一种解磷菌剂及其制备和应用的制作方法

1.本发明属于微生物制剂技术领域。更具体地，涉及一种解磷菌剂及其制备和应用。


背景技术：

2.磷元素是植物生长必须的大量元素，土壤是植物获取磷元素的唯一来源，只有可溶性的磷才能被植物直接吸收和利用。实际生产过程中，土壤中有相当一部分的磷与ca
2+
、al
3+
、fe
3+
等金属离子形成多种形态的ca-p、al-p和fe-p等难溶物，无法被植物直接利用，即土壤磷元素成为了农林生产过程中的重要限制性因子，限制了土壤磷素的有效性和磷肥的肥效，进而制约了园林绿地的景观效果和生态价值体现。因此，为克服该问题，目前的农林生产过程中通常会使用大量的磷肥，但这不仅是一种资源浪费，更会带来土壤板结与水体富营养化等环境问题，不是一种良策。
3.解磷菌能分泌小分子有机酸，通过降低土壤ph、螯合金属离子以及离子交换等方式将土壤中难溶的磷酸盐释放出来，并被地表植物根系重新吸收和利用，因此，解磷菌逐渐成为溶解土壤难溶磷源的热门工具之一，如现有技术提供了具有高效解磷能力的根瘤菌等，但目前尚未见将青霉菌与黑曲霉菌共用于解磷的相关报道，更未见对二者共同制备的解磷菌剂的固体扩繁培养基进行特定选择的方案。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术的不足，旨在提供一种解磷菌剂，能高效溶解土壤的难溶磷源，显著提升了土壤中磷素的利用率，缓解了磷肥过量使用带来的资源浪费和环境污染等问题。
5.本发明的第一目的是提供一种解磷菌剂的制备方法。
6.本发明的第二目的是提供上述方法制备得到的解磷菌剂。
7.本发明的第三目的是提供上述解磷菌剂在提升土壤磷素利用率中的应用。
8.本发明的第四目的是提供上述解磷菌剂的保存方法。
9.本发明的第五目的是提供一种固体扩繁培养基。
10.本发明的第六目的是提供上述固体扩繁培养基在制备解磷菌剂中的应用。
11.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
12.本发明提供了一种解磷菌剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
13.s1.将青霉菌接种于pda固体培养基中，培养至孢子覆盖培养基表面，冲洗后收集青霉菌孢子悬液；再接种于固体扩繁培养基中，培养至孢子覆盖培养基表面后，收集青霉菌孢子粉末；
14.s2.将黑曲霉菌接种于pda固体培养基中，培养至孢子覆盖培养基表面，冲洗后收集黑曲霉菌孢子悬液；再接种于固体扩繁培养基中，培养至孢子覆盖培养基表面后，收集黑曲霉菌孢子粉末；
15.s3.将s1青霉菌孢子粉末与s2黑曲霉菌孢子粉末混匀，即得到所述解磷菌剂；
16.其中，s1与s2不限先后顺序；
17.所述固体扩繁培养基包含质量比为19.5～20.5：9.5～10.5：4.5～5.5：14.5～15.5的玉米渣、稻壳、麦麸、水。
18.术语“s1与s2不限先后顺序”表示可先进行s1，也可先进行s2，也可同时进行s1和s2。
19.优选地，s1和s2中，所述培养的温度为25～30℃，最优选为28℃。
20.优选地，s1和s2中，所述冲洗为用水冲洗。
21.优选地，s1和s2中，所述冲洗后还去除菌丝体，如通过过滤去除菌丝体。
22.优选地，s1和s2中，所述孢子悬液先稀释，再接种于固体扩繁培养基中。
23.进一步优选地，所述稀释为用水稀释至800～1200cfu/ml，最优选为1000cfu/ml。
24.优选地，s1和s2中，所述固体扩繁培养基还进行灭菌，如在110～130℃下灭菌25～35min。
25.优选地，s1中，所述青霉菌孢子悬液与固体扩繁培养基的用量比为800～1200cfu/g，最优选为1000cfu/g。
26.优选地，s2中，所述黑曲霉菌孢子悬液与固体扩繁培养基的用量比为800～1200cfu/g，最优选为1000cfu/g。
