一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法与流程

1.本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法。


背景技术：

2.吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，pqq)，是生物体内参与脱氢酶氧化还原反应的辅酶，参与呼吸链电子传递，具有促进机体生长、防护肝损伤、促进神经生长因子合成、调节机体自由基水平、提高细胞对毒性和辐射等极端条件耐受性的功能，是一种独特的生理活性物质，在食品和医药保健领域具有重要的开发前景。
3.pqq虽然广泛存在于自然界中，但哺乳动物自身却不合成。其中植物含量低、提取成本太高，不适合工业化生产；化学合成法反应复杂，副产物多，成本较高，目前国内外pqq的生产大多采用微生物发酵法。微生物发酵法有如下优点：(1)产品为天然产物，生物活性好，易于人体吸收；(2)原料来源广泛，利于工业化生产。
4.提高pqq的发酵产量主要从两个方面进行优化：一是通过自然筛选、诱变育种或基因工程等手段选育出pqq高产菌株，二是优化发酵培养基和发酵工艺，提高菌株的生长和产物合成水平。确定生产菌株及发酵培养基后，在摇瓶及发酵罐实验阶段可通过单因素等统计学的方法来进行优化，然而在生产上利用这一手段去优化时情况较复杂且工作量大，微生物发酵周期长，发酵结果不稳定，重复性低，效率较低。
5.cn106282044b公开了一种生丝微菌和吡咯喹啉醌的制备方法，该发明公开的培养基以甲醇为单一碳源，发酵过程补料工艺粗放简陋，不易于控制，最终pqq发酵浓度虽然达到了1783mg/l，但是甲醇消耗较多，转化率较低。
6.cn112375792a公开了一种生物法制造pqq的方法，该发明公开了一种利用生丝微菌发酵生产pqq的工艺，通过在培养过程中补加香菇多糖、枸杞多糖、大豆异黄酮等额外组分，促进菌体的生长和pqq产量的提高，最终pqq发酵浓度达到340.5mg/l，od650达到25，该发明通过补料提高了pqq的发酵水平，但整体产量较低，发酵成本较高，不利于工业化推广。
7.因此，在本领域中，期望开发一种既能够提高产量，又能够降低发酵成本的pqq生产方法。


技术实现要素：

8.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法。本发明的制备方法能够有效延长极生菌丝长度约为2～5倍菌体长度的时间，从而提高了生丝微菌积累pqq产物的速率，提高了pqq发酵水平，降低了其生产成本。
9.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
10.本发明提供一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将生丝微菌经菌种活化、摇瓶培养、种子培养后接种到发酵培养基进行发酵培养，在发酵培养阶段进行如下控制：
11.(1)发酵初期菌型为梭形，控制甲醇浓度为5～10g/l；
12.(2)当菌体出现二分裂时，控制甲醇浓度为5～10g/l；
13.(3)当菌体的极生菌丝长度为2～5倍菌体长度时，控制甲醇浓度3～6g/l；当菌体的极生菌丝长度为大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度时，控制甲醇浓度0.5～1g/l；当菌体的极生菌丝长度超过7倍菌体长度时，控制甲醇浓度≤0.5g/l，之后停止发酵。
14.本发明中，发明人在研究过程中发现，当生丝微菌的极生菌丝的长度维持约为2～5倍菌体长度的阶段越长，产物pqq的比产率越高，并据此发明了本发明的发酵方法，能够有效延长极生菌丝长度约为2～5倍菌体长度的时间，从而提高了生丝微菌积累pqq产物的速率，提高了pqq发酵水平，降低了其生产成本。
15.在本发明中，通过根据菌体菌型调整甲醇浓度，使得延长极生菌丝长度约为2～5倍菌体长度的时间，从而提高生物量和产物产量。本发明的特征在于，在发酵培养基进行发酵培养阶段。
16.在本发明中，所述菌体的菌型是通过olympus cx23显微镜观察获知。
17.在本发明中，发酵初期菌型为梭形，此时极生菌丝长度为约1倍菌体长度，此时控制甲醇浓度为5～10g/l，例如5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l或10g/l。如果在该时期甲醇浓度低于5g/l，则菌体生长速度缓慢，菌浓od
650
较低，造成pqq产量偏低，如果甲醇浓度高于10g/l，则对菌体产生毒害作用，抑制菌体生长，造成pqq产量偏低。
