脂溶性维生素固定化量测定方法与流程

1.本发明主要涉及测定被固定化于血液净化用组件中含有的中空纤维膜内表面的脂溶性维生素的含量的方法。


背景技术：

2.近年，净化血液、血浆等体液的血液净化疗法普及，被应用于患有各种疾病的患者的治疗。作为血液净化疗法中使用的利用了中空纤维的血液净化装置，可例示出例如血液透析器、血液过滤透析器、血液过滤器、持续式血液过滤(透析)器、血浆分离器、血浆成分分离器、腹水过滤器、腹水浓缩器、人工肺等。这些血液净化装置得到日益改良，特别是从血液相容性的观点考虑的改良进展。
3.若以血液透析作为例子进行说明，则对于长期透析患者而言，发现透析淀粉样变性、动脉硬化等各种并发症，作为其发病的原因之一，可列举出氧化应激的亢进。氧化应激指的是氧化能力超过抗氧化能力的状态，对于透析患者而言，由于因血液与透析膜接触而白血球活化、因被活化的白血球所导致的自由基的产生亢进，维生素c、维生素e等血中的抗氧化物质的减少，而形成氧化应激亢进的状态。在此，血液中存在超氧化物歧化酶、尿酸、维生素c、维生素e、类胡萝卜素等各种抗氧化物质，透析患者的情况报告了血液中、红血球膜的维生素e浓度降低。维生素e浓度降低引起脂质等的氧化亢进、红血球寿命降低，暗示成为作为透析患者的长期并发症的透析淀粉样变性、动脉硬化性疾病、恶性肿瘤增加、贫血的原因。因此，通过抑制透析患者受到的氧化应激，改善患者的生活质量(qol、quality of life)、预后的可能性高被指摘。
4.想出了几个减轻透析患者受到的氧化应激的方法，作为其中之一，提出了使用了具有抗氧化能力的血液透析膜(血液透析器)的血液透析方法，报告了很多临床例。作为血液透析膜的主要原材料，从作为树脂的通用性、耐热/耐辐射线特性、生物相容性等理由出发，近年聚砜系高分子等疏水性合成高分子成为主流。但是，若膜的血液接触面的疏水性过强则产生血液凝固，因此通常使用通过利用与亲水性高分子的聚合物混合物、亲水性高分子进行的表面改质而形成的膜(专利文献1及2)。并且已知，对于如此将内表面、膜整体亲水化了的疏水性高分子膜而言，固定有脂溶性维生素的中空纤维膜的血液相容性更进一步优异(专利文献3～5)。
5.已知对于固定有脂溶性维生素的中空纤维膜，随着脂溶性维生素的含量增多，而在进行高压釜(ac)灭菌时，在中空纤维膜容易产生裂纹、即不管大小都容易产生龟裂。通常脂溶性维生素的含量越多则抗氧化能力也越高，但是若为了能够表现出实用时具有充分效果的抗氧化能力而增加脂溶性维生素的含量，则中空纤维膜产生泄漏的可能性升高，因此示出存在实用上不优选的领域。
6.现有技术文献
7.专利文献
8.专利文献1：日本特开平6-238139号公报
9.专利文献2：国际公开第98/52683号小册子
10.专利文献3：日本特开平9-66225号公报
11.专利文献4：日本特开平10-244000号公报
12.专利文献5：日本特开平11-347117号公报


技术实现要素：

13.发明要解决的问题
14.如上所述，对于脂溶性维生素的含量，存在实用上合适的范围，因此要求正确且有效地测定其。迄今为止的方法，由于脂溶性维生素的含量为源自中空纤维膜整体的提取量，因此在掌握特别是不会产生中空纤维膜的泄漏的优选的脂溶性维生素量上是有用的。另一方面，关于对与血液接触的脂溶性维生素期待的抗氧化能力等效果，若与中空纤维膜整体的脂溶性维生素量相比，可以精度良好地测定存在于中空纤维膜内表面的量，则可以更准确地掌握。
15.鉴于上述事情，本发明的目的在于，提供正确且有效地测定在内部具有中空纤维膜的血液净化用组件的中空纤维膜内表面固定化的脂溶性维生素的量的方法。
16.用于解决问题的方案
17.本发明人等为了解决上述问题而深入研究，结果发现，在具备含有脂溶性维生素的中空纤维膜、以及具有血液入口(blood inlet port)和血液出口(blood outlet port)的容器的血液净化用组件中，通过具有从血液入口输送溶剂的工序、将从血液出口排出的溶剂回收的工序、和测定回收的溶剂中含有的脂溶性维生素含量的工序的方法，可以正确且有效地测定血液净化用组件内部的中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量，从而完成了本发明。
18.即、本发明如以下所述。
19.1.20.一种脂溶性维生素固定化量测定方法，其为对具备含有脂溶性维生素的中空纤维膜、以及具有与前述中空纤维膜内部连接的血液入口和血液出口的容器的血液净化用组件的前述中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量进行测定的方法，所述方法具有：
21.从前述血液入口输送溶剂的工序、
22.将从前述血液出口排出的溶剂回收的工序、和
23.对前述回收的溶剂中含有的脂溶性维生素含量进行测定的工序。
