一种筛选碱性低温条件下降解莠去津的培养物的方法

1.本发明涉及生物降解农药残留技术领域，具体的说是一种筛选碱性低温条件下降解莠去津的培养物的方法。


背景技术：

2.莠去津是一种高选择和内吸传导型的三嗪类除草剂。可通过抑制光系统ⅱ电子的传递，从而抑制植物的光合作用，主要用于防除一年生禾本科和阔叶杂草，在世界范围内得到了广泛的应用。莠去津的迁徙性高，常会因地表径流、淋溶和灌溉等方式污染地下水和江河湖流，严重影响生态环境和生物体健康，因此去除环境中莠去津的残留具有重要意义。其中基于微生物降解的生物修复技术已受到广泛关注，已经筛选到多种可以降解莠去津的微生物，但单一菌种存在环境适应性差，对农药降解不彻底等局限性。另外，土壤温度和ph值等因素会影响除草剂的微生物降解，多数除草剂在自然高温条件下因饱和蒸气压增大而进行主动挥发，在酸性条件下通过水解作用而逐渐消失。因此，为避免以上局限性并将微生物降解作用最大化，获得能够在碱性低温条件下的降解莠去津的培养物是目前急需必要的。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种筛选碱性低温条件下降解莠去津的培养物的方法。
4.为实现上述目的，本发明采用技术方案：
5.一种筛选碱性低温条件下降解莠去津的培养物的方法，将样品添加至含有初始浓度为100mg/l莠去津、初始ph9.0的培养基中25℃，160r/min摇床培养30天；将所得培养液按体积百分比10％接种至含有莠去津的培养基中培养，按此方式在含不同莠去津浓度的培养基中再转接培养4次，将所得培养液再按照体积百分比5％接种至含莠去津浓度为1000mg/l的培养基中于25℃，160r/min摇床培养30天，按此方式在含相同莠去津浓度的培养基中再转接培养4次，即获得具有降解莠去津的培养物。
6.将所得培养液按体积百分比10％接种至含莠去津浓度为200mg/l的培养基中培养，而后转接至莠去津浓度递增的培养基中再转接培养4次；其中，莠去津递增浓度为200mg/l，最后一次转接时培养基中莠去津浓度为1000mg/l。
7.培养基成分为：磷酸氢二钾1克，硝酸钠1克，七水硫酸亚铁0.01克，丙酮酸钠0.3克，硫酸铵1克，硫酸镁0.5克，氯化钾0.5克，蒸馏水1000ml，0.1％钙溶液，0.1％微量元素溶液，ph值9.0。
8.所述0.1％钙溶液为氯化钙30克，蒸馏水1000ml；所述微量元素溶液：七水硫酸镁1.5克，六水氯化钴0.15克，钼酸钠二水0.1克，一水硫酸锰1.5克，五水硫酸铜0.15克，硼酸0.3克，六水氯化镍0.06克，碘化钾0.06克，蒸馏水1000ml。
9.所述样品为利用无菌采样铲采集土壤，置于无菌塑料袋中密封，在低温、避光条件下运送至实验室，置于4℃冰箱中保存。
10.本发明所具有的优点：
11.1.通过本发明方法驯化筛选得出的高效培养物可在碱性低温条件下对莠去津进行降解。
12.2.通过本发明方法筛选出的培养物环境适应性强，在不同环境下更能发挥有效作用。
13.3.通过本发明方法筛选出的培养物对环境友好，无毒无害，可有效保护生态环境和人体健康。
具体实施方式
14.以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
15.实施例1
16.取安徽省某有限责任公司长期受莠去津污染的土壤样品10g，加入到初始ph为9.0的100ml培养基中，25℃，160r/min摇床培养30天，待用；
17.培养基配方为：磷酸氢二钾1克，硝酸钠1克，七水硫酸亚铁0.01克，丙酮酸钠0.3克，硫酸铵1克，硫酸镁0.5克，氯化钾0.5克，莠去津0.01克，蒸馏水1000ml，0.1％钙溶液(氯化钙30g，蒸馏水1000ml)，0.1％微量元素溶液(七水硫酸镁1.5克，六水氯化钴0.15克，钼酸钠二水0.1克，一水硫酸锰1.5克，五水硫酸铜0.15克，硼酸0.3克，六水氯化镍0.06克，碘化钾0.06克，蒸馏水1000ml)，ph值9.0。
18.将所得培养液按体积比10％(v/v)的接种量接种于莠去津浓度为200mg/l的培养基中，然后在相同条件下摇床培养30天，依此类推共转接5次，每次转接按莠去津200mg/l的浓度梯度递增，使培养基中的莠去津最终浓度为1000mg/l，进行连续培养(共转接5次，每次培养基中莠去津的浓度依次为200mg/l、400mg/l、600mg/l、800mg/l、1000mg/l)。
19.再按体积比5％的接种量转接5次进行连续传代培养，莠去津的添加浓度始终为1000mg/l，进而获得具有降解莠去津的培养物。
20.将上述获得培养物按5％(v/v)的添加量添加至莠去津浓度为1000mg/l的50ml培养基中，用液相色谱法检测菌系对莠去津的降解率，色谱条件为，色谱柱：ultimate xb-c18柱(150mm
×
4.6mm，5μm)；检测器：dad二级管阵列检测器；流动相：甲醇-水(80:20v/v)；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；检测波长：254nm；进样量：5μl。经测定，该培养物对培养基中莠去津的降解率为80％。
21.上述连续培养、连续传代培养和测定莠去津降解率过程中的培养基按上述培养基配方配置，仅是莠去津的添加量不同。
22.实施例2
23.取安徽省某生物科技有限公司长期受莠去津污染的活性污泥10g，加入到初始ph为9.0的100ml培养基中，25℃，160r/min摇床培养30天，待用；
24.培养基配方为：磷酸氢二钾1克，硝酸钠1克，七水硫酸亚铁0.01克，丙酮酸钠0.3克，硫酸铵1克，硫酸镁0.5克，氯化钾0.5克，莠去津0.01克，蒸馏水1000ml，0.1％钙溶液(氯化钙30g，蒸馏水1000ml)，0.1％微量元素溶液(七水硫酸镁1.5克，六水氯化钴0.15克，钼酸钠二水0.1克，一水硫酸锰1.5克，五水硫酸铜0.15克，硼酸0.3克，六水氯化镍0.06克，碘化钾0.06克，蒸馏水1000ml)，ph值9.0。
25.将所得培养液按体积比10％(v/v)的接种量接种于莠去津浓度为200mg/l的培养基中，然后在相同条件下摇床培养30天，依此类推共转接5次，每次转接按莠去津200mg/l的浓度梯度递增，使培养基中的莠去津最终浓度为1000mg/l，进行连续培养(共转接5次，每次培养基中莠去津的浓度依次为200mg/l、400mg/l、600mg/l、800mg/l、1000mg/l)。
26.再按体积比5％的接种量转接5次进行连续传代培养，莠去津的添加浓度始终为1000mg/l，进而获得具有降解莠去津的培养物。
27.将上述获得培养物按5％(v/v)的添加量添加至莠去津浓度为1000mg/l的50ml培养基中，用液相色谱法测定该菌系对莠去津的降解率，色谱条件为，色谱柱：ultimate xb-c18柱(150mm
×
4.6mm，5μm)；检测器：dad二级管阵列检测器；流动相：甲醇-水(80:20v/v)；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；检测波长：254nm；进样量：5μl。经测定，该培养物对培养基中莠去津的降解率为77％。
28.上述连续培养、连续传代培养和测定莠去津降解率过程中的培养基按上述培养基配方配置，仅是莠去津的添加量不同。