18.经过发酵初期后，菌体会大量出现二分裂，在菌体出现二分裂阶段也是控制甲醇浓度为5～10g/l，例如5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l或10g/l。如果在该时期甲醇浓度低于5g/l，则菌体生长速度缓慢，菌浓od
650
较低，造成pqq产量偏低，如果甲醇浓度高于10g/l，则对菌体产生毒害作用，抑制菌体生长，造成pqq产量偏低。
19.而后菌体的极生菌丝长度达到2～5倍菌体长度时，控制甲醇浓度3～6g/l，例如3g/l、3.5g/l、4g/l、4.5g/l、5g/l、5.5g/l或6g/l。如果在该时期甲醇浓度低于3g/l，则会碳源不足，从而影响菌体生长和产物合成，造成pqq产量偏低，如果甲醇浓度高于6g/l，则会抑制pqq分泌至培养基，造成pqq产量偏低。
20.当菌体的极生菌丝长度为大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度时，控制甲醇浓度0.5～1g/l，例如0.5g/l、0.6g/l、0.7g/l、0.8g/l、0.9g/l或1g/l，如果在该时期甲醇浓度低于0.5g/l，则会碳源不足，从而影响菌体生长和产物合成，造成pqq产量偏低，如果甲醇浓度高于1g/l，则会抑制pqq分泌至培养基，造成pqq产量偏低。
21.当菌体的极生菌丝长度超过7倍菌体长度时，控制甲醇浓度≤0.5g/l，例如0.5g/l、0.4g/l、0.3g/l、0.2g/l或0.1g/l等，之后停止发酵。如果在该时期甲醇浓度高于0.5g/l，则会造成pqq被消耗，产量偏低，并且造成发酵液中甲醇残留，可能影响后期发酵液提炼。
22.优选地，步骤(1)中通气量为0.6～0.8vvm(例如0.65vvm、0.7vvm或0.75vvm)，压力控制在0.05～0.06mpa(例如0.055mpa、0.058mpa或0.06mpa)，转速为120～140rpm(例如120rpm、125rpm、130rpm或135rpm)，ph 6.5～7.0(例如6.5、6.7、6.9或7.0)，温度为25～35℃(例如25℃、28℃、30℃、33℃或35℃)。
23.优选地，步骤(2)中通气量为0.8～1.4vvm(例如0.85vvm、0.9vvm、1.0vvm、1.2vvm或1.3vvm)，压力控制在0.06～0.08mpa(例如0.065mpa、0.07mpa或0.075mpa)，转速为200～250rpm(例如220rpm、230rpm或240rpm)，ph 6.5～7.0(例如6.5、6.7、6.9或7.0)。
24.优选地，步骤(3)中通气量为1.4～2.0vvm(例如1.5vvm、1.6vvm、1.7vvm、1.8vvm或
1.9vvm)，压力控制在0.05～0.06mpa(例如0.055mpa、0.058mpa或0.06mpa)，转速180～200rpm(例如185rpm、190rpm或195pm)，ph 6.5～7.0(例如6.5、6.7、6.9或7.0)。
25.优选地，所述生丝微菌为甲醇利用型脱单生丝微菌。
26.在本发明中，所述甲醇利用型脱单生丝微菌为脱单生丝微菌hyphomicrobium denitrificans cgmcc1.15943。
27.优选地，所述发酵培养的培养基的组分为：硫酸铵1.5～5.5g/l(例如2.0g/l、3.5g/l、4.0g/l、4.5g/l或5g/l)，磷酸二氢钾1～4g/l(例如1.5g/l、2g/l、2.5g/l或3g/l)，磷酸氢二钠2.5～5.5g/l(例如3.5g/l、4.0g/l、4.5g/l或5g/l)，硫酸镁0.5～2g/l(例如0.8g/l、1.0g/l、1.5g/l或1.8g/l)，丝氨酸0.1～0.5g/l(例如0.2g/l、0.3g/l或0.4g/l)，含微量元素的复合成分1～5ml/l(例如2ml/l、3ml/l、3.5ml/l、4ml/l或4.5ml/l)，辅液1～5ml/l(例如2ml/l、3ml/l、3.5ml/l、4ml/l或4.5ml/l)，甲醇5～10g/l(例如6g/l、7g/l、8g/l或9g/l)。
28.优选地，所述含微量元素的复合成分包括如下组分：硫酸亚铁4～8g/l(例如5g/l、6g/l、7g/l或7.5g/l)，硫酸锌20～30g/l(例如23g/l、25g/l或28g/l)，硫酸锰4～8g/l(例如5g/l、6g/l、7g/l或7.5g/l)，硫酸铜0.5～2g/l(例如0.8g/l、1.0g/l、1.5g/l或1.8g/l)，氯化钠1～5g/l(例如2g/l、3g/l或4g/l)，钼酸钠25～40mg/l(例如28mg/l、30mg/l、35mg/l或38mg/l)，氯化钴25～40mg/l(例如28mg/l、30mg/l、35mg/l或38mg/l)，氯化钙25～40mg/l(例如28mg/l、30mg/l、35mg/l或38mg/l)，氯化镁0.1～1.2g/l(例如0.2g/l、0.5g/l、0.8g/l或1.0g/l)。