24.2.25.根据上述[1]所述的脂溶性维生素固定化量测定方法，其中，前述溶剂为醇类。
[0026]
[3]
[0027]
根据上述[2]所述的脂溶性维生素固定化量测定方法，其中，前述醇类为醇浓度75％(体积比)以上的醇水溶液。
[0028]
[4]
[0029]
根据上述[1]～[3]中任一项所述的脂溶性维生素固定化量测定方法，其中，前述溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(1)。
[0030]
0.1
×
溶剂流速(ml/分钟)+5.2≤提取液量y(ml) (1)
[0031]
[5]
[0032]
根据上述[1]～[4]中任一项所述的脂溶性维生素固定化量测定方法，其中，前述溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(2)。
[0033]
提取液量y(ml)≤{(k
×
膜面积2(m2)/溶剂流速(ml/分钟))+61}
×
7.5(2)
[0034]
(式(2)中，k＝800。)
[0035]
[6]
[0036]
根据上述[1]～[4]中任一项所述的脂溶性维生素固定化量测定方法，其中，前述溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(3)。
[0037]
提取液量y(ml)≤{(k
×
膜面积2(m2)/溶剂流速(ml/分钟))+61}
×
3.5(3)
[0038]
(式(3)中，k＝800。)
[0039]
[7]
[0040]
根据上述[1]～[4]中任一项所述的脂溶性维生素固定化量测定方法，其中，前述溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(4)。
[0041]
提取液量y(ml)≤{(k
×
膜面积2(m2)/溶剂流速(ml/分钟))+61}
×
2.5(4)
[0042]
(式(4)中，k＝800。)
[0043]
[8]
[0044]
根据上述[1]～[4]中任一项所述的脂溶性维生素固定化量测定方法，其中，前述溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(5)。
[0045]
提取液量y(ml)≤{(k
×
膜面积2(m2)/溶剂流速(ml/分钟))+61}
×
2(5)
[0046]
(式(5)中，k＝800。)
[0047]
[9]
[0048]
根据上述[1]～[4]中任一项所述的脂溶性维生素固定化量测定方法，其中，前述溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(6)。
[0049]
提取液量y(ml)≤溶剂流速(ml/分钟)
×
5(6)
[0050]
发明的效果
[0051]
通过本发明的方法，可以正确且有效地测定在内部具有中空纤维膜的血液净化用组件的中空纤维膜内表面固定化的脂溶性维生素的量.
附图说明
[0052]
图1为表示本发明的血液净化用组件的一实施方式的图。
具体实施方式
[0053]
以下对本发明的实施方式(以下称为“本实施方式”)进行详细说明，但是本发明不限于此，在不脱离其主旨的范围内能够进行各种变形。
[0054]
本实施方式的脂溶性维生素固定化量测定方法，其为对具备含有脂溶性维生素的中空纤维膜、以及具有与前述中空纤维膜内部连接的血液入口和血液出口的容器的血液净化用组件的前述中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量进行测定的方法，所述方法具有：
[0055]
从前述血液入口输送溶剂的工序、
[0056]
将从前述血液出口排出的溶剂回收的工序、和
[0057]
对前述回收的溶剂中含有的脂溶性维生素含量进行测定的工序。
[0058]
[血液净化用组件]
[0059]
本实施方式的血液净化用组件没有特别限定，至少具备含有脂溶性维生素的中空纤维膜、以及具有与前述中空纤维膜内部连接的血液入口和血液出口的容器。
[0060]
例如如图1所示那样，血液净化用组件10为在容器13插入由很多中空纤维膜形成的中空纤维膜束14，所述容器13在两端部附近具有透析液流路进口11和透析液流路排出口12，然后对于该两端部利用密封部15、16将容器的两端部分别液密地密封而成。容器13的两端与分别具备血液入口17和血液出口18的头部19、20分别抵接，头部19、20与容器13分别固定。处理体液的情况下，血液入口17和血液出口18与跟人体等连接的管23、24连接。作为前述外筒、头部的原材料，可列举出聚碳酸酯、聚丙烯等。另外，作为前述密封部的材料，可列举出聚氨酯等。
[0061]
