一种抗体偶联物的制备方法与流程

1.本公开属于抗体类放射性药物领域，具体涉及一种微克级的抗体偶联物的制备方法。


背景技术：

2.抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，adc)是通过偶联剂把单克隆抗体(mab)和药物连接而形成的。通过利用mab准确识别诸如病灶组织的肿瘤细胞上特异性表达的抗原，adc能够高选择性的在病灶组织内释放细胞毒药物，极大地提高药效并减少毒副作用，已经成为抗癌等领域的研究热点。放射性标记抗体药物是把用于临床诊断或治疗的放射性核素标记的化合物与抗体偶联形成的adc，在肿瘤诊疗和炎症组织显像诊断等领域中有广泛的应用前景。
3.maria jwd vosjan等报道了利用去铁氧胺(deferoxamine，dfo)的异硫氰基衍生物，把锆-89(
89
zr)与抗体相结合，制备一类放射性标记抗体药物的方法(vosjan mj,et al.,conjugation and radiolabeling of monoclonal antibodies with zirconium-89for pet imaging using the bifunctional chelate p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine.nat protoc.2010apr；5(4):739-43)。近年来在该类药物的研究中，抗体的用量大，都在毫克级水平，相应的分离纯化方法精度低，导致分离损失大和研发成本高。
4.因此，有必要提供一种改进的成本更低的抗体偶联物的制备方法。


技术实现要素：

5.鉴于上述问题，本公开的目的在于提供一种成本更低的抗体偶联物的制备方法，以促进靶向药物的筛选、研究和应用。
6.本公开提供了一种抗体偶联物的制备方法，其中所述制备方法是微克级的微量制备方法，包括在总体积不高于500μl的反应溶液中使小于等于250μg的抗体与偶联剂进行偶联反应，其中所述反应溶液中所述抗体的浓度为0.2～0.8mg/ml，所述偶联剂的用量为以每分子所述抗体预期结合所述偶联剂分子数量的化学计量比的1～3.5倍；以及反应结束后，将全部反应溶液用容量为所述反应溶液体积1～2倍的凝胶色谱柱进行纯化，其中以淋洗液进行洗脱并收集所述反应溶液体积1.5～2.5倍的目标洗脱液，从而获得所述抗体偶联物纯化溶液。
7.根据本公开的一种实施方式，所述反应溶液的总体积为80～200μl，优选为100～150μl。
8.根据本公开的一种实施方式，所述抗体的用量为40～100μg。所述偶联剂的用量为以每分子所述抗体预期结合所述偶联剂分子数量的化学计量比的1.2～3倍。
9.优选地，所述抗体的用量为50～75μg。
10.根据本公开的一种实施方式，所述凝胶色谱柱的容量为所述反应溶液体积的2倍，且收集所述反应溶液体积2倍的所述目标洗脱液。
11.根据本公开的一种实施方式，所述反应溶液中所述抗体的浓度为0.3～0.6mg/ml。
12.根据本公开的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体。例如帕尼单抗、赛妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、抗骨桥蛋白抗体、曲妥珠单抗、尼妥珠单抗、英夫利西单抗中的一种。
13.根据本公开的一种实施方式，所述偶联剂为去铁氧胺类化合物的异硫腈基衍生物中的一种。
14.优选地，所述偶联剂为如下化合物中的一种：
[0015][0016]
根据本公开的一种实施方式，所述偶联反应的温度为30～45℃，时间为50～70min。
[0017]
本发明在总体积不高于500μl的反应溶液中使小于等于250μg的抗体与偶联剂进行偶联反应，通过控制反应溶液中抗体的浓度为0.2～0.8mg/ml，偶联剂的用量为以每分子所述抗体预期结合偶联剂分子数量的化学计量比的1～3.5倍，能够确保反应的效率。并且本发明在反应结束后，通过将全部反应溶液用容量为所述反应溶液体积1～2倍的凝胶色谱柱进行纯化，其中以淋洗液进行洗脱并收集所述反应溶液体积1.5～2.5倍的目标洗脱液，使分离纯化的精度足够高，减少了分离纯化过程中的损失，从而获得含有微克级的抗体偶联物的纯化溶液。
[0018]
本公开的抗体偶联物的制备方法极大降低了反应所需抗体的量，可有效节约成本，推动放射性标记药物的筛选和研发。
附图说明
[0019]
图1为实施例1中dfo-bz-ncs-bsa的质谱图。