29.优选地，所述辅液包括如下组分：核黄素0.1～0.4g/l(例如0.2g/l、0.3g/l或0.35g/l)、盐酸硫胺0.3～0.6g/l(例如0.4g/l、0.5g/l或0.55g/l)、烟酸0.3～0.6g/l(例如0.4g/l、0.5g/l或0.55g/l)、生物素0.01～0.04g/l(例如0.02g/l、0.03g/l或0.04g/l)、肌醇1～4g/l(例如1.5g/l、2g/l、2.5g/l或3g/l)。
30.优选地，所述发酵培养的培养基中除辅液和甲醇之外，调节消前ph 6.5～7.0，于121℃灭菌25～30min，将辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。
31.优选地，所述种子培养至od
650
值为2～6时，接种到发酵培养基，接种量为5～10％，例如5％、6％、7％、8％、9％或10％。
32.在本发明中，所述菌种活化、摇瓶培养、种子培养均采用常规的方法进行。
33.优选地，所述菌种活化的平板培养基的组分为：硫酸铵2～6g/l，磷酸二氢钾1～4g/l，磷酸氢二钠2～6g/l，硫酸镁0.5～2g/l，微量元素0.5～2ml/l，辅液0.5～2ml/l，甲醇10～20g/l，琼脂粉20～30g/l。
34.优选地，所述平板培养基中除辅液和甲醇之外，调节消前ph 6.5～7.0，于121℃灭菌25～30min，将辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。
35.在本发明中，从平板上挑取菌落生长饱满有光泽，形状呈圆形且边缘光滑、颜色较深的成熟单菌落，加1ml无菌水打散混匀，稀释到一定梯度后吸取少量菌液于平板上进行涂布，于25～35℃培养5～9天。
36.优选地，所述摇瓶培养的培养基的组分为：硫酸铵2～6g/l，磷酸二氢钾1～4g/l，磷酸氢二钠2～6g/l，硫酸镁0.5～2g/l，微量元素0.5～2ml/l，辅液0.5～2ml/l，甲醇10～20g/l。
cgmcc1.15943。
56.实施例1：
57.将pqq保藏菌株进行活化三代后挑取平板上生长饱满有光泽，形状呈圆形且边缘光滑、颜色较深的成熟单菌落稀释涂布接于平板培养基。
58.平板培养基组分为：硫酸铵2g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，磷酸氢二钠2.5g/l，硫酸镁0.5g/l，微量元素0.5ml/l，辅液0.5ml/l，甲醇10g/l，琼脂粉20g/l；其中微量元素组分为：硫酸亚铁4g/l，硫酸锌22.5g/l，硫酸锰4.5g/l，硫酸铜0.5g/l，氯化钠1g/l，钼酸钠25mg/l，氯化钴25mg/l，氯化钙25mg/l，氯化镁0.5g/l；辅液组分为：核黄素0.15g/l、盐酸硫胺0.35g/l、烟酸0.35g/l、生物素0.015g/l、肌醇1.5g/l；除辅液、甲醇之外，调节消前ph6.5，于121℃灭菌25min，辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。
59.平板培养条件为28℃培养5天，待平板上外观圆润、边缘光滑、颜色较深时即可接入摇瓶中进行培养。
60.摇瓶培养基组分为：硫酸铵2g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，磷酸氢二钠2.5g/l，硫酸镁0.5g/l，微量元素0.5ml/l，辅液0.5ml/l，甲醇10g/l，琼脂粉20g/l；其中微量元素组分为：硫酸亚铁4g/l，硫酸锌22.5g/l，硫酸锰4.5g/l，硫酸铜0.5g/l，氯化钠1g/l，钼酸钠25mg/l，氯化钴25mg/l，氯化钙25mg/l，氯化镁0.5g/l；辅液组分为：核黄素0.15g/l、盐酸硫胺0.35g/l、烟酸0.35g/l、生物素0.015g/l、肌醇1.5g/l；除辅液、甲醇之外，调节消前ph6.5，于121℃灭菌25min，辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。
61.从平板上挑取10个外观圆润、边缘光滑、颜色较深的成熟单菌落装于10ml无菌水试管充分打散，每个摇瓶接2ml菌悬液，摇瓶培养条件：转速220rpm，温度28℃，培养32h，od
650
值为1.1。