27.优选地，s3中，所述s1青霉菌孢子粉末与s2黑曲霉菌孢子粉末的质量比为0.8～1.2：0.8～1.2，最优选为1：1。
28.优选地，所述玉米渣、稻壳、麦麸、水的质量比为20：10：5：15。
29.优选地，所述固体扩繁培养基还包含琼脂。
30.进一步优选地，将处于55～65℃的琼脂溶液淋在固体扩繁培养基表面，形成厚度2～3mm的附着层。
31.琼脂是常见的实验用培养基配方，通常是与培养基的各组分预混后，依次进行灭菌、冷却，进而凝固形成平面，而本发明采用浇淋的方式能使琼脂立即附着于固体扩繁培养基表面，而非形成平面，这种方式添加的琼脂能显著增强固体扩繁培养基的保水性能，有利于基内菌丝在固体扩繁培养基中的延伸生长；且本发明将琼脂附着于形状不规则的固体扩繁培养基表面，显著增加了培养基的比表面积，更有利于产生大量孢子。
32.进一步优选地，所述琼脂溶液中，琼脂的浓度为1.5％(w/v)～2.0％(w/v)，最优选为2％(w/v)。
33.进一步优选地，所述琼脂溶液还进行灭菌，如在110～130℃下灭菌15～25min。
34.进一步优选地，所述琼脂溶液淋在固体扩繁培养基表面的速度为20～40ml/min，使琼脂快速冷却，且均匀附着于固体扩繁培养基表面，而非产生平面。
35.进一步优选地，所述琼脂溶液的体积为固体扩繁培养基体积的1/3～1/2。
36.优选地，所述解磷菌剂还覆盖有有机覆盖物。
37.进一步优选地，所述有机覆盖物为树枝粉碎物，如烘干并粉碎至粒径1～3cm的松树皮粉碎物。
38.在上述解磷菌剂中，青霉菌孢子粉末与黑曲霉菌孢子粉末在溶解土壤难溶磷源等方面发挥了协同增效的作用，显著提升了土壤中磷素的利用率，缓解了磷肥使用带来的环境问题，能有效促进植物生长，适用于制备菌肥。因此，上述方法制备得到的解磷菌剂、上述
解磷菌剂在提升土壤磷素利用率中的应用均应在本发明的保护范围之内。
39.优选地，所述解磷菌剂的使用浓度为105～107cfu/ml，最优选为106cfu/ml。
40.此外，本发明还提供了上述解磷菌剂的保存方法，将所述解磷菌剂干燥至含水量9％～39％，于3～5℃下保存。最优选为干燥至含水量13％，于4℃下保存。
41.优选地，所述干燥的温度为35～40℃。
42.本发明特定选择了固体扩繁培养基的成分，精当控制了每种成分的用量配比，将其用于培养黑曲霉菌和青霉菌，可显著提升这两种菌的产孢能力，可快速得到大量适用于制备解磷菌剂的孢子材料。因此，一种包含质量比为19.5～20.5：9.5～10.5：4.5～5.5：14.5～15.5的玉米渣、稻壳、麦麸、水的固体扩繁培养基，以及上述固体扩繁培养基在制备解磷菌剂中的应用均应在本发明的保护范围之内。
43.优选地，所述青霉菌(penicillium brocae)为菌株s523，于2023年03月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.40522，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
44.优选地，所述黑曲霉(aspergillus niger)为菌株s626，于2023年03月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.40520，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
45.本发明具有以下有益效果：
46.1.在本发明的解磷菌剂中，青霉菌孢子粉末与黑曲霉菌孢子粉末在溶解土壤难溶磷源等方面发挥了协同增效的作用，显著提升了土壤中磷素的利用率，缓解了磷肥使用带来的环境问题，有效促进了植物的生长，适用于制备菌肥。
