部非专利文献和专利文献在本说明书中作为参考而援用。本说明书中的“～”是指“以上且以下”，例如在说明书中，若记载为“x～y”，则表示“x以上且y以下”。另外，本说明书中的“和/或”是指任意一者或两者。另外，本说明书中，单数形的表述只要没有特别声明，则应当理解为也包括其复数形的概念。
[0070]
本发明的一实施方式为如下方法：在将试样中包含的rna作为模板，通过一步式rt-pcr反应进行核酸扩增的方法中，使阴离子性聚合物共存的同时进行一步式rt-pcr反应，从而抑制非特异性核酸扩增且进行核酸扩增。此处，非特异性核酸扩增是指一步式rt-pcr中合成模板rna的靶序列以外的核酸序列。
[0071]
通常将rna作为模板扩增核酸(例如，基因)时，首先进行将模板rna转化为cdna的逆转录反应(也称为rt反应)，将由此得到的cdna通过pcr反应扩增。一步式rt-pcr是指：通过连续或并行地进行前述那样的rt反应和pcr反应而由模板rna进行核酸扩增的方法。作为一步式rt-pcr，已知：利用两种不同的酶(逆转录酶和dna聚合酶)连续地实施rt反应和pcr反应的双酶体系的一步式rt-pcr反应；利用一种酶(tth dna聚合酶等同时具有逆转录酶活性的dna聚合酶)连续或并行地实施rt反应和pcr反应的单酶体系的一步式rt-pcr等。本发明可以在任意的一步式rt-pcr中实施。
[0072]
一步式rt-pcr优选在同一反应容器中实施所有的反应。如此在同一反应容器中实施一步式rt-pcr时，若发生非特异性核酸扩增，则原本要发生的靶核酸扩增所需的脱氧核
糖核苷三磷酸(dntp)之类的底物等耗尽，无法以充足量扩增靶核酸，有导致检测灵敏度降低的担心。因此，一步式rt-pcr反应中能够抑制非特异性核酸扩增的本发明的方法能够抑制这样的靶核酸的检测灵敏度的降低。因此本发明的核酸扩增方法也可以称为非特异扩增抑制方法，例如，也可以称为增大特异性核酸扩增产物的产生量的方法、改善靶核酸的特异性扩增的方法等。
[0073]
作为模板rna，可以是源自从生物体采集的组织、体液或分泌物(例如，可能包含病毒等病原性微生物的生物体组织、体液或分泌物)等生物试样、环境试样、细胞(例如，培养细胞等)的rna，例如可以是从生物试样、环境试样或细胞中提取的rna，可以是在提取处理后进一步进行了纯化的rna(例如，通过乙醇沉淀、柱纯化等该领域中公知的任意的纯化手段处理过的纯化rna)等，也可以是未经这样的rna纯化工序的含rna试样，可以是任意的rna。
[0074]
一个优选的实施方式中，本发明为利用一步式rt-pcr由未经纯化工序的生物体来源试样、环境试样或细胞来源试样进行核酸扩增的方法。此处纯化是指：将各种试样中可能包含的组织、细胞壁、其它夹杂物质与试样中的靶核酸rna分离，使用苯酚或者苯酚/氯仿等将核酸分离，或通过离子交换树脂、玻璃过滤器或者具有蛋白聚集作用的试剂将核酸分离。因此，本发明中“未经纯化工序的试样”可列举出各种试样(例如，生物体来源试样)本身、或者使用水等溶剂将液体的试样稀释所得者、将固体的试样添加至水等溶剂中并施加热使其破碎所得者等。例如，脏器、细胞等，成为扩增对象的核酸存在于试样的组织内、细胞内、包膜、衣壳等外壳内时，为了提取前述核酸而将这些组织、细胞、外壳等破坏的行为(基于物理处理的破坏、使用了表面活性剂等的破坏等提取行为)不属于本发明中所谓的纯化。另外，用水、缓冲液等将前述方法中得到的试样或各种试样本身稀释的行为也不属于本发明中所谓的纯化。
[0075]
作为一个方式，由组织提取rna时，组织的部位没有特别限制，可以是所有的组织。由组织提取rna的方法通常包括基于细胞滤网、胰蛋白酶处理等的细胞的分离工序，但该方法没有特别限制。
[0076]
作为其它方式，由细胞、包膜或者衣壳等外壳提取rna时，没有特别限制，可以是所有种类的细胞等。例如，细胞的个数可以通过细胞分选仪进行适宜调整。例如，也可以使用由少数(例如1～100个、优选为1～10个、更优选为1或2个、更优选为1个)的细胞提取出的rna。由细胞等提取rna的方法通常包括如下工序：使用包含细胞溶解剂等的细胞溶解用组合物或预处理用组合物(例如，用于由病毒等提取rna的预处理用组合物)，将细胞等溶解的工序。作为细胞溶解剂等，例如可列举出表面活性剂、离液剂等。表面活性剂包括阴离子型表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠)、阳离子型表面活性剂(例如，十六烷基三甲基溴化铵)、非离子型表面活性剂(例如，辛基酚乙氧基化物、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯硬脂基醚、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯)、和两性表面活性剂(例如，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸)。作为离液剂，例如可列举出脲、高氯酸锂盐等锂盐。细胞溶解剂通常溶解于水(优选为无核酸酶的水)中并以水溶液的形态使用。细胞溶解用组合物也可以包括蛋白酶(例如，蛋白酶k)、rnase抑制剂、这些中的两种以上的组合。
[0077]
细胞溶解用组合物或预处理用组合物任选包含或不包含上述阴离子性聚合物。使用上述包含阴离子性聚合物的细胞溶解用组合物或预处理用组合物并将由细胞提取的rna
作为模板rna使用时，用于一步式rt-pcr反应中的组合物具有无需另行添加上述阴离子性聚合物的优点。
[0078]