62.种子罐培养组分为：硫酸铵1.5g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，磷酸氢二钠2.5g/l，硫酸镁0.5g/l，微量元素1ml/l，辅液1ml/l，甲醇10g/l；其中微量元素组分为：硫酸亚铁4g/l，硫酸锌22.5g/l，硫酸锰4.5g/l，硫酸铜0.5g/l，氯化钠1g/l，钼酸钠25mg/l，氯化钴25mg/l，氯化钙25mg/l，氯化镁0.5g/l；辅液组分为：核黄素0.15g/l、盐酸硫胺0.35g/l、烟酸0.35g/l、生物素0.015g/l、肌醇1.5g/l。除辅液、甲醇之外，调节消前ph6.5，于121℃灭菌25min，辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。
63.待摇瓶长至od
650
值为1.1，按5％的接种量接入种子罐，甲醇初始为10g/l，种子罐培养条件为罐压0.05mpa，罐温28℃，通气量0.6vvm，ph6.5，转速120rpm，培养周期为40h，种子液od
650
值为4.1，菌型均匀且无菌度合格。
64.发酵罐培养基组分为：硫酸铵1.5g/l，磷酸二氢钾1g/l，磷酸氢二钠2.5g/l，硫酸镁0.5g/l，丝氨酸0.1g/l，微量元素1ml/l，辅液1ml/l，甲醇5g/l；硫酸亚铁4g/l，硫酸锌22.5g/l，硫酸锰4.5g/l，硫酸铜0.5g/l，氯化钠1g/l，钼酸钠25mg/l，氯化钴25mg/l，氯化钙25mg/l，氯化镁0.5g/l；辅液组分为：核黄素0.15g/l、盐酸硫胺0.35g/l、烟酸0.35g/l、生物素0.015g/l、肌醇1.5g/l。除辅液、甲醇之外，消前ph6.5，于121℃灭菌25min，辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。待种子液长至od
650
值为4.1，按5％的接种量进行接种，发酵罐初始培养条件为罐压0.05mpa，转速120rpm，通气量0.6vvm，ph6.5，罐温28℃，甲醇初始为10g/l，接种后每隔6h取样检测甲醇浓度并镜检观察菌型，在菌型为梭形(如图1a所示)和二分裂时，甲醇浓度于发酵的0～26h控制为10g/l；在极生菌丝开始延长，长度相当于菌体2～5倍
时(如图1b所示)，于26～96h控制甲醇浓度3g/l；极生菌丝进一步延长至大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度(如图1c所示)，于96～198h控制甲醇浓度1g/l；极生菌丝长度超过菌体7倍时，于198～240h控制甲醇浓度0.5g/l，通过流加无菌过滤后的氨水控制ph；
65.同时发酵至菌体发生二分裂时，逐步将通气量提高至1.0vvm，罐压提高至0.065mpa，转速提高至220rpm，控制ph6.5，待菌体极生菌丝长度为2～5倍菌体长度时，通气量提高至1.5vvm，罐压降至0.05mpa，转速降至180rpm，控制ph7.0，待pqq产量增长减缓，甲醇消耗速度明显降低，菌体极生菌丝延长超过菌体7倍时，菌体染色浅，残余甲醇《0.5g/l，停止发酵。
66.发酵周期240h，pqq产量达2.10g/l，od
650
值达到73，其菌体生长曲线及pqq产物积累曲线如图2所示。
67.实施例2：
68.将pqq保藏菌株进行活化三代后挑取平板上生长饱满有光泽，形状呈圆形且边缘光滑、颜色较深的成熟单菌落稀释涂布接于平板培养基。
69.平板培养基组成同实施例1，除辅液、甲醇之外，消前ph6.5，于121℃灭菌25min，辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。
70.平板培养条件为30℃培养8天，待平板上外观圆润、边缘光滑、颜色较深时即可接入摇瓶中进行培养。
71.摇瓶培养基组成同实施例1，除辅液、甲醇之外，消前ph6.5，于121℃灭菌25min，辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。
72.从平板上挑取20个外观圆润、边缘光滑、颜色较深的成熟单菌落装于10ml无菌水试管充分打散，每个摇瓶接2ml菌悬液，摇瓶培养条件：转速240rpm，温度32℃，培养40h，od
650
值为3.9。
73.种子罐培养基组成同实施例1，除辅液、甲醇之外，调节消前ph7.0，于121℃灭菌25min，辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。待摇瓶长至od
650
值为3.9，按8％的接种量接入种子罐，甲醇初始为8g/l，种子罐培养条件为罐压0.05mpa，罐温28℃，通气量0.8vvm，ph7.0，转速140rpm，培养周期为32h，种子液od
650
值为4.0，菌型均匀且无菌度合格。