[0020]
图2为实施例1中bsa的质谱图。
具体实施方式
[0021]
下面将结合本公开实施方式及附图，对本公开实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本公开的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本公开中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本技术保护的范围。
[0022]
如上所述，本公开意在提供一种微克级的抗体偶联物的微量制备方法。具体地，控制反应溶液的总体积不高于500μl，反应溶液中所述抗体的浓度为0.2～0.8mg/ml，以及偶联剂的用量为以每分子所述抗体预期结合偶联剂分子数量的化学计量比的1～3.5倍。当反应溶液中抗体的量小于等于250μg时，本公开的方案可以确保抗体与偶联剂的偶联反应的效率。在反应结束后，通过用容量为所述反应溶液体积1～2倍的凝胶色谱柱纯化全部反应溶液，收集所述反应溶液体积1.5～2.5倍的目标洗脱液，确保了分离纯化的精度，减少了分离纯化过程中的损失。
[0023]
近年来，放射性核素
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zr因其优良的核素性质逐渐成为核医学研究领域的热点核素之一。业内许多科学家正在寻找合适的生物活性因子用
89
zr标记，以研发用于正电子显像(pet)的新型放射性药物，而抗体具有“高度特异性”的生物活性可作为载体，将其携带的放射性核素等定向于疾病靶点，发挥低毒高效的杀伤作用，因而
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zr标记抗体药物成为研究热点。
[0024]
抗体不能直接与以金属离子形式存在的核素
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zr联接，必须先与合适的双功能偶联剂(其既可以与金属离子结合，也可以与蛋白类结合)结合，形成抗体偶联物，再通过偶联剂去螯合相应的金属离子。这类双功能偶联剂的性质直接决定标记结果，pcta、nota、dota和dtpa等都曾是用于研究的偶联剂，但因其标记率低和不稳定等缺点已很少使用。目前最常见的偶联剂是含有去铁氧胺(dfo)类的化合物，而近年来广泛使用的
89
zr偶联剂是dfo类化合物的异硫腈基(scn)衍生物。本公开的偶联剂为对异硫氰基苄基去铁氧胺类化合物，简写dfo-bz-ncs，优选为如下化合物中的一种：
[0025][0026]
其中化合物1是优选的。
[0027]
89
zr标记抗体药物的研发的第一步是通过抗体与偶联剂的偶联反应，制备抗体偶联物。当偶联剂是dfo-bz-ncs时，该偶联反应的原理是抗体上的氨基与dfo-bz-ncs的异硫腈基发生反应，如下列反应式所示，
[0028][0029]
该反应通常抗体的用量在毫克(mg)级水平，反应浓度在mg/ml水平。比如上述vosjan的方案中，反应溶液的体积大约1ml，其中抗体的质量为2～10mg(13.2～66nmol)，偶联剂浓度为2～10mmol/ml。反应在ph 8.9～9.1的弱碱性环境中进行，反应结束后通过传统的pd-10柱分离纯化，一次可分离2.5ml的产物溶液。使用不同抗体制备抗体偶联物或抗体偶联药物的研究众多，然而如上所述，在制备抗体偶联物时抗体的用量最小都在毫克量级。例如有报道，使用帕尼单抗(panitumumab)的用量为5mg、浓度为5mg/ml，使用赛妥珠单抗(certolizumab pegol)的用量为1～6mg，使用西妥昔单抗和利妥昔单抗(cetuximab/rituximab)用量在2-5mg、浓度为1.5～3.8mg/ml，使用曲妥珠单抗(trastuzumab)的用量为
19.5mg，使用尼妥珠单抗(nimotuzumab)的浓度为5～10mg/ml，使用英夫利西单抗(infliximab)的浓度为2mg/ml等。尚未有在更小的体系中进行微克级偶联反应的成功报道。
[0030]
单克隆抗体制备程序复杂，制备量低，很多新抗体的实验室制备量在μg量级。而单克隆抗体特异性强，一些研究中，药物浓度无需达到mg/ml的量级，如分析研究、生物活性研究等仅需要μg～ng级水平。按照现有方案，直接按比例缩小抗体的用量，由于反应过于微量难以精确操作，容易导致污染和损失。
[0031]