血液净化用组件被中空纤维膜和密封部隔成2个分区，形成通过利用中空纤维膜内腔、上述密封部和头部形成的空间形成的血液流路、以及利用中空纤维膜的外表面和上述容器形成的第2流路。使用血液净化组件的情况下，在上述血液流路流通血液、在上述第2流路流通透析液。
[0062]
本实施方式的脂溶性维生素固定化量测定方法为对血液净化用组件的中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量进行测定的方法。对于脂溶性维生素的含量，从提高生物相容性和抗氧化能力的观点考虑，与中空纤维的滤液流路侧相比需要在血液流路侧、也就是说中空纤维内表面附近增多。另一方面，若内表面附近的脂溶性维生素固定化量高到必要以上，则有可能内表面的疏水性过高而刺激血液凝固系统。因此正确且有效地测定血液净化用组件的中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量是否处于适当的范围内是重要的。
[0063]
在此，血液净化用组件的中空纤维膜内表面若处于经过固体化的脂溶性维生素所具有的抗氧化能力等功能得到充分表现的范围内则没有特别限定，指的是自中空纤维膜内腔(血液流路侧)的膜表面优选1～1000nm、更优选1～500nm、进一步优选1～5nm的区域。
[0064]
[脂溶性维生素]
[0065]
本实施方式中，脂溶性维生素没有特别限定，通常指的是难以溶解于水、而溶解于醇、油脂的维生素，若例示则可列举出维生素a、维生素d、维生素e、维生素k和泛醌等，其中，优选为维生素e。作为维生素e，可列举出α-生育酚、α-乙酸生育酚酯、α-烟酸生育酚酯、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚等。其中，α-生育酚具有生物体内抗氧化作用、生物膜稳定化作用、血小板聚集抑制作用等各种生理作用，因此特别优选。
[0066]
[中空纤维膜]
[0067]
本实施方式中的血液净化用组件内部中含有的中空纤维膜没有特别限定，例如为血液透析器、血液过滤透析器、血液过滤器、持续式血液过滤(透析)器、血浆分离器、血浆成分分离器、腹水过滤器、腹水浓缩器、人工肺等中使用的中空纤维膜，为具有适于各种用途的孔径的、由疏水性高分子和亲水性高分子形成的含有脂溶性维生素的中空纤维膜。患者受到的氧化应激，若考虑到因体外循环治疗的反复、长期化而累积，则在高频且长期实施的血液透析或血液过滤透析中，优选使用本实施方式的血液净化用组件作为血液透析器、血
液过滤透析器。
[0068]
构成中空纤维膜的疏水性高分子指的是不溶解于水或对水不表现出亲和性的合成或天然高分子，若例示则可列举出聚砜、聚醚砜、聚酰胺、聚芳酯、聚醚砜-聚芳酯的聚合物合金、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚醚醚酮、聚烯丙基醚酮、纤维素三乙酸酯、纤维素二乙酸酯等。其中，从作为聚合物的组成的均匀性观点考虑，优选为合成高分子，特别是聚砜，在血液净化用途中的合适的临床实际成绩很多，作为原料的稳定供给性优异，因此特别优选。本发明中所称的聚砜，除了芳香环的一部分被化学修饰的聚砜之外，也包括聚苯砜、聚烯丙基醚砜等所谓的类缘化合物。
[0069]
构成中空纤维膜的亲水性高分子指的是，可溶于水、并且通过物理处理和/或化学处理进行交联、由此对于水能够不溶化的物质，若例示则可列举出聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚乙二醇(peg)、聚丙二醇(ppg)、羟丙基纤维素(hpc)、淀粉、羟乙基淀粉(hes)等。其中，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇由于中空纤维膜的孔形成性良好而优选、特别优选聚乙烯吡咯烷酮。
[0070]
本发明中所称的中空纤维膜含有上述疏水性高分子和亲水性高分子，对于它们的存在形态没有特别限定。例如可以为将相容性高的成分彼此进行聚合物混合的形态、在疏水性高分子的膜基材接枝亲水性高分子的形态。或者也可以使用包含疏水性成分和亲水性成分的共聚高分子。作为其例子，可列举出pvp和psf的嵌段共聚物、peg和psf的嵌段共聚物等。
[0071]
填充有本实施方式的中空纤维膜的血液净化用组件中的血液侧流路指的是通过中空纤维膜隔开的中空纤维膜内侧的空间或形成于中空纤维膜外侧与容器内侧之间的空间，指的是流通血液的空间。血液透析器等在中空纤维膜的内腔部流通血液的情况下，指的是中空纤维膜内表面侧的空间，而例如人工肺那样在中空纤维膜的内腔流通气体的情况下，指的是形成于中空纤维膜外侧与容器内侧之间的空间。
[0072]