74.发酵罐培养基组成同实施例1，除辅液、甲醇之外，调节消前ph7.0，于121℃灭菌25min，辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。待种子液长至od
650
值为4.0，按10％的接种量进行接种。发酵罐初始培养条件为罐压0.06mpa，转速140rpm，通气量0.8vvm，ph7.0，罐温28℃，初始甲醇浓度8g/l，接种后每隔6h取样检测甲醇浓度并镜检观察菌型，在菌型为梭形和二分裂时，于0～45h控制甲醇浓度8g/l；在极生菌丝开始延长，长度相当于菌体2～5倍时，于45～120h控制甲醇浓度5g/l；极生菌丝进一步延长至大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度，于120～208h控制甲醇浓度1g/l；极生菌丝长度超过菌体7倍时，于208～240h控制甲醇浓度0.5g/l，通过流加无菌过滤后的氨水控制ph；
75.同时发酵至菌体发生二分裂时，逐步将通气量提高至1.5vvm，罐压提高至0.08mpa，转速提高至250rpm，控制ph7.0，待菌体极生菌丝长度为2～5倍菌体长度时，通气量下调至1.2vvm，罐压降至0.05mpa，转速降至200rpm，控制ph6.8，待pqq产量增长减缓，甲醇消耗速度明显降低，菌体极生菌丝延长超过菌体7倍时，菌体染色浅，残余甲醇《0.5g/l，停止发酵。
76.发酵周期240h，pqq产量达2.25g/l，od
650
值达到75。其菌体生长曲线及pqq产物积累曲线如图3所示。
77.实施例3
78.将pqq保藏菌株进行活化三代后挑取平板上生长饱满有光泽，形状呈圆形且边缘光滑、颜色较深的成熟单菌落稀释涂布接于平板培养基。
79.平板培养基组成同实施例1，除辅液、甲醇之外，消前ph6.8，于121℃灭菌25min，辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。
80.平板培养条件为30℃培养8天，待平板上外观圆润、边缘光滑、颜色较深时即可接入摇瓶中进行培养。
81.摇瓶培养基组成同实施例1，除辅液、甲醇之外，消前ph6.8，于121℃灭菌25min，辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。
82.从平板上挑取20个外观圆润、边缘光滑、颜色较深的成熟单菌落装于10ml无菌水试管充分打散，每个摇瓶接2ml菌悬液，摇瓶培养条件：转速220rpm，温度30℃，培养38h，od
650
值为2.0。
83.种子罐培养基组成同实施例1，除辅液、甲醇之外，调节消前ph6.8，于121℃灭菌25min，辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。待摇瓶长至od
650
值为2.0，按5％的接种量接入种子罐，甲醇初始为5g/l，种子罐培养条件为罐压0.05mpa，罐温30℃，通气量0.6vvm，ph6.8，转速140rpm，培养周期为48h，种子液od
650
值为5.6，菌型均匀且无菌度合格。
84.发酵罐培养基组成同实施例1，除辅液、甲醇之外，调节消前ph6.8，于121℃灭菌25min，辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。待种子液长至od
650
值为5.6，按8％的接种量进行接种。发酵罐初始培养条件为罐压0.05mpa，转速140rpm，通气量0.6vvm，ph6.8，罐温30℃，初始甲醇浓度5g/l，接种后每隔6h取样检测甲醇浓度并镜检观察菌型，在菌型为梭形和二分裂时，于0～50h控制甲醇浓度5g/l；在极生菌丝开始延长，长度相当于菌体2～5倍时，于50～132h控制甲醇浓度6g/l；极生菌丝进一步延长至大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度，于132～210h控制甲醇浓度1g/l；极生菌丝长度超过菌体7倍时，于210～240h控制甲醇浓度0.5g/l，通过流加无菌过滤后的氨水控制ph；
85.同时发酵至菌体发生二分裂时，逐步将通气量提高至1.8vvm，罐压提高至0.08mpa，转速提高至250rpm，控制ph6.8，待菌体极生菌丝长度为2～5倍菌体长度时，通气量下调至1.5vvm，罐压降至0.05mpa，转速降至180rpm，控制ph7.0，待pqq产量增长减缓，甲醇消耗速度明显降低，菌体极生菌丝延长超过菌体7倍时，菌体染色浅，残余甲醇《0.5g/l，停止发酵。
86.发酵周期240h，pqq产量达2.50g/l，od
650
值达到81。其菌体生长曲线及pqq产物积累曲线如图4所示。
