一种细菌核酸释放剂结合磁珠进行核酸提取的方法

1.本发明涉及基因工程领域和分子生物学领域，尤其涉及从革兰氏阴性菌菌和革兰氏阳性菌的菌体裂解、核酸提取和核酸应用，特别是一种细菌核酸释放剂结合磁珠进行核酸提取的方法。


背景技术：

2.目前常用的细菌核酸提取的方法有滤膜法、磁珠法和煮沸法，前两种方法都能去除样本中的杂质、蛋白质、多糖、脂类等大分子，能得到高纯度的核酸；煮沸法提取的核酸杂质多且会对下游实验产生干扰，适用于要求不高的实验；而磁珠法与滤膜法相比，磁珠法操作更加简捷，核酸提取效率更高，且磁珠法富集痕量样本裂解游离出的核酸，提高检测灵敏性，也可与自动化核酸提取设备结合，实现大批量样本的核酸提取；但磁珠法提取核酸需要特殊的核酸释放试剂与其配合，才可以实现革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌核酸的高效提取，常用的细菌核酸裂解液会涉及到有毒有机物的使用，对实验环境和操作人员存在一定的危害，尤其对于革兰氏阳性菌的核酸提取需要使用大量的溶菌酶，更加提高了细菌核酸提取的成本。一般细菌核酸裂解液与磁珠法结合进行核酸提取时需要进行离心处理，这更阻碍了磁珠法与自动化核酸提取仪器的结合，使其无法进行样本批量处理。因此，开发一种可与磁珠法结合、无需高成本原料、无需离心操作、可与自动化核酸提取仪器结合进行样本批量处理、裂解效率高的细菌核酸释放剂成为目前亟待解决的问题。