填充有本实施方式的中空纤维膜的血液净化用组件中的滤液侧流路，指的是隔开血液侧流路和中空纤维膜的、与前述血液侧流路相反侧的空间，指的是流通滤液、透析液的空间。血液透析器等在中空纤维膜的内腔部流通血液的情况下，指的是形成于中空纤维膜外侧和容器内侧之间的空间，而例如如人工肺那样在中空纤维膜的内腔流通气体的情况下，指的是中空纤维膜内侧的空间。
[0073]
填充到本实施方式的血液净化用组件的中空纤维膜，优选按膜面积换算计以10mg/m2以上且300mg/m2以下的范围含有脂溶性维生素。在此所称的膜面积指的是参与过滤、透析的中空纤维膜的实效总内表面积，通过中空纤维膜的平均内径、圆周率、根数和有效长的乘积表示。若该脂溶性维生素按膜面积换算计少于10mg/m2则脂溶性维生素的覆盖容易产生不均，因此存在抗氧化能力变差的倾向。另一方面，若多于300mg/m2则即使在膜整体的表面、例如中空纤维内表面以外的不接触血液的中空纤维内部、中空纤维外表面也附着大量的脂溶性维生素，因此存在膜整体的疏水性变强的倾向。其结果，不仅血液成分、过滤液或透析液等的透过能力降低，而且抗血栓性降低、产生残血。进而，由于灭菌时的热历程、与热水接触，而有可能该脂溶性维生素产生局部聚集而在中空纤维内产生裂纹。因此，更优选含量的范围为50mg/m2以上且270mg/m2以下、进一步优选80mg/m2以上且250mg/m2以下、特别优选100mg/m2以上且200mg/m2以下。
[0074]
填充到本实施方式的血液净化用组件的中空纤维膜的膜面积优选为0.5～3.0m2。若膜面积为0.5m2以上则由于可以确保对于治疗而言充分的血液量，因此存在在治疗时间内得到治疗效果的倾向，若为3.0m2以下则体外循环的血液不会过度增加，由此存在可以降低由于患者的体内的血液减少所导致的血压降低等不良问题的倾向。
[0075]
作为本实施方式中的血液净化用组件的制造方法，没有特别限定，例如通过公知的方法，将由疏水性高分子和亲水性高分子形成的血液净化用中空纤维膜的束填充到容器，装配、成型为通常的中空纤维膜型血液净化装置的形状后，依次经过脂溶性维生素的覆盖工序和灭菌工序后构成。此时，在覆盖工序和灭菌工序之间，也可以附加中空纤维膜的湿润化工序和灭菌保护剂的添加工序。
[0076]
本实施方式的脂溶性维生素固定化量的测定方法为对上述的血液净化用组件的中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量进行测定的方法，所述方法具有：
[0077]
从前述血液入口输送溶剂的工序、
[0078]
将从前述血液出口排出的溶剂回收的工序、和
[0079]
对前述回收的溶剂中含有的脂溶性维生素含量进行测定的工序。
[0080]
血液净化用组件中含有填充液的情况下，可以使用在从血液入口输送溶剂之前，从血液净化用组件去除填充液、进行水洗涤进一步将填充液排除后、干燥数小时的组件。
[0081]
[溶剂]
[0082]
作为本实施方式的测定方法中使用的溶剂，若溶解脂溶性维生素、并且不溶解中空纤维膜则没有特别限定，可列举出例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、2-乙基己醇等醇类；二乙基醚等醚类；甲基溶纤剂(乙二醇单甲基醚)、乙基溶纤剂(乙二醇单乙基醚)等二元醇醚类；1,2,2-三氯-1,2,2-三氟乙烷、三氯氟甲烷、1,1,2,2-四氯-1,2-二氟乙烷等氯化氟化烃；氟化甲烷、四氟化碳、四氟乙烷、四氟乙烯、全氟甲基丙基环己烷、全氟丁基环己烷等全氟环烷烃类、全氟癸烷、全氟甲基十氢化萘、全氟烷基四氢吡喃等氟化烃；或己烷、庚烷、癸烷等烃等。溶剂若由它们之中根据所使用的中空纤维膜的种类适当选择即可，但是其中，在工业用生产中使用的情况下，优选为廉价、安全上沸点升高的溶剂，进而为了含有很多的脂溶性维生素，优选为溶解力更高的溶剂。例如作为中空纤维膜的基材使用聚砜、作为脂溶性维生素使用维生素e的情况下，作为溶剂，优选使用醇类，更优选为异丙醇、乙醇，特别优选乙醇。
[0083]
另外，作为溶剂，使用醇类的情况下，优选使用醇浓度为75％(体积比)以上的醇水溶液。醇水溶液的醇浓度为75％以上的情况下，存在可以将中空纤维膜内表面的脂溶性维生素充分溶出的倾向。作为醇浓度的上限，没有特别限定，但是浓度过高的情况下，作为中空纤维膜使用的基材溶出，由此有可能对脂溶性维生素的测定造成不良影响，因此优选为93％以下。醇水溶液的醇浓度更优选为78～93％、进一步优选83～91％。
[0084]
[提取液量]
[0085]
本实施方式的脂溶性维生素固定化量测定方法中，包括从血液入口输送溶剂的工序、和将从血液出口排出的溶剂回收的工序，将此时的从血液出口排出的溶剂的量定义为“提取液量”。
[0086]
本实施方式中，优选溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(1)。
[0087]
0.1
×
溶剂流速+5.2≤提取液量y(ml) (1)