87.对比例1
88.将pqq保藏菌株进行活化三代后挑取平板上生长饱满有光泽，形状呈圆形且边缘光滑、颜色较深的成熟单菌落稀释涂布接于平板培养基。
89.平板培养基组成同实施例1；除辅液、甲醇之外，调节消前ph6.5，于121℃灭菌25min，辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。
90.平板培养条件为28℃培养5天，待平板上外观圆润、边缘光滑、颜色较深时即可接
入摇瓶中进行培养。
91.摇瓶培养基组成同实施例1；除辅液、甲醇之外，调节消前ph6.5，于121℃灭菌25min，辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。
92.从平板上挑取10个外观圆润、边缘光滑、颜色较深的成熟单菌落装于10ml无菌水试管充分打散，每个摇瓶接2ml菌悬液，摇瓶培养条件：转速220rpm，温度28℃，培养32h，摇瓶od
650
值为1.0。
93.种子罐培养基组成同实施例1。
94.除辅液、甲醇之外，调节消前ph6.5，于121℃灭菌25min，辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。待摇瓶培养至od
650
值为1.0，按5％的接种量接入种子罐，甲醇初始为10g/l，种子罐培养条件为罐压0.05mpa，罐温28℃，通气量0.6vvm，ph6.5，转速120rpm，培养周期为40h，种子液od
650
值为4.0，菌型均匀且无菌度合格。
95.发酵罐培养基组成同实施例1。
96.消前调节培养基ph调到6.5，除辅液、甲醇之外，于121℃灭菌25min，辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。待种子液长至od
650
值为4，按接种量5％进行接种。发酵罐初始培养条件为罐压0.05mpa，转速120rpm，通气量0.6vvm，ph6.5，罐温28℃，甲醇初始为5g/l，接种后每隔6h取样检测甲醇浓度并镜检观察菌型，后续发酵过程甲醇控制1g/l，通过流加过滤除菌后的氨水控制ph；
97.发酵培养至48h时通气量提高至1.0vvm，罐压0.065mpa，转速提高至220rpm，控制ph6.5。78～108h，通气量提高至1.5vvm，罐压降至0.05mpa，转速降至180rpm，控制ph7.0。待pqq含量增长减缓，至240h，残余甲醇＜0.5g/l后停止发酵。
98.发酵周期240h，pqq产量达1.50g/l，od
650
值达到57。其菌体生长曲线及pqq产物积累曲线如图5所示。
99.对比例2
100.在菌型为梭形和二分裂时，甲醇浓度控制为15g/l，具体为：
101.在菌型为梭形和二分裂时，甲醇浓度于发酵的0～26h控制为15g/l；在极生菌丝开始延长，长度相当于菌体2～5倍时，于26～84h控制甲醇浓度3g/l；极生菌丝进一步延长至大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度，于84～186h控制甲醇浓度1g/l；极生菌丝长度超过菌体7倍时，于186～240h控制甲醇浓度0.5g/l，通过流加无菌过滤后的氨水控制ph。其余实验条件与实施例1相同。
102.发酵周期240h，pqq产量1.60g/l，od
650
值达到63。
103.对比例3
104.在初期菌型为梭形和二分裂时，甲醇浓度控制为2g/l，具体为：
105.在菌型为梭形和二分裂时，甲醇浓度于发酵的0～40h控制为2g/l；在极生菌丝开始延长，长度相当于菌体2～5倍时，于40～96h控制甲醇浓度3g/l；极生菌丝进一步延长至大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度，于96～198h控制甲醇浓度1g/l；极生菌丝长度超过菌体7倍时，于198～240h控制甲醇浓度0.5g/l，通过流加无菌过滤后的氨水控制ph。其余实验条件与实施例1相同。
106.发酵周期240h，pqq产量1.45g/l，od
650
值达到55。
107.对比例4
108.在极生菌丝开始延长，长度相当于菌体2～5倍时，甲醇浓度控制为1g/l，具体为：
109.在菌型为梭形和二分裂时，甲醇浓度于发酵的0～26h控制为10g/l；在极生菌丝开始延长，长度相当于菌体2～5倍时，于26～84h控制甲醇浓度1g/l；极生菌丝进一步延长至大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度，于84～186h控制甲醇浓度1g/l；极生菌丝长度超过菌体7倍时，于186～240h控制甲醇浓度0.5g/l，通过流加无菌过滤后的氨水控制ph。其余实验条件与实施例1相同。