47.2.本发明选择了特定成分，精当控制了每种成分的用量配比，制得的固体扩繁培养基以农产品加工边角料为主料，成本低廉、保水能力好、比表面积大，且将该培养基用于培养黑曲霉菌和青霉菌，可显著提升这两种菌的产孢能力，短时间即可得到大量适用于制备解磷菌剂的孢子材料。
48.3.本发明的解磷菌剂由于以处于休眠状态、对环境耐受性较强的真菌孢子为主要成分，因此具有极佳的稳定性，适于长期保存。
49.4.本发明的解磷菌剂相较于传统化学肥料，具有绿色、环保、持效性强的优点，对环境无污染、无残留。
附图说明
50.图1a为菌株s523的菌落及溶磷圈形成情况，图1b为菌株s626的菌落及溶磷圈形成情况。
51.图2为菌株s523的系统发育树。
52.图3为菌株s626的系统发育树。
53.图4为菌株s523和菌株s626在t8和t10培养基上的产孢情况。
54.图5为不同烘干时长对解磷菌剂含水量的影响结果。
55.图6为不同保藏时间对解磷菌剂孢子萌发率的影响结果。
56.图7为矮牵牛的干重统计结果。
具体实施方式
57.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
58.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
59.实施例1解磷菌p.brocae和a.niger的分离、鉴定与保藏
60.(1)试验材料
61.广东省广州市郊区农田土壤和林地红壤，pvk培养基(葡萄糖10g，(nh4)2so40.5g，ca3(po4)
2 5.0g，nacl 0.2g，kcl 0.2g，mgso4·
7h2o 0.1g，酵母提取物0.5g，mnso4·
h2o 0.002g，feso4·
7h2o 0.002g，加蒸馏水至1000ml，固体培养基另添加2％(w/v)琼脂)。
62.(2)真菌分离
63.分别采集广东省广州市郊区10g农田土壤和10g林地红壤，进行后续处理：加100ml无菌水充分振荡混匀后得到土壤悬液，将土壤悬液按体积比梯度稀释至10-4
g/ml，取100μl涂布到pvk固体平板上(含5g/l磷酸钙、50μg/l氯霉素和100μg/l链霉素)，28℃连续培养5天后观察平板上菌落及溶磷圈形成情况，挑选出溶磷圈半径/菌落半径最大的真菌菌株，在pvk平板上连续纯化培养3代，于4℃冰箱保存备用。
64.平板上菌落及溶磷圈形成情况如图1所示，其中，图1a为从农田土壤中分离的解磷真菌(命名为s523)的菌落及溶磷圈形成情况，图1b为从林地红壤中分离的解磷真菌(命名为s626)的菌落及溶磷圈形成情况。可见，两株菌的溶磷能力均较强。
65.(3)真菌鉴定
66.分别取3ml的s523液体pda培养基(od600为0.8～1.0)和3ml的s626液体pda培养基(od600为0.8～1.0)，进行后续处理：离心收集菌丝(8000rpm，10min)，清水洗涤3次后，提取真菌dna(omega fungi dna kit)，利用its4和its5对真菌its片段进行扩增，并回收pcr产物进行测序分析，再与genbank中真菌的its1-5.8s-its2进行同源性比较，构建菌系统发育树。
67.分析结果如图2和3所示，其中，图2为菌株s523的系统发育树，图3为菌株s626的系统发育树。可见，菌株s523为青霉菌(penicillium brocae)(序列相似性≥97.4％)，菌株s626为黑曲霉(aspergillus niger)(序列相似性≥97.7％)。
68.(4)真菌解磷能力测定
69.分别挑取菌株s523单菌落和菌株s626单菌落，再分别接种到以磷酸钙5g/l、磷酸铝(5g/l)和磷酸铁(5g/l)为唯一磷源的3ml的pvk液体培养基中，28℃培养3天后取1ml接种到100ml pvk液体培养基中，28℃培养5天后利用磷钼蓝比色法检测上清中有效磷的含量，计算菌株的解磷量。