技术实现要素：

3.针对目前磁珠法进行细菌核酸提取时存在的问题，本发明提供了一种细菌核酸释放剂结合磁珠进行核酸提取的方法。
4.本发明的细菌核酸释放剂是由a液：50mm tris-hcl、1m nacl、10mm edta、质量/体积比为1%的十二烷基硫酸锂（lds）和b液：浓度为20mg/ml蛋白酶k组成，该细菌核酸释放剂的ph在5~5.5，b液在裂解时加入，所用体积按a液与b液体积比为10:1计算；所述的体积百分比以无菌水为基准。
5.一种细菌核酸释放剂结合磁珠进行核酸提取的方法，由其特征在于使用了细菌核酸释放剂以及浓度为5mg/ml，粒径1.4μm的羟基二氧化硅磁珠进行核酸的吸附，提取时使用了异丙醇沉降核酸，70%乙醇进行磁珠洗涤液，te缓冲液（ph 8.0）进行磁珠上核酸洗脱。
6.本发明提供一种细菌核酸释放剂结合磁珠进行核酸提取的方法，包括以下步骤：一种如权利要求1和权利要求2所述的细菌核酸释放剂结合磁珠进行核酸提取的方法，在于按照下列步骤进行：步骤1：配置细菌核酸释放剂，a液：50mm tris-hcl、1m nacl、10mm edta、质量/体积比为1%的十二烷基硫酸锂（lds），称量好相应试剂并在55℃水浴条件下加热促进试剂融化，调整溶液ph至5~5.5；b液：20mg/ml 蛋白酶k溶液，b液在裂解时加入，b液所用体积按a液与b液体积比为10:1计算；
步骤2：根据菌液的浓度决定是否进行离心浓缩。菌液浓度低于或等于100cfu/ml时，建议进行先取1ml菌液，在12000rpm下，离心5min浓缩菌液至50-100μl,再进行步骤3；当菌液浓度高于100cfu/ml时，可直接进行步骤3；步骤3：取50μl的菌液，加入1.5ml ep管中，加入 200μl a液和20μl b液，在65℃水浴条件下，反应30min；步骤4：向反应完的混合溶液中中加入250μl异丙醇用于沉降核酸，静置1min；步骤5：再向混合溶液中加入70μl涡旋混匀的5mg/ml羟基二氧化硅磁珠，震荡混匀后，静置2min，使磁珠和裂解出的核酸充分结合；步骤6：使用磁铁固定磁珠，分离混合物中含有杂质的上清液；步骤7：加入200μl的70%乙醇溶液，快速吹打混匀，以除去磁珠和管壁上黏附的除核酸外的杂质；步骤8：使用磁铁固定磁珠，分离中含有杂质上清液；步骤9：加入200μl的70%乙醇溶液，再次快速吹打混匀，进行磁珠和管壁的再次清洗；步骤10：使用磁铁固定磁珠，再次分离含有杂质上清液，随后加入50μl的te缓冲液（ph 8.0），轻轻吹打混匀，在55℃水浴条件下进行核酸洗脱，10min后，使用磁铁固定磁珠，将含核酸的上清液转移到新的ep管进行保存。
7.本发明方法具有如下优点：采用本发明的细菌核酸释放剂可快速实现革兰氏阴性菌菌和革兰氏阳性菌中的菌体裂解、可与磁珠法结合进行核酸提取、无需高成本原料、核酸提取过程中无离心操作、可与自动化核酸提取仪器结合进行样本批量处理、无需大型仪器，操作简单，对操作人员要求极低，重要的是磁珠上洗脱下来的核酸纯度高，可以直接进行pcr扩增，环介导等温扩增等下游操作，特别适用于重大疾病的床边诊断和爆发重大疫情的现场检验工作。
附图说明
8.图1所示为利用本发明的细菌核酸释放剂和磁珠进行沙门菌核酸提取后进行pcr扩增的琼脂糖凝胶电泳图，其中1泳道为marker、2泳道为提取的沙门菌核酸pcr扩增产物；图2所示为利用本发明的细菌核酸释放剂和磁珠进行沙门菌核酸提取后进行lamp扩增的琼脂糖凝胶电泳图，其中1泳道为marker、2泳道为提取的沙门菌核酸lamp扩增产物；图3所示为利用本发明的细菌核酸释放剂和磁珠进行金黄色葡萄球菌核酸提取后进行pcr扩增的琼脂糖凝胶电泳图，其中1泳道为marker、2泳道为提取的金黄色葡萄球菌核酸pcr扩增产物；图4所示为利用本发明的细菌核酸释放剂和磁珠进行金黄色葡萄球菌核酸提取后进行lamp扩增的琼脂糖凝胶电泳图，其中1泳道为marker、2泳道为提取的金黄色葡萄球菌核酸lamp扩增产物。
具体实施方式
[0009] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0010]
实施例1
以革兰氏阴性菌沙门菌为例，说明本发明细菌核酸释放剂以及磁珠和细菌核酸释放剂结合进行核酸提取方法的应用；步骤1：配置细菌核酸释放剂，a液：取50ml 1m tris-hcl（ph=8.0）、称取58.44g 的nacl、称取2.9224g的edta、称取10g十二烷基硫酸锂（lds），称量好相应试剂溶解在900ml无菌水中，调整ph至5~5.5并定容到1000ml，混合好的a液在55℃水浴条件下加热促进所加试剂溶解； b液：20mg/ml 蛋白酶k溶液，b液在裂解时加入，b液所用体积按a液与b液体积比为10:1计算；步骤2 ：沙门菌在lb培养基中培养并在37℃、180r/min条件下摇菌12小时，菌液浓度高于100cfu/ml，直接进行步骤3；步骤3：取50μl的菌液，加入1.5ml ep管中，加入 200μl a液和20μl b液，在65℃水浴条件下，反应30min；步骤4：向反应完的混合溶液中加入250μl异丙醇用于沉降核酸，静置1min；步骤5：再向混合溶液中加入70μl涡旋混匀的5mg/ml羟基二氧化硅磁珠，震荡混匀后，静置2min，使磁珠和裂解出的核酸充分结合；步骤6：使用磁铁固定磁珠，分离混合物中含有杂质的上清液；步骤7：加入200μl的70%乙醇溶液，快速吹打混匀，以除去磁珠和管壁上黏附的除核酸外的杂质；步骤8：使用磁铁固定磁珠，分离中含有杂质上清液；步骤9：加入200μl的70%乙醇溶液，再次快速吹打混匀，进行磁珠和管壁的再次清洗；步骤10：使用磁铁固定磁珠，再次分离含有杂质上清液，随后加入50μl的te缓冲液（ph 8.0），轻轻吹打混匀，在55℃水浴条件下进行核酸洗脱，10min后，使用磁铁固定磁珠，将含核酸的上清液转移到新的ep管进行保存;步骤11：pcr扩增检测，取步骤10所得沙门菌核酸溶液1μl，加入到配置好的pcr反应溶液的pcr反应管中，将pcr反应管置于pcr仪上，设置循环参数，进行pcr反应，反应完后进行琼脂糖凝胶电泳，进行pcr扩增反应程序参见表1；本实施例采用型号为analytik jena 荧光定量pcr仪;表1pcr反应程序和反应表2pcr反应液的组分和浓度