技术特征：
1.一种筛选碱性低温条件下降解莠去津的培养物的方法，其特征在于：将样品添加至含有初始浓度为100mg/l莠去津、初始ph9.0的培养基中25℃，160r/min摇床培养30天；将所得培养液按体积百分比10％接种至含有莠去津的培养基中培养，按此方式在含不同莠去津浓度的培养基中再转接培养4次，将所得培养液再按照体积百分比5％接种至含莠去津浓度为1000mg/l的培养基中于25℃，160r/min摇床培养30天，按此方式在含相同莠去津浓度的培养基中再转接培养4次，即获得具有降解莠去津的培养物。2.按权利要求1所述的筛选碱性低温条件下降解莠去津的培养物的方法，其特征在于：将所得培养液按体积百分比10％接种至含莠去津浓度为200mg/l的培养基中培养，而后转接至莠去津浓度递增的培养基中再转接培养4次；其中，莠去津递增浓度为200mg/l，最后一次转接时培养基中莠去津浓度为1000mg/l。3.按权利要求1所述的筛选碱性低温条件下降解莠去津的培养物的方法，其特征在于：培养基成分为：磷酸氢二钾1克，硝酸钠1克，七水硫酸亚铁0.01克，丙酮酸钠0.3克，硫酸铵1克，硫酸镁0.5克，氯化钾0.5克，蒸馏水1000ml，0.1％钙溶液，0.1％微量元素溶液，ph值9.0。4.按权利要求3所述的筛选碱性低温条件下降解莠去津的培养物的方法，其特征在于：所述0.1％钙溶液为氯化钙30克，蒸馏水1000ml；所述微量元素溶液：七水硫酸镁1.5克，六水氯化钴0.15克，钼酸钠二水0.1克，一水硫酸锰1.5克，五水硫酸铜0.15克，硼酸0.3克，六水氯化镍0.06克，碘化钾0.06克，蒸馏水1000ml。5.按权利要求1所述的筛选碱性低温条件下降解莠去津的培养物的方法，其特征在于：所述样品为利用无菌采样铲采集土壤，置于无菌塑料袋中密封，在低温、避光条件下运送至实验室，置于4℃冰箱中保存。

技术总结
本发明涉及生物降解农药残留技术领域，具体的说是一种筛选碱性低温条件下降解莠去津的培养物的方法。将样品添加至含有初始浓度为100mg/L莠去津、初始pH9.0的培养基中25℃，160r/Min摇床培养30天；将所得培养液按体积百分比10％接种至含有莠去津的培养基中培养，按此方式在含不同莠去津浓度的培养基中再转接培养4次，将所得培养液再按照体积百分比5％接种至含莠去津浓度为1000mg/L的培养基中于25℃，160r/Min摇床培养30天，按此方式在含相同莠去津浓度的培养基中再转接培养4次，即获得具有降解莠去津的培养物。该方法操作简单、成本低、效率高。效率高。


技术研发人员：张惠文 徐明恺 陆长鸣 李想 李旭 王秀娟 李新宇
受保护的技术使用者：中国科学院沈阳应用生态研究所
技术研发日：2022.01.29
技术公布日：2023/8/5