[0088]
通过提取液量y满足上述式(1)，各组件的脂溶性维生素固定化量的测定值的偏差减小，存在能够稳定地测定的倾向。
[0089]
另外，本实施方式中，优选溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(2)。
[0090]
提取液量y(ml)≤{(k
×
膜面积2(m2)/溶剂流速(ml/分钟))+61}
×
7.5(2)
[0091]
(式(2)中，k＝800。)
[0092]
溶剂回收工序中的提取液量y满足式(2)的情况下，存在可以使在中空纤维膜内表面固定化的脂溶性维生素充分溶出的倾向。
[0093]
需要说明的是，上述计算式的根据如以下所述。
[0094]
根据1：若膜面积增大则被固定化的维生素量也增大，因此必要的提取液量增多。由此，提取液量与膜面积成比例。
[0095]
根据2：提取液量与线速度成反比。
[0096]
进而，本实施方式中，优选溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(3)。
[0097]
提取液量y(ml)≤{(k
×
膜面积2(m2)/溶剂流速(ml/分钟))+61}
×
3.5(3)
[0098]
(式(3)中，k＝800。)
[0099]
溶剂回收工序中的提取液量y满足式(3)的情况下，可以降低在膜内表面以外的膜内部固定化的脂溶性维生素的溶出，因此存在可以更正确地测定在中空纤维膜内表面固定化的脂溶性维生素的量的倾向。
[0100]
需要说明的是，本实施方式的测定方法中，将提取溶剂的单位体积的脂溶性维生素浓度变化量之差δ为1μg/ml的时刻判断为内表面的脂溶性维生素被提取、其以后判断仅膜内部的脂溶性维生素被提取。
[0101]
进而，本实施方式中，优选溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(4)。
[0102]
提取液量y(ml)≤{(k
×
膜面积2(m2)/溶剂流速(ml/分钟))+61}
×
2.5(4)
[0103]
(式(4)中，k＝800。)
[0104]
溶剂回收工序中的提取液量y满足式(4)的情况下，存在可以提取在中空纤维膜内表面固定化的脂溶性维生素的约95％、并且可以削减溶剂的成本和提取时间的倾向。
[0105]
进而，本实施方式中，优选溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(5)。
[0106]
提取液量y(ml)≤{(k
×
膜面积2(m2)/溶剂流速(ml/分钟))+61}
×
2(5)
[0107]
(式(5)中，k＝800。)
[0108]
溶剂回收工序中的提取液量y满足式(5)的情况下，可以将在切实地反映脂溶性维生素的功能表现的中空纤维膜内表面附近(优选自内表面1～5nm)存在的脂溶性维生素的大致100％提取，另外，膜内部的脂溶性维生素的提取量也被抑制于5％以下，因此存在可以更正确地测定在内表面附近固定化的脂溶性维生素的倾向。
[0109]
进而，本实施方式中，优选溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(6)。
[0110]
提取液量y(ml)≤溶剂流速(ml/分钟)
×
5(6)
[0111]
溶剂回收工序中的提取液量y满足式(6)的情况下，存在可以消减溶剂的成本和提取时间、可以更有效地测定脂溶性维生素的量的倾向。
[0112]
本实施方式的脂溶性维生素固定化量测定方法中，包括对回收的溶剂中含有的脂溶性维生素含量进行测定的工序。对于对回收的溶剂中含有的脂溶性维生素含量进行测定的方法没有特别限定，例如可以通过测定脂溶性维生素的吸收波长的高效液相色谱(hplc)
或uv计、微生物学的定量法测定。更具体而言，可以根据后述的实施例中记载的方法测定。
[0113]
[实施例]
[0114]
以下通过实施例对本发明进行更详细说明，但是本发明不被这些实施例任何限定。本实施例中的测定方法如以下所述。
[0115]
＜中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量测定方法＞
[0116]
将中空纤维膜型血液净化装置水洗后，去除洗涤水，进行干燥处理。
[0117]
接着，从血液入口以任意的流速流通任意浓度的乙醇水溶液，以任意的量回收从血液出口出来的液体，作为提取液。
[0118]
定量操作使用以下的装置利用液相色谱法进行，使用由脂溶性物质标准溶液的峰面积得到的标准曲线，求出提取液的脂溶性维生素含量。
[0119]