上述taq2
×
pcr master mix的组分及浓度为：10mm mgcl2，50mm kcl，0.08% ipgal630，0.05% tween 20，ph 8.6@25℃；200μm dntps，5% glycerol，25u/ml taq dna聚合酶等用于扩增沙门菌的上游引物f和下游引物p，核酸序列参考表3;表3 沙门菌核酸pcr扩增引物序列步骤12：lamp扩增检测，取步骤10所得沙门菌核酸溶液1μl，加入到配置好的lamp反应溶液的200μl ep管中，将装好反应液的ep管置于金属水浴锅上，设置温度60℃，反应1小时后进行琼脂糖凝胶电泳，进行lamp扩增反应体系参考表4;本实施例采用型号为 scilogex恒温金属浴;表4 lamp反应液的组分和浓度上述10
×
isothermal amplification buffer的1
×
组分及浓度为20 mm tris-hcl，10 mm (nh4)2so4，50 mm kcl，2 mm mgso4，0.1% tween
®ꢀ
20 ph 8.8@25
°
c；用于lamp扩增沙门菌的3组引物核酸序列参考表5；表5 lamp扩增沙门菌的3组引物核酸序列
[0011]
实施例2以革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌为例，说明本发明细菌核酸释放剂以及细菌核酸释放剂结合磁珠进行核酸提取方法的应用；步骤1：配置细菌核酸释放剂，a液：取50ml 1m tris-hcl（ph=8.0）、称取58.44g 的nacl、称取2.9224g的edta、称取10g十二烷基硫酸锂（lds），称量好相应试剂溶解在900ml无菌水中，调整ph至5~5.5并定容到1000ml。混合好的a液在55℃水浴条件下加热促进所加试剂溶解； b液：20mg/ml 蛋白酶k溶液，b液在裂解时加入，b液所用体积按a液与b液体积比为10:1计算；步骤2：金黄色葡萄球菌在lb培养基中培养，并在37℃、180r/min条件下摇菌12小时，菌液浓度高于100cfu/ml，直接进行步骤3；步骤3：取50μl的菌液，加入1.5ml ep管中，加入 200μl a液和20μl b液，在65℃水浴条件下，反应30min；步骤4：向反应完的混合溶液中中加入250μl异丙醇用于沉降核酸，静置1min；步骤5：再向混合溶液中加入70μl涡旋混合均匀的5mg/ml羟基二氧化硅磁珠，震荡混匀后，静置2min，使磁珠和裂解出的核酸充分结合；步骤6：使用磁铁固定磁珠，分离混合物中含有杂质的上清液；步骤7：加入200μl的70%乙醇溶液，快速吹打混匀，以除去磁珠和管壁上黏附的除核酸外的杂质；步骤8：使用磁铁固定磁珠，分离中含有杂质上清液；步骤9：加入200μl的70%乙醇溶液，再次快速吹打混匀，进行磁珠和管壁的再次清洗；步骤10：使用磁铁固定磁珠，再次分离混合物中上清液分离中含有杂质上清液，随后加入50μl的te缓冲液（ph 8.0），轻轻吹打混匀，在55℃水浴条件下进行核酸洗脱，10min后，使用磁铁固定磁珠，将含核酸的上清液转移到新的ep管进行保存；步骤11：pcr扩增检测，取步骤10所得金黄色葡萄球菌核酸溶液1μl，加入到配置好的pcr反应溶液的pcr反应管中，将pcr反应管置于pcr仪上，设置循环参数，进行pcr反应，反应完后进行琼脂糖凝胶电泳，进行pcr扩增反应程序参见表6；本实施例采用型号为analytik jena 荧光定量pcr仪；表6pcr反应程序和反应
表7pcr反应液的组分和浓度上述taq2
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pcr master mix的组分及浓度为：10mm mgcl2，50mm kcl，0.08% ipgal630，0.05% tween 20，ph 8.6@25℃；200μm dntps，5% glycerol，25u/ml taq dna聚合酶等用于扩增金黄色葡萄球菌的上游引物f和下游引物p，核酸序列参考表8;表8 金黄色葡萄球菌核酸扩增引物序列步骤12：lamp扩增检测，取步骤10所得金黄色葡萄球菌核酸溶液1μl，加入到配置好的lamp反应溶液的200μlep管中，将装好反应液的ep管置于金属水浴锅上，设置温度60℃，反应1小时后进行琼脂糖凝胶电泳，进行lamp扩增反应体系参考表4。
[0012]
本实施例采用型号为 scilogex恒温金属浴；表9lamp反应液的组分和浓度
上述10
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isothermal amplification buffer的1
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组分及浓度为20 mm tris-hcl，10 mm (nh4)2so4，50 mm kcl，2 mm mgso4，0.1% tween
®ꢀ
20 ph 8.8@25
°
c；用于lamp扩增金黄色葡萄球菌的引物核酸序列参考表10；表10 lamp扩增金黄色葡萄球菌的引物核酸序列