作为其它方式，由生物试样提取rna时，作为生物试样，例如可列举出粪便(排泄便、直肠粪便)、尿液、呕吐物、唾液、痰液、咽拭液、鼻拭液、漱口液、肺吸出物、脑脊液、泪液、鼻水、血液(全血)、血浆、血清等，没有限定，可以用于源自生物体的所有试样，可以根据目的进行适宜选择。优选的实施方式中，作为生物试样，使用唾液、痰液、咽拭液、鼻拭液、漱口液、粪便、肺吸出物、脑脊液、漱口液、泪液、培养细胞、培养上清液等生物试样。作为靶标的模板rna可以是生物体来源的rna，也可以是源自生物试样中包含的微生物或病毒等的rna。另外，前述试样可以未经纯化工序而直接供于检测，为了降低夹杂物对反应的影响，得到更稳定的检测结果，也可以是将前述试样悬浮于水、生理盐水或缓冲液中而得到的试样。作为上述缓冲液，没有特别限定，可列举出hanks缓冲液、tris缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、hepes缓冲液、tricine(三(羟甲基)甲基甘氨酸)缓冲液等。另外，粘性强的生物试样(例如，包含粘性强的痰液的试样)的情况下，虽然没有特别限定，但可以为用sputazyme酶液处理后的试样。
[0079]
作为进一步的其它方式，可以实施本发明以由擦拭检查试样等环境试样中的rna中进行核酸扩增。例如，本发明可以用于检测上述那样的擦拭检查试样、土壌试样、污水试样等中的靶rna，但没有特别限定，也可以使用源自环境的任意试样。为了阐明病毒、细菌的污染途径、把握设施环境等的污染状況，擦拭检查是有用的。本发明中，擦拭检查没有特别限定，是指例如用棉棒等擦拭相关区域、设备等，溶出至水、缓冲液中，用聚乙二醇(peg)沉淀等进行浓缩的试样。作为具体的擦拭检查的要点，可示例出“擦拭待检体的诺如病毒检测法的改良”(http://idsc.nih.go.jp/iasr/32/382/dj3824.html)等，但没有特别限定，广泛包括基于此的方法。作为擦拭位置的例子，可列举出案板、厨刀、毛巾、餐具等烹饪设备类、冰箱的把手、洗手间、浴室的门把手、卫生间、厨房、洗手间、浴室等的水龙头、烹饪者的手、手指、浴室、洗手间、洗脸池、扶手、客厅等设施等。另外，尽管不是擦拭检查，但作为环境检测，还能用于污水试样的浓缩试样。
[0080]
本发明中，一步式rt-pcr反应液中添加的模板rna的浓度例如为1～10000pg/μl、优选为10～1000pg/μl、更优选为1～100pg/μl，但不限定于这些。
[0081]
成为本发明的对象的rna病毒可以是不具有源自脂质双层膜的包膜的rna病毒，也可以是具有包膜的rna病毒。在特定的优选的实施方式中，本发明在具有包膜的rna病毒的核酸扩增中抑制非特异扩增的效果方面优异。
[0082]
具体而言，作为不具有包膜的rna病毒(也称为“非包膜rna病毒”等)，可列举出星状病毒科病毒(例如，星状病毒)；杯状病毒科病毒(例如，札幌病毒、诺如病毒)；小核糖核酸病毒科病毒(例如，甲型肝炎病毒、埃可病毒、肠病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)；戊肝病毒科病毒(例如，戊型肝炎病毒)；呼肠孤病毒科病毒(例如，轮状病毒)等，没有限定，优选用于杯状病毒科病毒和呼肠孤病毒科病毒的检测，更优选用于诺如病毒、札幌病毒、轮状病毒的检测，进一步优选用于诺如病毒、轮状病毒的检测，尤其用于诺如病毒的检测。
[0083]
作为具有包膜的rna病毒(也称为“包膜rna病毒”)，可列举出黄病毒科病毒(例如，丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、寨卡病毒、猪瘟病毒)；披膜病毒科病毒(例如，风疹病毒、基
孔肯亚病毒)；冠状病毒科病毒(例如，sars冠状病毒、mers冠状病毒、sars-ncov-2冠状病毒)；正粘病毒科病毒(例如，流感病毒)；弹状病毒科病毒(例如，狂犬病病毒)；本雅病毒科病毒(例如，克里米亚-刚果出血热病毒、汉坦病毒)；副粘病毒科病毒(例如，麻疹病毒、人rs病毒)；线状病毒科病毒(例如，埃博拉)等，没有特别限定。从更进一步可靠地获得本发明的更高效果的观点出发，优选用于冠状病毒科病毒的检测，更优选用于sars冠状病毒、mers冠状病毒、sars-ncov-2冠状病毒的检测，尤其用于sars-ncov-2冠状病毒(也称为sars-cov-2)的检测。
[0084]
冠状病毒科病毒是引起包括感冒在内的呼吸道感染的致病病毒，据说在感冒的流行期约10～35％左右是由冠状病毒引起的。还已知会发生突变型病毒，已知会发生罕见的sars(严重急性呼吸综合征)冠状病毒、mers(中东呼吸综合征)冠状病毒、新型冠状病毒感染(covid-19)冠状病毒(sars-ncov-2)等致死性的严重的呼吸系统疾病。因此，不言而喻，简便、迅速、高灵敏度地检测冠状病毒在临床诊断、食品卫生检查、环境检测等方面是重要的，本发明对于这些冠状病毒的高灵敏度检测特别有用。
[0085]
在现有冠状病毒的病原体检测中，开发出来电子显微镜法、基于elisa的免疫学抗原检测法、或利用了核酸扩增技术的病毒基因的检测法。在这些检测法中，广泛使用了能够高灵敏度地检测冠状病毒的核酸扩增技术，开发出了与其相关的一些技术(例如，非专利文献1、非专利文献2、专利文献4)。
[0086]
其中，对于2019年确认产生的突变型冠状病毒sars-ncov-2，在病毒基因组rna的解析完成后立即建立了使用核酸扩增技术的检测方法(例如，非专利文献3、非专利文献4)。在日本，国立感染研究所的“病原体检测手册2019-ncov”中记载了用于检测sars-ncov-2的方法(非专利文献5)。这些方法中，试样中包含的冠状病毒的检测中伴随有试样中病毒rna的提取和纯化工序。病毒rna的提取和纯化工序、尤其纯化工序是繁杂、需要花费大量的作业时间的。近些年，在流感病毒的检测中，已知将咽拭液试样与包含水溶性有机溶剂和表面活性剂的预处理液混合而得到的病毒提取液作为试样的方法(专利文献5、专利文献6)。另外，k.kang等人报道了：能够直接利用rt-pcr从猪血清样品中检测高致病性北美猪生殖器呼吸综合征病毒rna(非专利文献6)。这些方法中，通过省略rna的提取和纯化工序，从而将试样中包含的rt-pcr的反应抑制物质带入反应液中。rt-pcr的反应抑制物质根据试样的种类而有较大差异。例如，唾液试样中带入了大量的多糖类、作为消化酶的rnase等pcr反应抑制物质。此外，也已知病毒的灭活和rna的提取条件根据病毒种类而有较大差异，但现有技术文献中，完全没有提及针对冠状病毒的效果(专利文献5、专利文献6)。目前，期望开发出：从包含冠状病毒、特别是sars-ncov-2的咽喉/鼻拭液、唾液、痰液、粪便试样等生物试样、擦拭环境试样中，在无需rna的纯化工序的情况下、通过一步式rt-pcr能够迅速地检测的方法。本发明在这些方法中是特别有利的，原因在于即使是由未纯化试样进行核酸扩增也抑制非特异反应且能够进行高灵敏度的检测。