在高效液相色谱装置(泵：日本分光pu-1580、检测器：岛津rid-6a、自动注射器：岛津sil-6b、数据处理：tosoh corporation gpc-8020、色谱柱烘箱：gl sciences556)安装色谱柱(shodex asahipak公司制odp-506e packed column for h-plc)，在色谱柱温度40℃下，以流量1ml/分钟流通作为流动相的高效液相色谱用甲醇，由紫外部分的吸收峰的面积求出脂溶性维生素浓度。由所求出的脂溶性物质浓度，将提取效率设为100％，求出脂溶性维生素含量(mg/m2)。
[0120]
将从血液出口出来的液体分为各25ml的馏分来回收时，在馏分的脂溶性维生素浓度差成为δ＝-1μg/ml时，定义为存在于中空纤维内表面的脂溶性维生素被全部提取。此后仅存在于中空纤维内部的脂溶性维生素被提取。
[0121]
由成为|δ|《1的5个馏分的脂溶性维生素含量制成的近似直线作为中空纤维内部的脂溶性维生素量(a)。利用以下的式(x)计算中空纤维内表面的脂溶性维生素量(b)。
[0122]
b＝馏分中的脂溶性维生素含量-a(x)
[0123]
由提取开始起直至成为δ＝-1的时刻为止的b的总和作为存在于中空纤维内表面的总脂溶性维生素量。
[0124]
＜存在于中空纤维膜整体(内表面和膜内部)的脂溶性维生素含量测定方法＞
[0125]
将血液净化装置分解、采集血液净化用中空纤维膜，将该中空纤维膜水洗后，进行干燥，测定经过干燥的中空纤维膜重量后，将其总量细细裁断，加入400ml的100％乙醇，室温下用60分钟施加超声波振动的同时进行脂溶性维生素的提取。
[0126]
定量操作使用以下的装置利用液相色谱法进行，使用由脂溶性物质标准溶液的峰面积得到的标准曲线，求出提取液的脂溶性维生素含量。
[0127]
在高效液相色谱装置(泵：日本分光pu-1580、检测器：岛津rid-6a、自动注射器：岛津sil-6b、数据处理：tosoh corporation gpc-8020、色谱柱烘箱：gl sciences556)安装色谱柱(shodex asahipak公司制odp-506e packed column for h-plc)，在色谱柱温度40℃下，以流量1ml/分钟流通作为流动相的高效液相色谱用甲醇，由紫外部分的吸收峰的面积求出脂溶性维生素浓度。由所求出的脂溶性物质浓度，将提取效率设为100％，求出脂溶性维生素含量(mg/m2)。
[0128]
＜膜内表面的脂溶性维生素标准化峰强度测定方法＞
[0129]
对在经过干燥的中空纤维的纵方向形成裂缝而打开、露出的膜内表面，使用tof-sims装置(triftiii、physical electronics公司制)进行测定。对于测定条件，在一次离子
ga
+
、加速电压15kv、电流600pa(作为dc)、分析面积200μm
×
200μm、累计时间5分钟下进行，利用检测器，将负离子(作为mass，脂溶性维生素为163)作为检出离子检出。本测定装置的特性上，测定深度相当于由表面起直至5nm为止的深度。使用所得到的脂溶性维生素峰的离子强度(iv)、质子的离子强度ih、总离子强度it，利用以下的式(y)计算脂溶性维生素的标准化峰强度。
[0130]
标准化峰强度＝iv/(it-ih)(y)
[0131]
[实施例1]
[0132]
从经过干燥的膜面积2.1m2的中空纤维膜型血液净化装置的血液入口，以流速100ml/分钟流通85v/v％乙醇水溶液，将100ml的提取液回收，测定中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量，结果为48mg/m2。
[0133]
[实施例2]
[0134]
使用90v/v％乙醇水溶液，除此之外实施与实施例1相同的方法。测定中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量，结果为52mg/m2。
[0135]
[实施例3]
[0136]
使用100v/v％乙醇水溶液，除此之外实施与实施例1相同的方法。测定中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量，结果为38mg/m2。
[0137]
[实施例4]
[0138]
使用70v/v％乙醇水溶液，除此之外实施与实施例1相同的方法。测定中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量，结果为32mg/m2。
[0139]
[实施例5]
[0140]
使用65v/v％乙醇水溶液，除此之外实施与实施例1相同的方法。测定中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量，结果为16mg/m2。
[0141]
[实施例6](满足式(1)、(2)、(6)的方法)
[0142]