70.结果如表1所示，可见，菌株s523和菌株s626均可有效溶解磷酸钙、磷酸铝和磷酸铁，但s626对磷酸铁和磷酸铝的溶解具有偏好性，s523则可更好地溶解磷酸钙。
71.表1菌株s523和菌株s626的解磷能力
[0072][0073]
(5)真菌保藏
[0074]
青霉菌(penicillium brocae)s523菌株于2023年03月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.40522，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0075]
黑曲霉(aspergillus niger)s626菌株于2023年03月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.40520，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0076]
实施例2固体扩繁培养基配方筛选
[0077]
(1)试验材料
[0078]
解磷黑曲霉菌(菌株s626)、解磷青霉菌(菌株s523)、甘蔗渣、稻壳、花生麸、玉米渣和麦麸。
[0079]
(2)试验方法
[0080]
将表1中质量比为1：1：1的各原料混匀，再加水(水在培养基中的用量为30wt％)，得到配方1～10的固体扩繁培养基，每个配方含5个重复，以青霉菌和黑曲霉菌的产孢能力为指标，筛选产孢能力最强的固体扩繁培养基配方。
[0081]
首先，将解磷青霉菌和解磷黑曲霉菌分别在pda固体培养基表面进行z形划线，28℃培养至孢子覆盖培养基表面，利用0.1％(v/v)的吐温80溶液将孢子从固体平板上冲洗下来，收集孢子悬液，并利用无菌双层纱布过滤孢子悬液以除去掺杂的菌丝体，按照103cfu/g培养基的用量分别接种到上述配方1～10的固体扩繁培养基(在120℃下灭菌30min)中(使菌株与固体扩繁培养基的用量比为1000cfu：1g)，置于28℃培养箱中连续培养至孢子覆盖培养基表面时，计算产孢能力，即取均质化的长有孢子的固体扩繁培养基1g，加入100ml 0.02％(v/v)的吐温溶液，磁力搅拌器搅拌10min，用无菌双层纱布过滤除去培养基和菌丝体等杂质，用无菌水按照10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
、10-8
以及10-9
进行梯度稀释并取100μl涂布到pda平板上，将平板置于28℃培养箱中培养至菌落产生，统计菌落数量并换算成单位质量固体扩繁培养基中包含的孢子数量(cfu/g)，根据统计结果，从中选出产孢能力最强的培养基配方。
[0082]
表1固体扩繁培养基配方表
[0083][0084]
(3)试验结果与分析
[0085]
解磷青霉菌和解磷黑曲霉菌在配方1～10的固体扩繁培养基上的产孢能力如表2所示。
[0086]
表2不同固体扩繁培养基上的产孢能力
[0087][0088]
由表1可知：
[0089]
①
青霉菌在配方1上的产孢量在105cfu/g数量级，在配方3、4、5、8、9上的产孢量为106cfu/g数量级，在配方2、6上的产孢量为107cfu/g数量级，在配方7和10上的产孢量为108cfu/g数量级；
[0090]
②
黑曲霉菌在配方1、2、4、5、8、9、10上的产孢量为107cfu/g数量级，在配方3、6、7上的产孢量在108cfu/g数量级。
[0091]
可见，将不同组分制得的固体扩繁培养基用于培养解磷黑曲霉菌和解磷青霉菌，对菌株产孢能力的影响程度具有显著差异，且将配方7的固体扩繁培养基用于培养解磷黑曲霉菌和解磷青霉菌，可使这两种解磷菌的产孢子量同时达到108cfu/g数量级，效果显著优于配方1～6和配方8～9，因此，本发明将配方7(即稻壳、麦麸、玉米渣和水)的固体扩繁培养基用于培养黑曲霉菌和青霉菌，可显著提升这两种菌的产孢能力。
[0092]