发明人发现，通过同时降低反应溶液的体积和其中抗体的浓度，但确保该抗体浓度在0.2～0.8mg/ml范围内，所述偶联剂的用量为以每分子所述抗体预期结合偶联剂分子数量的化学计量比的1～3.5倍，可以在总体积不高于500μl的反应溶液中使用小于等于250μg的抗体与偶联剂进行偶联反应，从而使抗体的用量大幅降低的情况下，一方面可以确保体积足以进行微量操作，另一方面意外地确保了偶联反应的收率。
[0032]
根据本公开，反应溶液的总体积不低于50μl。优选的，反应溶液的总体积为80～200μl，更优选的为100～150μl。可列举地，反应溶液的总体积可为80μl、100μl、120μl、140μl、160μl、180μl等，或者任意两个数值之间的范围内容。
[0033]
根据本公开，抗体的用量不低于30μg。抗体的用量优选地为40～100μg，优选为50～75μg。可列举地，抗体的用量可为40μg、50μg、60μg、70μg、80μg等，或者任意两个数值之间的范围内容。所述反应溶液中所述抗体的浓度优选为0.3～0.6mg/ml。可列举地，抗体的浓度可为0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml等，或者任意两个数值之间的范围内容。如果抗体的用量过低，相应的反应溶液的体积也过低，无法确保能够微量操作。当抗体用量一定时，如果反应溶液的体积过大，抗体的浓度过低，则无法确保偶联反应的效率。
[0034]
为了提高抗体偶联药物的药效，一分子抗体通常结合多个分子的偶联剂，从而提高单分子药物的效价。本公开通过控制所述偶联剂的用量为以每分子所述抗体预期结合偶联剂分子数量的化学计量比的1～3.5倍，优选1.2～3倍，以确保反应效率。可列举的所述化学计量比的倍数，如1.5、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3倍等。如果偶联剂用量少，则偶联反应的效率太低。如果偶联剂用量太多，过度的偶联可能影响抗体的活性，而且副反应可能导致分离纯化的难度增大。
[0035]
偶联反应的条件与常规体系中偶联反应的条件相同，本公开对此没有特别限制。本领域技术人员可根据具体的抗体和偶联剂的种类选择合适的反应条件。举例来说，所述偶联反应的温度可为30～45℃，时间可为50～70min。
[0036]
本公开对抗体的种类也没有特别限制。优选地，所述抗体可为单克隆抗体，可列举地，抗体例如为帕尼单抗、赛妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、抗骨桥蛋白抗体、曲妥珠单抗、尼妥珠单抗、英夫利西单抗中的一种等，但不限于此。
[0037]
反应结束后，将全部反应溶液用容量为所述反应溶液1～2倍的凝胶色谱柱进行纯化。优选的用容量为所述反应溶液2倍的凝胶色谱柱。如果凝胶色谱柱的容量过大，会造成纯化过程中的抗体偶联物的损失，且使收集到的抗体偶联物被过度的稀释。以淋洗液进行洗脱并收集所述反应溶液1.5～2.5倍的目标洗脱液，优选的收集所述反应溶液2倍的目标洗脱液，从而获得所述抗体偶联物纯化溶液。如果收集的目标洗脱液过少，虽然可能提高收集到的抗体偶联物的纯度，但会造成纯化过程中的抗体偶联物的损失。如果收集的目标洗
脱液过多，则会降低收集到的抗体偶联物的纯度。
[0038]
可选地，通过低温超滤法对上述溶液进行进一步的洗涤和浓缩，除去小分子化合物。
[0039]
上述方法制备的微克级的抗体偶联物可以进一步用于与
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zr离子螯合。该步骤的反应条件与常规体系中螯合反应的条件相同，本公开对此没有特别限制。举例来说，将含
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zr离子与抗体偶联物的反应溶液的ph值控制在6.8～7.2范围内，在室温下孵育1小时。随后用凝胶色谱柱纯化，制得
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zr标记抗体药物。
[0040]
下面结合具体实施例对本公开做进一步说明。实施例1选取常见的牛血清白蛋白按本法进行偶联，以验证该方法的可行性。实施例2选取单克隆抗体按本法进行偶联。
[0041]
实施例
[0042]
实验材料：
[0043]
偶联剂：dfo-bz-ncs(也称p-scn-bn-deferoxamine，50mg，mw752.9g/mol，macrocyclics)。