[0087]
本发明中，阴离子性聚合物是指通过以阴离子性单体为主的聚合而形成的聚合物。例如，本发明中使用的阴离子性聚合物是以具有选自由磺酸基、羧基、磷酸基、硫酸基、和膦酸基组成的组中的至少1种阴离子性官能团的单体为主进行聚合而得到的聚合物，优选为以磺酸基作为单体进行聚合而得到的聚合物。另外，以rna、dna为主的核酸分子也是阴离子性聚合物。试样中包含的与靶标不同的核酸分子可以与反应液中的逆转录酶或dna聚
合酶结合而引起非特异性核酸扩增。虽期望不受理论的束缚，但在本发明中，通过在反应液体系中添加能与逆转录酶或dna聚合酶结合的阴离子性聚合物，从而竞争跟与靶标不同的核酸分子的结合，结果期待发挥抑制非特异性核酸扩增的效果。
[0088]
作为前述阴离子性聚合物，只要发挥本发明的效果就没有特别限定，作为代表性例子，可列举出核酸聚合物(聚肌苷酸、聚胞苷酸、聚鸟苷酸、聚腺苷酸、聚脱氧肌苷酸、聚脱氧胞苷酸、聚脱氧鸟苷酸、聚脱氧腺苷酸)、多糖类(卡拉胶、肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素、透明质酸、硫酸乙酰肝素、软骨素、硫酸皮肤素)、聚乙烯基磺酸、聚乙烯基膦酸、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚丙烯酸/磺酸共聚物、聚丙烯酸/马来酸共聚物等。
[0089]
前述阴离子性聚合物可以为盐的形态。例如可以为碱金属盐(钠盐、钾盐等)、碱土金属盐(钙盐、镁盐)等，可以为水合物盐。优选为碱金属盐，更优选为钠盐、钾盐，可以进一步优选为钠盐。
[0090]
前述阴离子性聚合物的平均分子量只要发挥本发明的效果就没有特别限定。需要说明的是，本说明书中平均分子量是指重均分子量。阴离子性聚合物的平均分子量取决于作为构成单元的单体的分子量和聚合度，可以为例如1000以上、优选为5000以上、进一步优选为10000以上、进而更优选50000以上。另外，阴离子性聚合物的平均分子量的上限值也只要发挥本发明的效果就没有特别限定，可以为例如为5000000以下、优选为1000000以下、更优选5000000以下。
[0091]
一步式rt-pcr反应液中的前述阴离子性聚合物浓度(所谓反应液中的最终浓度)只要发挥本发明的效果就没有特别限定，但从可靠地发挥较高的本发明的效果的观点出发，优选为0.001％(v/v％)以上。从能够期待更高的非特异反应抑制效果的观点出发，一步式rt-pcr反应液中的阴离子性聚合物的浓度优选0.002％以上，更优选0.0025％以上，进一步优选0.005％以上，更进一步优选0.008％以上，例如可以为0.01％以上、0.02％以上、0.04％以上。一步式rt-pcr反应液中的阴离子性聚合物浓度的上限只要发挥本发明的效果就没有特别限定，例如可列举出可以为0.1％以下、优选为0.05％以下。需要说明的是，事先对试样进行纯化或预处理的情况下，在该实施纯化或预处理的反应液中配混阴离子性聚合物，将该反应液添加至一步式rt-pcr反应液中进行核酸扩增时，优选以最终被带入一步式rt-pcr反应液中的阴离子性聚合物的浓度在上述范围内的方式来进行调整。
[0092]
本发明的一个实施方式为核酸扩增方法，其特征在于，其为由试样利用一步式rt-pcr法进行核酸扩增的方法，所述方法包括以下的工序：
[0093]
(1)制备包含试样、阴离子性聚合物、及(i)逆转录酶和dna聚合酶或(ii)具有逆转录活性的dna聚合酶的一步式rt-pcr反应液的工序；以及
[0094]
(2)将反应容器密闭后，实施一步式rt-pcr反应的工序；
[0095]
前述一步式rt-pcr反应液中的阴离子性聚合物的浓度为0.001％以上。
[0096]
利用上述核酸扩增方法，能够抑制非特异性核酸扩增并以高特异性有效地扩增试样中的模板rna。
[0097]
此处，前述工序(1)中，进行逆转录反应和随后的核酸扩增反应即可，以包含(i)逆转录酶和dna聚合酶这两者的双酶反应体系、或以包含(ii)具有逆转录活性的耐热性dna聚合酶的单酶反应体系，均能够进行一步式rt-pcr反应。在前述工序(1)之前，任选实施或不实施如下工序：由试样将rna纯化的工序、将试样与包含酸性或碱性溶液、有机溶剂、表面活
性剂等的处理液混合并进行预处理的工序、对前述混合液进行热处理的工序等。阴离子性聚合物包含在实施一步式rt-pcr反应的反应液中即可。阴离子性聚合物可以包含在一步式rt-pcr反应液中，在事先对试样进行纯化或预处理的情况下，也可以在该实施了纯化或预处理的处理液中配混阴离子性聚合物，在将处理液添加至一步式rt-pcr反应液中时带入反应体系中。
[0098]
前述工序(1)和(2)优选在同一容器中进行。即，在工序(1)和(2)之间，优选不将全部混合液或一部分混合液转移到其它容器中。进而，工序(2)中，优选将反应容器密闭后不进行反应容器的盖子的开闭。
[0099]
前述工序(2)中的rt-pcr循环由1.逆转录反应、2.pcr这两步构成。各步骤的前后可以包括用于激活热启动酶的热处理工序。1中的逆转录反应的温度根据耐热性dna聚合酶的逆转录活性和引物与探针的tm值来确定，至少为25℃以上即可。更优选为37℃以上。2的pcr中，可以包括：[1]基于热处理的dna变性(由双链dna解离为单链dna)；[2]引物向模板单链dna的退火；[3]使用了dna聚合酶的前述引物的延伸这3个步骤。[2]和[3]可以在相同温度下实施而作为2步进行。为了实施迅速的rt-pcr，前述rt-pcr反应中使用的热循环仪将前述[2]和[3]的步骤的总计延伸时间设定60秒以下、优选设定45秒以下、更优选设定30秒以下的测定程序是理想的。需要说明的是，本说明书中“pcr的延伸时间”是指在热循环仪中的设定温度。