技术特征：
1.一种细菌核酸释放剂结合磁珠进行核酸提取的方法，由其特征在于由a液：50mm tris-hcl、1m nacl、10mm edta、质量/体积比为1%的十二烷基硫酸锂（lds）和b液：浓度为20mg/ml蛋白酶k组成，该核酸释放剂的ph在5~5.5，b液在裂解时加入，所用体积按a液与b液体积比为10:1计算；所述的体积百分比以无菌水为基准。2.根据权利要求1所述一种细菌核酸释放剂结合磁珠进行核酸提取的方法，其特征在于，所述细菌核酸释放剂以及浓度为5mg/ml，粒径1.4μm的羟基二氧化硅磁珠进行核酸的吸附，使用了促进核酸沉降的异丙醇，磁珠洗涤液70%乙醇，磁珠核酸洗脱液te缓冲液（ph 8.0）。3.一种细菌核酸释放剂结合磁珠进行核酸提取的方法其特征在于，按照下列步骤进行：步骤1：配置细菌核酸释放剂，a液：50mm tris-hcl、1m nacl、10mm edta、质量/体积比为1%的十二烷基硫酸锂（lds），称量好相应试剂并在55℃水浴条件下加热促进试剂融化，调整溶液ph至5~5.5；b液：20mg/ml 蛋白酶k溶液，b液在裂解时加入，b液所用体积按a液与b液体积比为10:1计算；步骤2：根据菌液的浓度决定是否进行离心浓缩。菌液浓度低于或等于100cfu/ml时，建议进行先取1ml菌液，在12000rpm，离心5min浓缩菌液至50-100μl,再进行步骤3；当菌液浓度高于100cfu/ml时，可直接进行步骤3；步骤3：取50μl的菌液，加入1.5ml ep管中，加入 200μl a液和20μl b液，在65℃水浴条件下，反应30min；步骤4：向反应完的混合溶液中中加入250μl异丙醇用于沉降核酸，静置1min；步骤5：再向混合溶液中加入70μl涡旋混匀的5mg/ml羟基二氧化硅磁珠，震荡混匀后，静置2min，使磁珠和裂解出的核酸充分结合；步骤6：使用磁铁固定磁珠，分离混合物中含有杂质的上清液；步骤7：加入200μl的70%乙醇溶液，快速吹打混匀，以除去磁珠和管壁上黏附的除核酸外的杂质；步骤8：使用磁铁固定磁珠，分离中含有杂质上清液；步骤9：加入200μl的70%乙醇溶液，再次快速吹打混匀，进行磁珠和管壁的再次清洗；步骤10：使用磁铁固定磁珠，再次去除含有杂质上清液，随后加入50μl的te缓冲液（ph 8.0），轻轻吹打混匀，在55℃水浴条件下进行核酸洗脱，10min后，使用磁铁固定磁珠，将含核酸的上清液转移到新的ep管进行保存。

技术总结
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种细菌核酸释放剂结合磁珠进行酸提取的方法。本发明可实现革兰氏阳性菌与阴性菌的核酸快速提取，该法与溶菌酶进行核酸提取法相比大幅度降低核酸提取时间，此外磁珠上核酸在洗脱下来后，可直接进行下游的PCR扩增、检测、分子杂交等实验，特别适用于传染性疾病的快速检测和爆发重大疫情的现场检测。和爆发重大疫情的现场检测。和爆发重大疫情的现场检测。


技术研发人员：王庆伟 宋凤阁 万逸 杨治庆 肖云祥 申逸
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：2022.01.26
技术公布日：2023/8/5