从经过干燥的膜面积2.1m2的中空纤维膜型血液净化装置的血液入口，以流速100ml/分钟流通85v/v％乙醇水溶液，分为各25ml的馏分来回收，结果提取液量的总计成为400ml的时刻的馏分中的脂溶性维生素浓度的变化量为δ＝-4.56μg/ml、馏分中的脂溶性维生素含量为0.53mg/m2。
[0143]
总提取液量中的脂溶性维生素中、从中空纤维内部提取的脂溶性维生素所占的比率为11％、从中空纤维膜内表面提取的脂溶性维生素所占的比率为89％。
[0144]
相对于存在于中空纤维膜内表面的全部脂溶性维生素总量，所提取的膜内表面的脂溶性维生素为99％。
[0145]
400ml的提取花费的时间为4分钟。
[0146]
[实施例7](满足式(1)的方法)
[0147]
实施与实施例6相同的方法。提取液量的总计成为1000ml的时刻的馏分中的脂溶性维生素浓度的变化量为δ＝-0.43μg/ml、馏分中的脂溶性维生素含量为0.13mg/m2。
[0148]
总提取液量中的脂溶性维生素中、从中空纤维内部提取的脂溶性维生素所占的比率为18％、从中空纤维膜内表面提取的脂溶性维生素所占的比率为82％。
[0149]
相对于存在于中空纤维膜内表面的全部脂溶性维生素总量，所提取的膜内表面的脂溶性维生素为100％。
[0150]
1000ml的提取花费的时间为10分钟。
[0151]
[实施例8](满足式(1)、(3)、(6)的方法)
[0152]
实施与实施例6相同的方法。提取液量的总计成为300ml的时刻的馏分中的脂溶性维生素浓度的变化量为δ＝-9.91μg/ml、馏分中的脂溶性维生素含量为0.82mg/m2。
[0153]
总提取液量中的脂溶性维生素中、从中空纤维内部提取的脂溶性维生素所占的比率为9％、从中空纤维膜内表面提取的脂溶性维生素所占的比率为81％。
[0154]
相对于存在于中空纤维膜内表面的全部脂溶性维生素总量，所提取的膜内表面的脂溶性维生素为97％。
[0155]
[实施例9](满足式(1)、(4)、(6)的方法)
[0156]
实施与实施例6相同的方法。提取液量的总计成为200ml的时刻的馏分中的脂溶性维生素浓度的变化量为δ＝-28.6μg/ml、馏分中的脂溶性维生素含量为1.42mg/m2。
[0157]
总提取液量中的脂溶性维生素中、从中空纤维内部提取的脂溶性维生素所占的比率为7％、从中空纤维膜内表面提取的脂溶性维生素所占的比率为93％。
[0158]
相对于存在于中空纤维膜内表面的全部脂溶性维生素总量，所提取的膜内表面的脂溶性维生素为93％。
[0159]
[实施例10](满足式(1)、(5)、(6)的方法)
[0160]
实施与实施例6相同的方法。提取液量的总计成为75ml的时刻的馏分中的脂溶性维生素浓度的变化量为δ＝-481.0μg/ml、馏分中的脂溶性维生素含量为8.10mg/m2。
[0161]
总提取液量中的脂溶性维生素中、从中空纤维内部提取的脂溶性维生素所占的比率为4％、从中空纤维膜内表面提取的脂溶性维生素所占的比率为96％。
[0162]
相对于存在于中空纤维膜内表面的全部脂溶性维生素总量，所提取的膜内表面的脂溶性维生素为68％。
[0163]
回收提取液时，产生2秒的误差、即、3.3ml的误差。回收75ml的提取液的情况下，相对于75ml的提取液中的脂溶性维生素含量，以误差3.3ml产生的脂溶性维生素量所占的比率在计算上为0.1％。
[0164]
[实施例11](满足式(6)的方法)
[0165]
利用与实施例6相同的方法回收10ml的提取液的情况下，相对于10ml的提取液中的脂溶性维生素含量，以误差3.3ml产生的脂溶性维生素量所占的比率在计算上为28.3％。
[0166]
[表1]
[0167][0168]
[实施例12]
[0169]
使用经过干燥的膜面积1.3m2的中空纤维膜型血液净化装置，以流速100ml/分钟流通85v/v％乙醇水溶液，将75ml的提取液回收后，利用tof-sims测定存在于中空纤维膜内表面1～5nm附近的脂溶性维生素存在量，结果与乙醇水溶液通液前相比减少95％，示出与没有涂布脂溶性维生素的膜同等的值。
[0170]
[实施例13]
[0171]
使用膜面积1.5m2的中空纤维膜型血液净化装置，将80ml的提取液回收，除此之外实施与实施例12相同的方法。存在于中空纤维膜内表面1～5nm附近的脂溶性维生素存在量，与乙醇水溶液通液前相比减少95％，示出与没有涂布脂溶性维生素的膜同等的值。
[0172]
[实施例14]
[0173]
从经过干燥的膜面积2.1m2的中空纤维膜型血液净化装置的血液入口，以流速100ml/分钟流通85v/v％乙醇水溶液，将95ml的提取液回收，测定中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量，结果为45mg/m2。
[0174]
[实施例15]
[0175]