[0044]
蛋白：牛血清蛋白bsa(mw约67kd)、抗骨桥蛋白抗体antibody x(50μg，mw约75kd，kerafast)。
[0045]
凝胶色谱柱：pd-10multitrap g-25(170-130μl，cytiva)。
[0046]
反应容器：含200μl配套内插管的2ml hplc用的样品瓶。
[0047]
其它化学试剂，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；实验用水均为纯净水。
[0048]
通过布鲁克autoflex max maldi-tof-ms作质谱分析。
[0049]
实施例1.dfo-bz-ncs-bsa的制备
[0050]
1、偶联反应
[0051]
称取1.000mg bsa，溶入无菌的0.1m、ph 9.0的na2co3缓冲液2ml，手动轻摇混匀，室温放置至完全溶解，配成成0.5mg/ml(相当于约7.5nmol/ml)的bsa溶液。因为bsa已实现廉价量产，为了称量更准确，在bsa溶液的配制的时候使用了1mg，在后续步骤中，bsa溶液的实际使用量为约100μl，即50μg。
[0052]
准确称取-20℃保存的2.870mg的dfo-bz-ncs(mw 752.94)偶联剂，溶入2.87ml dmso，振摇溶解，配成1mg/ml(1.3μmol/ml)dfo-bz-ncs溶液，用0.45μm尼龙膜过滤，在放置于4℃冰箱中备用。
[0053]
取含200μl配套内插管的2ml hplc用的样品瓶，用eppendorf移液器向上述内插管中移入bsa溶液97.4μl，然后加入2.6μl dfo-bz-ncs溶液，其中预期每个bsa和3个偶联剂分子偶联，偶联剂用量为预期结合量的1.5倍。在37℃下孵育1小时，其间用移液器轻轻吸入吸出搅拌几次。
[0054]
2、分离纯化
[0055]
以预处理过的pd-10multitrap g-25柱为固相柱，以pbs缓冲液(ph7.4)为淋洗液平衡柱子。待淋洗液放完后，用eppendorf移液器一次性将100μl的反应混合液全部移至的柱床中央，并且马上用30μl na2co3缓冲液洗涤反应内插管，迅速上样到凝胶过滤柱，弃去最初约130μl洗脱液，然后继续用200μl淋洗液洗脱，并收集200μl的目标洗脱液，即获得纯化的bsa-dfo-bz-ncs溶液。后面继续洗脱下来的是小分子杂质，可以弃去。
[0056]
将上述bsa-dfo-bz-ncs溶液移入millipore超滤管(分子量截留量为10kd，体积
0.5ml)，加入同体积(200μl)的甲醇，用封口膜封口，离心15min(4℃，4000cpm，2810g)，弃去含有磷酸根离子的分离液，再加入甲醇重复洗涤离心三次，超滤管内剩余200μl溶液就是浓缩的dfo-bz-ncs-bsa。
[0057]
3、dfo-bz-ncs-bsa的分析检验
[0058]
将上述浓缩的dfo-bz-ncs-bsa用水稀释到400μl，混合摇匀后取1～2μl作质谱分析，结果如图1所示。
[0059]
作无偶联剂的空白bsa的对照实验，即按照上述相同步骤进行实验，但反应过程以水代替dfo-bz-ncs溶液，结果如图2所示。
[0060]
由图2可见，纯化前bsa中除了分子量为67.32kd的bsa，还包括多个杂质。由图1可见，纯化后的dfo-bz-ncs-bsa溶液中，只有一个分子量34.25kd的杂质，dfo-bz-ncs-bsa分子量为69.51kd，根据dfo-bz-ncs的分子量752.9，可算出平均每个bsa分子结合了2.91个dfo-bz-ncs分子，和预期一致。
[0061]
实施例2.dfo-bz-ncs-antibody x的制备
[0062]
取一支-20℃保存的50μg的antibody x抗体，即约0.67
×
10-9
mol。在-4℃冰箱中静置1小时后，加无菌的0.1m ph 9.5的na2co3缓冲液120μl，手动轻摇混匀，室温放置至完全溶解，配成抗体溶液，浓度约为0.42mg/ml，即约5.58
×
10-9
mol/ml。配制dfo-bz-ncs的dmso溶液，浓度为1.7mg/ml，即2.26
×
10-6
mol/ml。其中预期每个antibody x抗体和1.5个偶联剂偶联，偶联剂用量为预期结合量的2.8倍。用移液器移取1μl dfo-bz-ncs溶液，加入到99μlantibody x抗体溶液中，混匀，37℃孵育1小时。
[0063]