[0100]
向前述混合液中添加的一步式rt-pcr溶液包含逆转录酶和dna聚合酶。优选使用作为兼具逆转录酶活性的dna聚合酶的tth dna聚合酶、taq dna聚合酶等。更优选使用两种酶、逆转录酶与dna聚合酶中的至少两种酶。
[0101]
作为前述一步式rt-pcr反应液中包含的逆转录酶的来源，只要能将rna转化为dna就没有特别限定，可示例出mmlv(莫洛尼鼠白血病病毒，moloney murine leukemia virus)-rt、amv-rt(禽成髓细胞瘤病毒，avian myeloblastosis virus)、hiv-rt、rav2-rt、eiav-rt、生氢氧化碳嗜热菌(生氢氧化碳嗜热菌，carboxydothermus hydrogenoformam)dna聚合酶)、其突变体。作为特别优选的例子，可列举出mmlv-rt、amv-rt、或它们的突变体。
[0102]
作为前述一步式rt-pcr反应液中包含的dna聚合酶，可列举出taq、tth、bst、kod、pfu、pwo、tbr、tfi、tfl、tma、tne、vent、deepvent、它们的突变体，没有特别限定。更优选使用taq、tth或它们的突变体。特别优选使用tth或其突变体。进而，为了提高非特异反应抑制效果，通过与抗dna聚合酶抗体的组合使用、或者通过化学修饰向dna聚合酶中导入热不稳定嵌段基团而在逆转录反应期间抑制dna聚合酶的酶活性，可以用于热启动pcr。
[0103]
本说明书中，dna聚合酶的突变体是指：与作为其来源的野生型dna聚合酶的氨基酸序列具有例如85％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、尤其优选为99％以上的序列一致性、且与野生型dna聚合酶同样地具有扩增dna的活性和根据需要将rna转换为cdna的活性的突变体。此处，作为计算氨基酸序列的一致性的方法，可以利用本领域中公知的任意手段来进行。例如，可以使用市售的或能够通过远程通信线路(因特网)而利用的解析工具来计算，作为一个例子，通过使用美国国家生物技术信息中心(ncbi)的同源性算法blast(局部序列排比检索基本工具)http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/中缺省(初始设定)的参数，能够计算出氨基酸序列的一致性。另外，本发明中可以使用的突变体可以是：由在作为其来源的野生型dna聚合酶的氨基酸序列中置换、缺失、插入
和/或添加(以下也将这些统称为“突变”)了1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的、与野生型dna聚合酶同样地具有将rna转换为cdna的活性和扩增dna的活性的多肽。此处1个或多个例如可以是1～80个、优选为1～40个、更优选为1～10个、进一步优选为1～5个，进而更优选为1～3个，没有特别限定。
[0104]
作为本发明中使用的一步式rt-pcr反应液，除了包含逆转录酶和dna聚合酶之外还可以包含缓冲剂、作为适当的盐的镁盐或锰盐、脱氧核苷三磷酸、对应于检测对象的病毒rna的检测对象区域的引物对，进而根据需要可以包含添加剂。
[0105]
作为本发明中使用的缓冲剂，没有特别限定，可列举出tris、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、双-三(羟甲基)甲基甘氨酸(bis-tricine)、羟乙基甘氨酸(bicine)等。用硫酸、盐酸、乙酸、磷酸等将ph调节为6～9、更优选调节为ph7～8。另外，作为所添加的缓冲剂的浓度，以10～200mm、更优选以20～150mm来使用。此时，为了设为适于反应的离子条件，可加入盐溶液。作为盐溶液，可列举出氯化钾、乙酸钾、硫酸钾、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵等。
[0106]
作为本发明中使用的dntp，可加入datp、dctp、dgtp、dttp各0.1～0.5mm，最常见的是加入0.2mm左右。通过代替dttp和/或使用dutp作为一部分，还可以预防交叉污染。作为镁盐，可示例出氯化镁、硫酸镁、乙酸镁，作为锰盐，可示例出氯化锰、硫酸锰、乙酸锰等，优选加入1～10mm左右。
[0107]
进而，作为一步式rt-pcr反应液中包含的添加剂，优选包含选自由具有在氨基酸中的氨基上连接有3个甲基的结构的季铵盐(以下称为“甜菜碱样季铵盐”)、牛血清白蛋白、甘油、二醇、明胶、和极性有机溶剂组成的组中的至少1种。
[0108]
作为前述甜菜碱样季铵盐，可列举出甜菜碱(三甲基甘氨酸)、l-肉碱等，只要是具有在氨基酸中的氨基上连接有3个甲基的结构的季铵盐就没有特别限定。甜菜碱样季铵盐所具有的结构是在分子内具有稳定的正、负两种电荷的化合物，显示出表面活性剂那样的性质，认为会引起病毒结构的不稳定化。进而，已知促进dna聚合酶的核酸扩增。优选的上述甜菜碱样季铵盐浓度为0.1m～2m、更优选为0.2m～1.2m。
[0109]
作为前述一步式rt-pcr反应液中包含的牛血清白蛋白，优选至少为0.5mg/ml以上、更优选至少为1mg/ml以上。夹杂物较多的试样中，牛血清白蛋白的浓度优选为2mg/ml以上、进一步优选为3mg/ml以上，能够实现良好的检测。
[0110]