从经过干燥的膜面积1.8m2的中空纤维膜型血液净化装置的血液入口，以流速83ml/分钟流通85v/v％乙醇水溶液，将81ml的提取液回收，测定中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量，结果为41mg/m2。
[0176]
[实施例16]
[0177]
从经过干燥的膜面积1.5m2的中空纤维膜型血液净化装置的血液入口，以流速72ml/分钟流通85v/v％乙醇水溶液，将68ml的提取液回收，测定中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量，结果为56mg/m2。
[0178]
[比较例1]
[0179]
将血液净化装置分解、采集血液净化用中空纤维膜，将该中空纤维膜水洗后，进行干燥，测定经过干燥的中空纤维膜重量后，将其总量细细裁断，加入400ml的100％乙醇，室温下用60分钟施加超声波振动的同时进行脂溶性维生素的提取。
[0180]
定量操作利用液相色谱法进行，使用由脂溶性物质标准溶液的峰面积得到的标准曲线，求出提取液的脂溶性维生素含量。
[0181]
利用上述方法时，能够测定中空纤维膜整体中含有的脂溶性维生素，但是难以测
定仅在中空纤维膜表面固定化的脂溶性维生素的含量。

技术特征：
1.一种脂溶性维生素固定化量测定方法，其为对具备含有脂溶性维生素的中空纤维膜、以及具有与所述中空纤维膜内部连接的血液入口和血液出口的容器的血液净化用组件的所述中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量进行测定的方法，所述方法具有：从所述血液入口输送溶剂的工序、将从所述血液出口排出的溶剂回收的工序、和对所述回收的溶剂中含有的脂溶性维生素含量进行测定的工序。2.根据权利要求1所述的脂溶性维生素固定化量测定方法，其中，所述溶剂为醇类。3.根据权利要求2所述的脂溶性维生素固定化量测定方法，其中，所述醇类为醇浓度75％(体积比)以上的醇水溶液。4.根据权利要求1～3中任一项所述的脂溶性维生素固定化量测定方法，其中，所述溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(1)，0.1
×
溶剂流速(ml/分钟)+5.2≤提取液量y(ml) (1)。5.根据权利要求1～4中任一项所述的脂溶性维生素固定化量测定方法，其中，所述溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(2)，提取液量y(ml)≤{(k
×
膜面积2(m2)/溶剂流速(ml/分钟))+61}
×
7.5(2)式(2)中，k＝800。6.根据权利要求1～4中任一项所述的脂溶性维生素固定化量测定方法，其中，所述溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(3)，提取液量y(ml)≤{(k
×
膜面积2(m2)/溶剂流速(ml/分钟))+61}
×
3.5(3)式(3)中，k＝800。7.根据权利要求1～4中任一项所述的脂溶性维生素固定化量测定方法，其中，所述溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(4)，提取液量y(ml)≤{(k
×
膜面积2(m2)/溶剂流速(ml/分钟))+61}
×
2.5(4)式(4)中，k＝800。8.根据权利要求1～4中任一项所述的脂溶性维生素固定化量测定方法，其中，所述溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(5)，提取液量y(ml)≤{(k
×
膜面积2(m2)/溶剂流速(ml/分钟))+61}
×
2(5)式(5)中，k＝800。9.根据权利要求1～4中任一项所述的脂溶性维生素固定化量测定方法，其中，所述溶剂回收工序中的提取液量y满足下述式(6)，提取液量y(ml)≤溶剂流速(ml/分钟)
×
5(6)。

技术总结
脂溶性维生素固定化量测定方法。[课题]提供正确且有效地测定在内部具有中空纤维膜的血液净化用组件的中空纤维膜内表面固定化的脂溶性维生素的量的方法。[解决手段]一种脂溶性维生素固定化量测定方法，其为对具备含有脂溶性维生素的中空纤维膜、以及具有与前述中空纤维膜内部连接的血液入口和血液出口的容器的血液净化用组件的前述中空纤维膜内表面的脂溶性维生素固定化量进行测定的方法，所述方法具有：从前述血液入口输送溶剂的工序、将从前述血液出口排出的溶剂回收的工序、和对前述回收的溶剂中含有的脂溶性维生素含量进行测定的工序。定的工序。


技术研发人员：西泽一树 小久保奈奈
受保护的技术使用者：旭化成医疗株式会社
技术研发日：2023.01.30
技术公布日：2023/8/5