实施例3固体扩繁培养基配比优化
[0093]
(1)试验材料
[0094]
解磷黑曲霉菌(菌株s626)、解磷青霉菌(菌株s523)、稻壳、麦麸、玉米渣和琼脂。
[0095]
(2)试验方法
[0096]
将表3中t1～t6组各质量比的玉米渣、稻壳、麦麸混匀，再加水(水在培养基中的用量为30wt％)，得到配方t1～t6的固体扩繁培养基。此外，为进一步提升固体扩繁培养基的保水能力，锁住培养基中的流动水分，本实施例还分别在t1～t6的固体扩繁培养基配方基础上加入占固体扩繁培养基1/3体积的2％(w/v)琼脂溶液，得到配方t7～t12；其中，加入2％(w/v)琼脂溶液的方法为：将2％(w/v)琼脂溶液高温灭菌(120℃，20min)后，冷却至60℃，再均匀浇淋于冷却至25℃的固体扩繁培养基表面(琼脂浇淋速度为20～40ml/min)，并在表面形成厚度2～3mm的附着层。
[0097]
每个配方含3个重复，按照实施例2的方法测定青霉菌和黑曲霉菌的产孢能力，筛选出产孢能力最强的固体扩繁培养基配方，拍照，结果如图4所示。
[0098]
表3固体扩繁培养基配方表
[0099][0100]
(3)试验结果和分析
[0101]
解磷青霉菌和解磷黑曲霉菌在配方t1～t12的固体扩繁培养基上的产孢能力如表4所示。
[0102]
表4不同固体扩繁培养基上的产孢能力
[0103]
[0104][0105]
由表4可知，解磷青霉菌和解磷黑曲霉菌在t8和t10培养基中的产孢能力显著高于其它处理组，且添加琼脂让解磷青霉菌的产孢能力提升了一个数量级(相较于实施例2的最优结果，从108cfu/g提升到109cfu/g)。
[0106]
解磷青霉菌和解磷黑曲霉菌在t8和t10培养基上的产孢情况如图4所示。可见，孢子生长区域基本覆盖了整个固体扩繁培养基的表面和间隙，表明本发明的固体扩繁培养基配方十分适用于解磷青霉菌和解磷黑曲霉菌产孢。另外，考虑到麦麸的生产成本和价格高于玉米渣，选择t8培养基作为以下实施例所用的扩繁培养基。
[0107]
实施例4解磷菌剂的保藏时间优化
[0108]
(1)试验材料
[0109]
实施例3中t8培养基培养得到的解磷青霉菌孢子粉末和解磷黑曲霉菌孢子粉末、37℃烘箱和pda(马铃薯葡萄糖琼脂)平板。
[0110]
(2)试验方法
[0111]
将青霉菌孢子粉末与黑曲霉菌孢子粉末按1：1的质量比混匀，得到解磷菌剂。准备7等份质量为0.5g的解磷菌剂，分装在1.5ml离心管中，按表5所示方式(常温为22～30℃)进行处理，并分别测定ck、t1、t3、t5组解磷菌剂的含水量(含水量＝(处理后的固体发酵物鲜样的质量-处理后的固体发酵物于65℃彻底烘干后测得的干物质质量)/处理后的固体发酵物鲜样的质量)。保存过程中，每月定期取1次解磷菌剂0.01g，用200ml水稀释后取20μl涂布于pda平板表面，28℃培养5天后进行菌落计数，每组含3个重复，统计值为孢子萌发率＝各阶段菌落数/初始菌落数
×
100％，连续统计9个月。
[0112]
表5解磷菌剂的处理方式
[0113][0114]
(3)试验结果与分析
[0115]
不同烘干时长(对应ck、t1、t3、t5)对解磷菌剂含水量的影响结果如图5所示，不同保藏时间(对应ck、t1～t6)对解磷菌剂孢子萌发率的影响结果如图6所示。
[0116]
由图5可知：不烘干、烘干1d、烘干3d和烘干5d的样品含水率分别为39％、29％、13％和9％。
[0117]
由图6可知：
[0118]
①
ck、t1～t6解磷菌剂的孢子萌发率在4个月内均能维持在60％以上，表明本发明解磷菌剂的稳定性较佳，能长时间保存。
[0119]
②
t3的孢子萌发率显著高于t1、t5，t4的孢子萌发率显著高于t2、t6。可见，处理3d的解磷菌剂的孢子活性显著优于处理1d或5d的解磷菌剂，表明将本发明的解磷菌剂于37℃烘箱中处理3d后，能显著提升解磷菌剂的稳定性，结合图5可知，当解磷菌剂的含水率为13％时本发明解磷菌剂的稳定性最佳。