前述一步式rt-pcr反应液中包含的明胶源自牛、猪等动物的皮肤、骨骼、肌腱、或者鱼的鳞片、皮肤，认为有助于pcr酶的稳定化。作为使用浓度，优选使pcr扩增稳定化但不妨碍荧光检测的程度。优选为1～5％、进一步优选为1～2％。虽然对于明胶的来源没有特别限定，但是与源自牛、猪的明胶相比，源自鱼的明胶在凝胶强度低、反应液的操作性良好方面优选。
[0111]
进而，还可以与该技术领域中已知促进rt-pcr的物质组合来使用。本发明中有用的促进物质例如可列举出甘油、多元醇、蛋白酶抑制剂、单链结合蛋白(ssb)、t4基因32蛋白、trna、含硫或乙酸的化合物类、二甲基亚砜(dmso)、甘油、乙二醇、丙二醇、三亚甲基二醇、甲酰胺、乙酰胺、甜菜碱、四氢嘧啶、海藻糖、葡聚糖、聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)，四甲基氯化铵(tmac)、四甲基氢氧化铵(tmah)、四甲基乙酸铵(tmaa)、聚乙二醇、tritonx-100、tritonx-114、吐温20(tween20)，诺乃洗涤剂p40、briji58等，但不限定于这些。进而为了减少反应抑制，还可以包含乙二醇-双(2-氨基乙醚)-n,n,n’,n
’‑
四乙酸(egta)、1,2-双(邻氨
基苯氧基)乙烷-n,n,n’,n
’‑
四乙酸(bapta)那样的螯合剂。
[0112]
进而，作为一步式rt-pcr反应液中包含的添加剂，也可以包含极性有机溶剂。极性是指分子内存在的电子偏置，将分子内的正电荷与负电荷的重心不一致的分子称为极性分子。由极性分子构成的溶剂称为极性溶剂。极性溶剂中，通过使用由有机化合物构成的极性有机溶剂，能使核酸、蛋白质之类的生物分子的高级结构变得不稳定。通过利用该性质，从而在一步式rt-pcr反应中或预处理工序中，使病毒的结构蛋白的疏水键等变弱，也能使衣壳结构变得不稳定。已知极性有机溶剂针对病毒的衣壳结构的不稳定化效果因病毒的种类而异。可认为这是由于病毒所具有的衣壳蛋白、包膜的性质的不同而疏水性键等的强度不同所致。
[0113]
作为前述极性有机溶剂，具体而言，可列举出乙醇、甲醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、三乙胺、二甲基甲酰胺、六甲基磷酰三胺、二甲基亚砜、丙酮、乙腈、乙醇、甲醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、吡啶等，但不限定于此。优选为甲醇、三乙胺、二甲基亚砜、丙酮。另外，也可以是包含这些极性有机溶剂中的2种以上的混合溶液。对于该极性有机溶剂作为衣壳蛋白的变性剂的下限浓度而言，也取决于极性有机溶剂、其它添加剂的种类，但只要是使衣壳蛋白变性的浓度就没有特别限定，另外，由于衣壳蛋白、包膜因病毒的种类而不同，因此每种病毒的极性有机溶剂的有效浓度不同，但通常极性溶剂相对于待检体量的有效浓度为10％以上且低于100％、更优选为30％以上且90％以下、进一步优选为50％以上且85％以下。
[0114]
前述极性有机溶剂可以与1种以上的表面活性剂、还原剂、螯合剂、金属盐组合使用。
[0115]
已知前述极性有机溶剂通常也为pcr的抑制剂。因此，在前述极性有机溶剂中，选择蛋白质变性所需的浓度与允许引入pcr中的浓度之间的差异较小者，依次添加极性有机溶剂、试样、一步式rt-pcr反应液，从而在同一容器中简便地进行从衣壳蛋白的变性到一步式rt-pcr反应为止的检测操作，中途无需进行容器打开关闭。作为这样的极性有机溶剂的例子，特别优选列举出二甲基亚砜。例如，将二甲基亚砜1μl和试样1μl混合，加入一步式rt-pcr液48μl时，反应液中所带入的二甲基亚砜的浓度为2％。即使带入rt-pcr液中，2％的二甲基亚砜也是可接受的浓度。
[0116]
本发明的方法中，前述工序(1)中一步式rt-pcr反应液优选进一步包含对应于靶区域的1个以上的引物对。作为本发明中使用的引物对，例如在检测对象为试样中包含的rna病毒的情况下，可列举出：作为对应于该rna病毒的基因组rna中的靶区域的引物对的、一个引物与另一个引物的dna延伸产物互补的2种一对引物。另外，作为另一方式，也可列举出包含2对以上的上述引物的所谓多重pcr。在利用1个一步式rt-pcr反应液特异性扩增2个以上的靶区域的多重pcr中，由于是在多种引物对共存的情况下进行核酸扩增反应而容易产生引物二聚体、非特异扩增。如后述的试验例的结果所示，本发明即使在利用一步式rt-pcr进行这样的扩增2个以上的靶区域的多重pcr的情况下，也能够抑制非特异反应并特异性地扩增靶核酸，能够实现高灵敏度的检测。本说明书中“靶区域”是指：通过引物对而扩增的目标核酸序列区域，例如可以是试样中包含的病毒rna的基因组rna中的试图扩增的区域。作为一个优选的例子，可以将试样中包含的病毒rna的基因组rna中的2个位置以上的区域作为2个以上的靶区域来进行多重pcr。本发明的方法中，成为对象的靶标的数量没有特
别限制，可以为2个位置以上，例如也可以是3个位置、4个位置。目标数量的上限没有特别限制，例如可以为10个位置以下。优选利用1个一步式rt-pcr反应液特异性扩增2个靶区域的多重pcr。
[0117]
进而，在靶核酸包含亚型的情况下，还可以包含简并引物。在通过本发明检测作为包膜rna病毒之一的冠状病毒(sars-ncov-2)时，作为引物对的例子，可列举出国立感染研究所发表的“病原体检测手册2019-ncov”中记载的序列(序列号1、2、4、5)、美国疾病预防管理中心发表的“2019-novel coronavirus(2019-ncov)real-time rt-pcr panelprimers and probes”(序列号7、8、10、11、13、14)，也可以适宜地用于本发明中，但不限定于此。前述所述的引物序列中，由序列号1和2、序列号4和5、序列号7和8、序列号10和11、序列号13和14检测sars-ncov-2的核衣壳蛋白(n)区域。以sars-ncov-2为主的冠状病毒的检测中，可以将核衣壳蛋白(n)区域、包膜蛋白(e)区域、突刺蛋白(s)区域、依赖rna的rna聚合酶(rdrp)区域、开放阅读框(orf)区域等的基因作为检测的对象，但没有特别限定。作为使用的引物的浓度，相对于rt-pcr反应液整体，优选正向引物的浓度为0.1μm以上且3μm以下，且上述反向引物的浓度为0.1μm以上且3μm以下。更优选正向引物的浓度为0.1μm以上且2μm以下，且上述反向引物的浓度为0.5μm以上且2μm以下。