110.发酵周期240h，pqq产量1.55g/l，od
650
值达到59。
111.对比例5
112.在极生菌丝开始延长，长度相当于菌体2～5倍时，甲醇浓度控制为8g/l。
113.具体为：
114.在菌型为梭形和二分裂时，甲醇浓度于发酵的0～26h控制为10g/l；在极生菌丝开始延长，长度相当于菌体2～5倍时，于26～78h控制甲醇浓度8g/l；极生菌丝进一步延长至大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度，于78～180h控制甲醇浓度1g/l；极生菌丝长度超过菌体7倍时，于180～240h控制甲醇浓度0.5g/l，通过流加无菌过滤后的氨水控制ph。其余实验条件与实施例1相同。
115.发酵周期240h，pqq产量1.3g/l，od
650
值达到53。
116.对比例6
117.在极生菌丝进一步延长至大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度，甲醇浓度控制为2g/l。具体为：
118.在菌型为梭形和二分裂时，甲醇浓度于发酵的0～26h控制为10g/l；在极生菌丝开始延长，长度相当于菌体2～5倍时，于26～96h控制甲醇浓度3g/l；极生菌丝进一步延长至大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度，于96～184h控制甲醇浓度2g/l；极生菌丝长度超过菌体7倍时，于184～240h控制甲醇浓度0.5g/l，通过流加无菌过滤后的氨水控制ph。其余实验条件与实施例1相同。
119.发酵周期240h，pqq产量1.65g/l，od
650
值达到65。
120.对比例7
121.在极生菌丝进一步延长至大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度，甲醇浓度控制为0.1g/l，具体为：
122.在菌型为梭形和二分裂时，甲醇浓度于发酵的0～26h控制为10g/l；在极生菌丝开始延长，长度相当于菌体2～5倍时，于26～96h控制甲醇浓度3g/l；极生菌丝进一步延长至大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度，于96～174h控制甲醇浓度0.1g/l；极生菌丝长度超过菌体7倍时，于174～240h控制甲醇浓度0.5g/l，通过流加无菌过滤后的氨水控制ph。其余实验条件与实施例1相同。
123.发酵周期240h，pqq产量1.35g/l，od
650
值达到51。
124.对比例8
125.在极生菌丝长度超过菌体7倍时，甲醇浓度控制为0.8g/l，具体为：
126.在菌型为梭形和二分裂时，甲醇浓度于发酵的0～26h控制为10g/l；在极生菌丝开始延长，长度相当于菌体2～5倍时，于26～96h控制甲醇浓度3g/l；极生菌丝进一步延长至大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度，于96～198h控制甲醇浓度1g/l；极生菌丝长度
超过菌体7倍时，于198～240h控制甲醇浓度0.8g/l，通过流加无菌过滤后的氨水控制ph。其余实验条件与实施例1相同。
127.发酵周期240h，pqq产量1.70g/l，od
650
值达到68。
128.对比例9
129.在极生菌丝开始延长，长度相当于菌体2～7倍时，甲醇浓度控制为3g/l，具体为：
130.在菌型为梭形和二分裂时，甲醇浓度于发酵的0～26h控制为10g/l；在极生菌丝开始延长，长度相当于菌体2～7倍时，于26～174h控制甲醇浓度3g/l；极生菌丝长度超过菌体7倍时，于174～240h控制甲醇浓度0.5g/l，通过流加无菌过滤后的氨水控制ph。
131.同时发酵至菌体发生二分裂时，逐步将通气量提高至1.0vvm，罐压提高至0.065mpa，转速提高至220rpm，控制ph6.5，待菌体极生菌丝长度2～7倍菌体长度时，通气量提高至1.5vvm，罐压降至0.05mpa，转速降至180rpm，控制ph7.0，待pqq产量增长减缓，甲醇消耗速度明显降低，菌体极生菌丝延长超过7倍时，菌体染色浅，残余甲醇《0.5g/l，停止发酵。其余实验条件与实施例1相同。
132.发酵周期240h，pqq产量1.50g/l，od
650
值达到66。
133.对比例1按照固定时间调整，实施例1-3均按照菌型调整相关工艺参数。从结果可以看出，对比例1的pqq产量较低，而实施例1-3根据菌型调整相关工艺参数，生丝微菌的极生菌丝长度保持约2～5倍菌体长度的周期延长，其pqq产量要高于前者，所带来的技术效果是显著的。根据菌型进行工艺判断相对于固定时间点更具有时效性和灵活性，能更好的规避因发酵过程的一些异常而影响而对工艺调整方向产生的误判。