[0120]
③
t2的孢子萌发率显著高于t1，t4的孢子萌发率显著高于t3，t6的孢子萌发率显著高于t5；且常温(t1、t3、t5)条件下，孢子活性在4～5个月后会大幅下降，只有烘干3d的t3能在7个月后仍维持活性(但孢子萌发率只有30％左右)，烘干5d的t5保存效果最差(在第5个月就完全丧失活性)。可见，于4℃保存的解磷菌剂的孢子活性显著优于于常温下保存的解磷菌剂，表明将本发明的解磷菌剂于4℃下保存，能显著提升解磷菌剂的稳定性。
[0121]
④
t4的孢子萌发率显著高于其它组；在该条件(t4)下，解磷菌剂的孢子活性随时间下降缓慢，半年内的孢子萌发率能维持在80％以上，9个月后孢子萌发率还能达到75％。表明将本发明的解磷菌剂在37℃烘箱中处理3d后，再置于4℃下保存，能实现解磷菌剂最佳的稳定性，达到最佳的保存效果，显著延长解磷菌剂的保藏时间。
[0122]
实施例5土壤培育试验
[0123]
(1)试验材料
[0124]
①
取实施例3中t8培养基培养得到的解磷青霉菌孢子粉末，用无菌水将其调配成浓度为105cfu/ml的孢子悬液，得到青霉菌菌液；
[0125]
②
取实施例3中t8培养基培养得到的解磷黑曲霉菌孢子粉末，用无菌水将其调配成浓度为105cfu/ml的孢子悬液，得到黑曲霉菌菌液；
[0126]
③
取实施例4的解磷菌剂，用无菌水将其调配成浓度为105cfu/ml的孢子悬液，得
到复合菌液；
[0127]
④
有机覆盖物(将松树皮烘干后粉碎至粒径1～3cm)
[0128]
⑤
园林绿地土壤(有磷矿粉施用历史)，土壤ph值7.56
±
0.04，有机质19.8
±
0.3g/kg，全氮1.17
±
0.05g/kg，全磷1.17
±
0.01g/kg，全钾7.52
±
0.02g/kg，水解氮118.6
±
0.3mg/kg，有效磷9.82
±
0.14mg/kg，速效钾49.6
±
0.4mg/kg。
[0129]
(2)试验方法
[0130]
为了尽量贴合解磷菌剂的实际使用环境，整体试验在户外露天条件下开展。首先将表6所示各组的菌液/无菌水按1l/m2的量均匀喷洒在供试土壤表面(供试土壤已提前均质化并分装到育苗盆中，另外，有机覆盖物的施用方法为：喷洒完菌液/无菌水后，再在土壤表面添加1层2cm厚的有机覆盖物)，2个月后进行土壤样本采集，每个育苗盆按五点取样法采集1个混样作为待测样本，用磷钼蓝比色法检测土壤有效磷含量，每组含4个重复。利用excel 2016进行组内平均值计算和方差分析，组间的差异显著性则利用spss 22.0通过lsd法进行多重比较。
[0131]
表6土壤接种试验设计
[0132][0133][0134]
(3)试验结果与分析
[0135]
各组土壤的有效磷含量如表7所示。
[0136]
表7不同处理条件下的土壤有效磷含量
[0137][0138]
注：不同小写字母代表数据间差异显著(p＜0.05)。
[0139]
由表7可知：
[0140]
①
菌液施加用量相同的t3组的有效磷含量显著高于t1、t2组，可见，复合菌剂的解
磷效果要显著优于两种菌剂的单一施用效果，表明本发明采用特定培养基培养得到的青霉菌孢子粉末与黑曲霉菌孢子粉末在溶解土壤难溶磷源等方面发挥了协同增效的作用，显著提升了土壤磷素利用率。
[0141]
②
t3组的有效磷含量比ck1高了52.8％，t4组的有效磷含量比ck2高了65.8％，表明将本发明的解磷菌剂施用于土壤表面，可显著增加土壤的有效磷含量。
[0142]
③
t4组的有效磷含量高于t3组，表明在复合菌剂的基础上再添加有机覆盖物，可进一步增强复合菌剂的解磷效果。
[0143]
实施例6矮牵牛栽培试验
[0144]
(1)试验材料
[0145]
矮牵牛穴盘苗、实施例4的解磷菌剂、栽培基质(将绿地土壤、绿化废弃物堆肥等体积混匀得到)和育苗盆。