[0118]
本发明中，作为另一方式，进而是包含至少1种经标记的杂交探针或双链dna结合荧光化合物的检测方法。由此，可以通过荧光信号的监测来监视扩增产物的分析而并非通过通常的电泳，可减少解析劳力。进而，无需打开反应容器，能够减少污染的风险。也可以通过用不同的荧光色素标记对应于病毒的亚型的各杂交探针，来识别病毒的亚型。
[0119]
作为双链dna结合荧光化合物，例如可列举出sybr(注册商标)green i，sybr(注册商标)gold、syto-9、sytp-13、syto-82(life technologies)，evagreen(注册商标；biotium)、lcgreen(idaho)、lightcycler(注册商标)480resolight(roche applied science)等。
[0120]
作为本发明中使用的杂交探针，例如可列举出taqman水解探针(美国专利第5,210,015号公报、美国专利第5,538,848号公报、美国专利第5,487,972号公报、美国专利第5,804,375号公报)、分子信标(美国专利第5,118,801号公报)、fret杂交探针(国际公开第97/46707号小册子，国际公开第97/46712号小册子，国际公开第97/46714号小册子)等。对于作为包膜rna病毒之一的冠状病毒(sars-ncov-2)检测用的探针的碱基序列而言，可列举出美国疾病预防管理中心发表的“2019-novel coronavirus(2019-ncov)real-time rt-pcr panelprimers and probes”(序列号9、12、15)和国立感染研究所发表的“病原体检测手册2019-ncov”中记载的序列(序列号3、6)，可以适宜地用于本发明中，但不限定于此。前述所述的探针序列检测sars-ncov-2的n区域。进而，在靶核酸包含亚型的情况下，也可以包含简并序列。在以sars-ncov-2为主的冠状病毒的检测中，可以将n区域、e区域、s区域、rdrp区域、orf区域等的基因作为检测的对象，不特别限定于此。作为荧光标记探针的浓度，优选0.01μm以上且1.0μm以下。更优选为0.013μm以上且0.75μm以下，进一步优选为0.02μm以上且0.5μm以下。
[0121]
本发明中，作为判断是否抑制了非特异性核酸的扩增的方法，没有限定，可以通过如下方式确认：将rt-pcr后的扩增产物供于电泳，与由模板rna的碱基数推测出的条带进行比较，从而确认。电泳中根据电泳条带的强弱能够定性地判断非特异性核酸扩增量的多少。
作为其它方式，为包含双链dna结合荧光化合物的检测方法。通过进行本方法中的熔解曲线解析，从而能够基于扩增产物的tm值的不同区分靶核酸扩增和非特异性核酸扩增。通过对熔解曲线中的峰高度进行比较，从而可以进行非特异性核酸扩增量多少的判断。另外，作为进一步其它方式，也可以通过利用杂交探针(例如，taqman水解探针)的检测方法来确认。taqman水解探针检测系统中，荧光强度根据核酸扩增量而增加，将达到阈值的荧光强度的pcr的反应循环数称为ct值。非特异性核酸扩增的增加导致到达荧光强度的降低。因此，通过对到达荧光强度进行比较而能够判断非特异性核酸扩增量的多少。
[0122]
本发明的另一方式是一种组合物，其用于通过一步式rt-pcr由试样中的模板rna扩增核酸并抑制非特异性核酸扩增。在特定的优选的特定方式中，为一种用于一步式rt-pcr中的组合物，其特征在于，含有前述的阴离子性聚合物和逆转录酶和dna聚合酶(或者具有逆转录活性的dna聚合酶)。本发明也可以以试剂盒的方式提供，所述试剂盒包含这些组合物，且用于抑制了非特异性核酸扩增的一步式rt-pcr中。
[0123]
一个实施方式中，本发明可以是含有阴离子性聚合物的试剂，其用于在由未经纯化工序的试样通过一步式rt-pcr进行的核酸扩增中抑制非特异扩增。又一实施方式中，本发明可以是含有阴离子性聚合物的试剂，其用于在由试样利用1个反应液特异性扩增2个以上的靶区域的一步式rt-pcr的核酸扩增中抑制非特异扩增。这些试剂中使用的阴离子性聚合物的种类、用量等使用方法、可以一起使用的其它添加剂等可以与上述核酸扩增方法中详述者同样。
[0124]
进而本发明涉及一种试剂盒，其含有前述那样的试剂，且用于通过一步式rt-pcr反应进行的核酸扩增方法中。例如，本发明的试剂盒可以以如下方式提供：将阴离子性聚合物、(i)逆转录酶和dna聚合酶或(ii)具有逆转录活性的dna聚合酶、与可以根据需要使用的其它成分封入同一容器中或封入不同的容器中并例如梱包成一个包装体，并包含关于该试剂盒的使用方法的信息。通过使用本发明的试剂盒，从而能够进行抑制了非特异反应的核酸扩增反应，能够实现高灵敏度的靶核酸的检测。
[0125]
实施例
[0126]
以下通过实施例对本发明进行具体地说明。当然，本发明不受下述实施例限定。
[0127]
试验例1.阴离子性聚合物对唾液待检体的rt-pcr抑制的效果(多重pcr中的效果)：
[0128]
(1)反应液的制备
[0129]
将以下所示的组成的反应液作为基本组成，通过一步式rt-pcr，检测在唾液待检体存在下(未经纯化，生物体来源夹杂物质存在下)的反应液中的灭活sars-ncov-2冠状病毒rna。作为检测试剂，除预处理液以外，使用sars-cov-2detection kit-n1 set-和-n2 set-(东洋纺)。需要说明的是，作为本试剂的随附品的检测用的引物
·