134.对比例2-9的技术效果也远低于实施例的效果，这说明根据本发明所述控制方法对菌型进行工艺判断以及甲醇浓度控制，能显著提高生丝微菌积累pqq产物的速率，提高了pqq发酵水平。
135.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
136.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将生丝微菌经菌种活化、摇瓶培养、种子培养后接种到发酵培养基进行发酵培养，在发酵培养阶段进行如下控制：(1)发酵初期菌型为梭形，控制甲醇浓度为5～10g/l；(2)当菌体出现二分裂时，控制甲醇浓度为5～10g/l；(3)当菌体的极生菌丝长度为2～5倍菌体长度时，控制甲醇浓度3～6g/l；当菌体的极生菌丝长度为大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度时，控制甲醇浓度0.5～1g/l；当菌体的极生菌丝长度超过7倍菌体长度时，控制甲醇浓度≤0.5g/l，之后停止发酵。2.根据权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，步骤(1)中通气量为0.6～0.8vvm，压力控制在0.05～0.06mpa，转速为120～140rpm，ph 6.5～7.0，温度为25～35℃。3.根据权利要求1或2所述的发酵制备方法，其特征在于，步骤(2)中通气量为0.8～1.4vvm，压力控制在0.06～0.08mpa，转速为200～250rpm，ph6.5～7.0。4.根据权利要求1-3中任一项所述的发酵制备方法，其特征在于，步骤(3)中通气量为1.4～2.0vvm，压力控制在0.05～0.06mpa，转速180～200rpm，ph6.5～7.0。5.根据权利要求1-4中任一项所述的发酵制备方法，其特征在于，所述生丝微菌为甲醇利用型脱单生丝微菌；优选地，所述甲醇利用型脱单生丝微菌为脱单生丝微菌hyphomicrobium denitrificans cgmcc1.15943。6.根据权利要求1-5中任一项所述的发酵制备方法，其特征在于，所述发酵培养的培养基的组分为：硫酸铵1.5～5.5g/l，磷酸二氢钾1～4g/l，磷酸氢二钠2.5～5.5g/l，硫酸镁0.5～2g/l，丝氨酸0.1～0.5g/l，含微量元素的复合成分1～5ml/l，辅液1～5ml/l，甲醇5～10g/l。7.根据权利要求6所述的发酵制备方法，其特征在于，所述含微量元素的复合成分包括如下组分：硫酸亚铁4～8g/l，硫酸锌20～30g/l，硫酸锰4～8g/l，硫酸铜0.5～2g/l，氯化钠1～5g/l，钼酸钠25～40mg/l，氯化钴25～40mg/l，氯化钙25～40mg/l，氯化镁0.1～1.2g/l。8.根据权利要求6或7所述的发酵制备方法，其特征在于，所述辅液包括如下组分：核黄素0.1～0.4g/l、盐酸硫胺0.3～0.6g/l、烟酸0.3～0.6g/l、生物素0.01～0.04g/l、肌醇1～4g/l。9.根据权利要求6所述的发酵制备方法，其特征在于，所述发酵培养的培养基中除辅液和甲醇之外，调节消前ph 6.5～7.0，于121℃灭菌25～30min，将辅液、甲醇过滤除菌后加入培养基中。10.根据权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，所述种子培养至od650值为2～6时，接种到发酵培养基，接种量为5～10％。

技术总结
本发明提供一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法，所述制备方法在发酵培养阶段进行如下控制：(1)发酵初期菌型为梭形，控制甲醇浓度为5～10g/L；(2)当菌体出现二分裂时，控制甲醇浓度为5～10g/L；(3)当菌体的极生菌丝长度为2～5倍菌体长度时，控制甲醇浓度3～6g/L；当菌体的极生菌丝长度为大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度时，控制甲醇浓度0.5～1g/L；当菌体的极生菌丝长度超过7倍菌体长度时，控制甲醇浓度≤0.5g/L，之后停止发酵。本发明的制备方法能够有效延长极生菌丝长度约为2～5倍菌体长度的时间，从而提高了生丝微菌积累PQQ产物的速率，提高了PQQ发酵水平，降低了其生产成本。本。本。


技术研发人员：沈加彬 段然 郑文煌 王炳荣 陈必钦
受保护的技术使用者：内蒙古金达威药业有限公司 厦门金达威集团股份有限公司
技术研发日：2023.03.29
技术公布日：2023/8/5