[0146]
(2)试验方法
[0147]
将解磷菌剂用无菌水分别稀释成浓度为108cfu/ml、107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml的菌液，按如表8所示处理方式将菌液分别施加到t1～t6的矮牵牛根系周围，ck组施加等量无菌水作为对照，每组含5个重复。2个月后进行破坏性采样测量干重。
[0148]
表8矮牵牛栽培试验的处理方式
[0149][0150]
(3)试验结果与分析
[0151]
矮牵牛的干重统计结果如图7所示。可见：t1、t2组与ck组无显著性差异；t3～t5组可显著增加矮牵牛的干重，且较ck组分别增加了22.8％、26.4％和25.2％；t6组虽然浓度最高，但矮牵牛的干重却与ck组无显著性差异，差于t3～t5组。表明当解磷菌剂的使用量为105～107cfu/ml时，其对矮牵牛的促生效果最佳。
[0152]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种解磷菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s1.将青霉菌接种于pda固体培养基中，培养至孢子覆盖培养基表面，冲洗后收集青霉菌孢子悬液；再接种于固体扩繁培养基中，培养至孢子覆盖培养基表面后，收集青霉菌孢子粉末；s2.将黑曲霉菌接种于pda固体培养基中，培养至孢子覆盖培养基表面，冲洗后收集黑曲霉菌孢子悬液；再接种于固体扩繁培养基中，培养至孢子覆盖培养基表面后，收集黑曲霉菌孢子粉末；s3.将s1青霉菌孢子粉末与s2黑曲霉菌孢子粉末混匀，即得到所述解磷菌剂；其中，s1与s2不限先后顺序；所述固体扩繁培养基包含质量比为19.5～20.5：9.5～10.5：4.5～5.5：14.5～15.5的玉米渣、稻壳、麦麸、水。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述培养的温度为25～30℃。3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述青霉菌孢子悬液与固体扩繁培养基的用量比为800～1200cfu/g；所述黑曲霉菌孢子悬液与固体扩繁培养基的用量比为800～1200cfu/g。4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述s1青霉菌孢子粉末与s2黑曲霉菌孢子粉末的质量比为0.8～1.2：0.8～1.2。5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述固体扩繁培养基还包含琼脂。6.权利要求1～5任一所述方法制备得到的解磷菌剂。7.权利要求6所述解磷菌剂在提升土壤磷素利用率中的应用。8.权利要求6所述解磷菌剂的保存方法，其特征在于，将所述解磷菌剂干燥至含水量9％～39％，于3～5℃下保存。9.一种固体扩繁培养基，其特征在于，包含质量比为19.5～20.5：9.5～10.5：4.5～5.5：14.5～15.5的玉米渣、稻壳、麦麸、水。10.权利要求9所述固体扩繁培养基在制备解磷菌剂中的应用。

技术总结
本发明提供了一种解磷菌剂及其制备和应用。该解磷菌剂由经过特定方法(尤其是使用特定成分及其用量的固体扩繁培养基)培养得到的青霉菌孢子粉末与黑曲霉菌孢子粉末组成，这两个菌株在溶解土壤难溶磷源等方面发挥了协同增效的作用，显著提升了土壤中磷素的利用率，缓解了过量磷肥使用带来的资源浪费和环境污染等问题，有效促进了植物生长，适用于制备菌肥。肥。肥。


技术研发人员：许昌超 张俊涛 苏杨 冼卓慧 梁春梅 李铤 崔诚
受保护的技术使用者：广州市林业和园林科学研究院
技术研发日：2023.04.17
技术公布日：2023/8/5