探针为美国疾病预防管理中心(cdc)发布“2019-novel coronavirus(2019-ncov)real-time rt-pcr panel primers and probes”(effective：24jan 2020)中记载的n1套装和n2套装的序列，使用记载的浓度。n1的探针使用将cy5作为荧光标记、将bhq3(black hole quencher，黑洞猝灭剂)作为猝灭基团进行了修饰的探针，n2的探针使用将rox作为荧光标记、将bhq2作为猝灭基团进行了修饰的探针。
[0130]
rt-pcr反应液(40μl)
[0131]
反应液：30μl
[0132]
酶液：5μl
[0133]
引物
·
探针液：5μl
[0134]
(2)灭活病毒和唾液的添加和预处理
[0135]
预处理液(10μl)
[0136]
10拷贝/μl灭活sars-ncov-2(zeptometrix)：1μl
[0137]
唾液：0μl、3μl或8μl
[0138]
聚乙烯基磺酸钠(pvsa)：1μl(以添加一步式rt-pcr反应液后的反应液中的最终浓度成为0％～0.04％的浓度的方式添加)
[0139]
无rnase水：调整为10μl
[0140]
在热循环仪中对混合液10μl进行95℃5分钟的热处理。
[0141]
(3)反应液的添加
[0142]
在通过前工序进行热处理后的混合液10μl中添加(1)中制备的rt-pcr反应液40μl，在50μl反应体系中实施rt-pcr。
[0143]
(4)rt-pcr反应条件
[0144]
使用biorad制cfx96well deep，按照以下的温度循环实施了实时pcr反应。
[0145]
42℃5分钟(逆转录条件)
[0146]
95℃10秒(热变性)
[0147]
95℃1秒-50℃3秒-55℃10秒50次循环(pcr-荧光读取)
[0148]
(5)结果
[0149]
对于测定结果，利用biorad制cfx manager或cfx maestro软件，计算出到达荧光强度。将该结果示于图1(添加了3μl唾液)和图2(添加了8μl唾液)。其结果，在添加了唾液且在不存在pvsa的条件下，n1和n2的到达荧光强度均降低，但随着pvsa添加浓度的增加，确认到到达荧光强度的上升，启示出非特异扩增降低。
[0150]
试验例2.对于唾液待检体的rt-pcr抑制而言，阴离子性聚合物对灵敏度所产生的影响
[0151]
(1)反应液的制备
[0152]
将以下所示的组成的反应液作为基本组成，通过一步式rt-pcr，检测在唾液待检体存在下(未经纯化，生物体来源夹杂物质存在下)的反应液中的灭活sars-ncov-2病毒rna。作为检测试剂，除预处理液以外，使用sars-cov-2detection kit-n2 set-(东洋纺)。需要说明的是，作为本试剂的随附品的检测用的引物
·
探针为美国疾病预防管理中心(cdc)发布“2019-novel coronavirus(2019-ncov)real-time rt-pcr panel primers and probes”(effective：24jan 2020)中记载的n2套装的序列，使用记载的浓度。n2的探针使用将rox作为荧光标记、将bhq1(black hole quencher)作为猝灭基团进行了修饰的探针。
[0153]
rt-pcr反应液(40μl)
[0154]
反应液：30μl
[0155]
酶液：5μl
[0156]
引物
·
探针液：5μl
[0157]
(2)灭活病毒和唾液的添加和预处理
[0158]
预处理液(10μl)
[0159]
10拷贝/μl或2.5拷贝/μl灭活sars-ncov-2(zeptometrix)：1μl
[0160]
唾液：0μl、3μl
[0161]
聚乙烯基磺酸钠(pvsa)：1μl(以添加一步式rt-pcr反应液后的反应液中的最终浓度成为0.008％的浓度的方式添加)
[0162]
无rnase水：调整为10μl
[0163]
在热循环仪中对混合液10μl进行95℃5分钟的热处理。
[0164]
(3)反应液的添加
[0165]
在通过前工序进行热处理后的混合液10μl中添加(1)中制备的rt-pcr反应液40μl，在50μl反应体系中实施rt-pcr。
[0166]
(4)rt-pcr反应条件
[0167]
使用biorad制cfx96well deep，按照以下的温度循环实施了实时pcr反应。
[0168]
42℃5分钟(逆转录条件)
[0169]
95℃10秒(热变性)
[0170]
95℃1秒-50℃3秒-55℃10秒50次循环(pcr-荧光读取)
[0171]
(5)结果
[0172]
对于测定结果，利用biorad制cfx manager或cfx maestro软件，计算出将阈值设为100时的ct值和到达荧光强度。将该结果示于以下的表1和图3。如该结果所示，在添加了唾液且不存在pvsa的条件下，到达荧光强度降低，结果未确认到2.5拷贝/μl的检出。另一方面，在pvsa的存在下，到达荧光强度上升，确认直至2.5拷贝/μl均实现检出，显示出灵敏度得到改善。
[0173]
[表1]
[0174][0175]
产业上的可利用性
[0176]
本发明可适宜用于分子生物学研究、进而以临床检测、食品卫生管理等为目的的检测中。

技术特征：