分离纯化的过程同实施例1相同，离心后获得230μl样品。质谱分析时不用水稀释样品，直接取1～2μl进样，可以检测到一个主要的信号峰，对应dfo-bz-ncs-antibody x，分子量为76.62kd。
[0064]
作无偶联剂的空白的antibody x对照实验，即按照上述相同步骤进行实验，但反应过程以水代替dfo-bz-ncs溶液，空白偶联反应后antibody x样品的分子量为75.54kd。
[0065]
对比反应前后的样品分子量可知，平均每个偶联抗体的分子量增加1.08kd，根据偶联dfo-bz-ncs的分子量752.9，可算出平均每个antibody x分子结合了1.43个dfo-bz-ncs分子，和预期一致，满足进行进一步的核素偶联实验的要求。
[0066]
相比现有技术中2～10mg的抗体的使用量，本实施例中antibody x仅为0.05mg，降低了超过40倍，同时确保了反应效率；相比现有技术，将一次最小分离纯化的量从2.5ml减少到100μl，降低了超过20倍。
[0067]
以上所述仅为本公开的一些具体实施例，意在说明本发明，并不用来限制本技术的要求保护的范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本技术说明书及附图内容所作的修改、替代，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本技术的要求保护的范围内。

技术特征：
1.一种抗体偶联物的制备方法，其中所述制备方法是微克级的微量制备方法，包括以下步骤：在总体积不高于500μl的反应溶液中使小于等于250μg的抗体与偶联剂进行偶联反应，其中所述反应溶液中所述抗体的浓度为0.2～0.8mg/ml，所述偶联剂的用量为以每分子所述抗体预期结合所述偶联剂分子数量的化学计量比的1～3.5倍；以及反应结束后，将全部反应溶液用容量为所述反应溶液体积1～2倍的凝胶色谱柱进行纯化，其中以淋洗液进行洗脱并收集所述反应溶液体积1.5～2.5倍的目标洗脱液，从而获得所述抗体偶联物纯化溶液。2.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述反应溶液的总体积为80～200μl，优选为100～150μl。3.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述抗体的用量为40～100μg，所述偶联剂的用量为以每分子所述抗体预期结合所述偶联剂分子数量的化学计量比的1.2～3倍。4.根据权利要求3所述的制备方法，其中所述抗体的用量为50～75μg。5.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述凝胶色谱柱的容量为所述反应溶液体积的2倍，且收集所述反应溶液体积2倍的所述目标洗脱液。6.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述反应溶液中所述抗体的浓度为0.3～0.6mg/ml。7.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述抗体为单克隆抗体。8.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述偶联剂为去铁氧胺类化合物的异硫腈基衍生物中的一种。9.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述偶联剂为如下化合物中的一种：
10.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述偶联反应的温度为30～45℃，时间为50～70min。

技术总结
本公开提供了一种抗体偶联物的制备方法，包括在总体积不高于500μL的反应溶液中使小于等于250μg的抗体与偶联剂进行偶联反应，其中所述反应溶液中所述抗体的浓度为0.2～0.8mg/mL，所述偶联剂的用量为以每分子所述抗体预期结合所述偶联剂分子数量的化学计量比的1～3.5倍；以及反应结束后，将全部反应溶液用容量为所述反应溶液1～2倍的凝胶色谱柱进行纯化，其中以淋洗液进行洗脱并收集所述反应溶液1.5～2.5倍的目标洗脱液，从而获得所述抗体偶联物纯化溶液。所述制备方法是微克级的微量制备方法。量制备方法。


技术研发人员：刘子华 李凤林 樊彩云 解清华 贾静
受保护的技术使用者：中国原子能科学研究院
技术研发日：2023.04.11
技术公布日：2023/8/5