1.一种核酸扩增方法，其为由试样利用一步式rt-pcr法进行核酸扩增的方法，所述方法包括以下的工序：(1)制备一步式rt-pcr反应液的工序，所述一步式rt-pcr反应液包含试样、阴离子性聚合物、及(i)逆转录酶和dna聚合酶或(ii)具有逆转录活性的dna聚合酶；以及(2)将反应容器密闭后，实施一步式rt-pcr反应的工序；所述一步式rt-pcr反应液中的阴离子性聚合物的浓度为0.001％以上。2.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其中，所述工序(1)中使用的试样为未经纯化工序的生物体来源试样、环境试样或细胞来源试样。3.根据权利要求1或2所述的核酸扩增方法，其中，所述工序(1)中使用的试样为选自由唾液、痰液、咽拭液、鼻拭液、漱口液、粪便、肺吸出物、脑脊液、泪液、培养细胞、培养上清液、擦拭检查试样、土壌试样、和污水试样组成的组中的至少1种。4.根据权利要求1～3中任一项所述的核酸扩增方法，其中，所述工序(1)中使用的试样为悬浮于选自由水、生理盐水、缓冲液、和sputazyme酶液组成的组中的至少1种的悬浮液、或者它们的离心上清液或浓缩物。5.根据权利要求1～4中任一项所述的核酸扩增方法，其中，所述工序(1)中使用的试样为可能包含rna病毒的试样。6.根据权利要求1～5中任一项所述的核酸扩增方法，其中，利用1个一步式rt-pcr反应液特异性扩增2个以上的靶区域。7.根据权利要求6所述的核酸扩增方法，其中，2个以上的靶区域为试样中可能包含的rna病毒的基因组rna中的靶区域。8.根据权利要求5～7中任一项所述的核酸扩增方法，其中，rna病毒为具有包膜的rna病毒。9.根据权利要求8所述的核酸扩增方法，其中，具有包膜的rna病毒为选自由冠状病毒科病毒、黄病毒科病毒、披膜病毒科病毒、正粘病毒科病毒、弹状病毒科病毒、本雅病毒科病毒、副粘病毒科病毒、和丝状病毒科病毒组成的组中的至少1种。10.根据权利要求8或9所述的核酸扩增方法，其中，具有包膜的rna病毒为选自由sars(严重急性呼吸综合征)冠状病毒、mers(中东呼吸综合征)冠状病毒、和sars-ncov-2冠状病毒组成的组中的至少1种。11.根据权利要求5～7中任一项所述的核酸扩增方法，其中，rna病毒为不具有包膜的rna病毒。12.根据权利要求11所述的核酸扩增方法，其中，不具有包膜的rna病毒为选自由杯状病毒科病毒、星状病毒科病毒、小核糖核酸病毒科病毒、戊肝病毒科病毒、和呼肠孤病毒科病毒组成的组中的至少1种。13.根据权利要求1～12中任一项所述的核酸扩增方法，其中，阴离子性聚合物是使具有选自由磺酸基、羧基、磷酸基、硫酸基、和膦酸基组成的组中的至少1种阴离子性官能团的单体聚合而得到的聚合物。14.根据权利要求1～13中任一项所述的核酸扩增方法，其中，阴离子性聚合物为选自由聚肌苷酸、聚胞苷酸、聚鸟苷酸、聚腺苷酸、聚脱氧肌苷酸、聚脱氧胞苷酸、聚脱氧鸟苷酸、聚脱氧腺苷酸、卡拉胶、肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素、透明质酸、硫酸乙酰肝素、软骨素、
硫酸皮肤素、聚乙烯基磺酸、聚乙烯基膦酸、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚丙烯酸/磺酸共聚物、和聚丙烯酸/马来酸共聚物组成的组中的至少1种。15.根据权利要求1～14中任一项所述的核酸扩增方法，其中，阴离子性聚合物的平均分子量为1000～5000000。16.根据权利要求1～15中任一项所述的核酸扩增方法，其中，dna聚合酶为选自由taq、tth和它们的突变体组成的组中的至少1种。17.根据权利要求1～16中任一项所述的核酸扩增方法，其特征在于，逆转录酶的来源为选自由莫洛尼氏鼠白血病病毒(mmrv)、禽成髓细胞瘤病毒(amv)和它们的突变体组成的组中的至少1种。18.根据权利要求1～17中任一项所述的核酸扩增方法，其中，所述工序(1)中的一步式rt-pcr反应液还包含对应于靶区域的1个以上的引物对。19.根据权利要求1～18中任一项所述的核酸扩增方法，其中，所述工序(1)中的一步式rt-pcr反应液还包含对应于靶区域的杂交探针。20.根据权利要求1～19中任一项所述的核酸扩增方法，其中，所述工序(1)中的一步式rt-pcr反应液还包含选自由具有在氨基酸中的氨基上连接有3个甲基的结构的季铵盐、牛血清白蛋白、甘油、二醇、明胶、和极性有机溶剂组成的组中的至少1种，所述季铵盐以下称为“甜菜碱样季铵盐”。21.根据权利要求20所述的核酸扩增方法，其中，甜菜碱样季铵盐为甜菜碱或l-肉碱。22.根据权利要求1～21中任一项所述的核酸扩增方法，其中，所述工序(1)中的一步式rt-pcr反应液中的阴离子性聚合物的浓度为0.0025～0.05％。23.一种抑制非特异扩增的方法，其特征在于，由未经纯化工序的试样通过一步式rt-pcr进行核酸扩增时，使一步式rt-pcr反应液中共存阴离子性聚合物。24.根据权利要求23所述的抑制非特异扩增的方法，其中，一步式rt-pcr反应液中以0.001％以上的量共存阴离子性聚合物。25.一种核酸扩增方法，为通过利用1个反应液由试样特异性扩增2个以上的靶区域的一步式rt-pcr进行核酸扩增的方法，其特征在于，使该反应液中共存阴离子性聚合物。26.一种含有阴离子性聚合物的试剂，其用于在由未经纯化工序的试样通过一步式rt-pcr进行的核酸扩增中抑制非特异扩增。27.根据权利要求26所述的试剂，其中，将一步式rt-pcr反应液中的阴离子性聚合物的浓度调整为0.001％以上的量而使用。28.一种试剂，其含有阴离子性聚合物，所述试剂用于权利要求1～25中任一项中记载的基于一步式rt-pcr反应的核酸扩增方法。29.一种试剂盒，其含有权利要求26～28中任一项所述的试剂，所述试剂盒用于基于一步式rt-pcr反应的核酸扩增方法。

技术总结
本发明提供：利用一步式RT-PCR法抑制非特异性核酸扩增并由模板RNA特异性进行DNA扩增的手段。一实施方式中，本发明提供核酸扩增方法，其为由试样利用一步式RT-PCR进行核酸扩增的方法，所述方法包括以下的工序：(1)制备一步式RT-PCR反应液的工序，所述一步式RT-PCR反应液包含试样、阴离子性聚合物、及(i)逆转录酶和DNA聚合酶或(ii)具有逆转录活性的DNA聚合酶；以及(2)将反应容器密闭后，实施一步式RT-PCR反应的工序，前述一步式RT-PCR反应液中的阴离子性聚合物的浓度为0.001％以上。子性聚合物的浓度为0.001％以上。


技术研发人员：山越奈奈 寺内谦太
受保护的技术使用者：东洋纺株式会社
技术研发日：2021.07.21
技术公布日：2023/8/4