一种血小板RNA逆转录成cDNA的试剂盒

一种血小板rna逆转录成cdna的试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种血小板rna逆转录成cdna的试剂盒。


背景技术：

2.血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆裂解脱落下来的小块胞质。巨核细胞虽然在骨髓的造血细胞中为数最少，仅占骨髓有核细胞总数的0.05％，但其产生的血小板却对机体的止血功能极为重要。血小板为圆盘形，直径1～4微米到7～8微米不等，且个体差异很大(5～12立方微米)。血小板因能运动和变形，故用一般方法观察时表现为多形态。血小板结构复杂，简言之，由外向内为3层结构，即由外膜、单元膜及膜下微丝结构组成的外围为第1层；第2层为凝胶层，电镜下见到与周围平行的微丝及微管构造；第3层为微器官层，有线粒体、致密小体、残核等结构。血小板的主要功能是凝血和止血，修补破损的血管。血小板的表面糖衣能吸附血浆蛋白和凝血因子ⅲ，血小板颗粒内含有与凝血有关的物质。当血管受损害或破裂时，血小板受刺激，由静止相变为机能相，迅即发生变形，表面粘度增大，凝聚成团；同时在表面第ⅲ因子的作用下，使血浆内的凝血酶原变为凝血酶，后者又催化纤维蛋白原变成丝状的纤维蛋白，与血细胞共同形成凝血块止血。血小板颗粒物质的释放，则进一步促进止血和凝血。
3.近日，来自阿姆斯特丹自由大学的myron g在《cancercell》发表的一篇文章提出，基于肿瘤血小板(tumor-educatedbloodplatelets，teps)的rna测序可用于泛癌症分析、癌症类型的区分和肿瘤基因突变诊断。结果表明，血小板的rna测序可以区分癌症患者与健康人，其准确率达到96％，也能区分六种原发肿瘤类型，其准确度达到71％，并能识别几种肿瘤中发现的基因改变。领先于其他的液体活检，基于teps的rna测序可以通过查明原发肿瘤的部位对癌症进行精确的诊断。2015年11月9号发表在《癌细胞》(cancercell)上的一篇研究论文中，研究人员报道称，基于肿瘤(tumor-educated)的血小板rna包含有肿瘤相关的生物分子，可以以此鉴别出健康人群和癌症患者，准确率达到96％。此外，这个检测不仅可以帮助诊断癌症和指导治疗，还可以区分6种不同的原发性肿瘤类型，准确率达到71％；还可以鉴别出特定的乳腺癌和肺癌的生物标志物。血小板rna检测是对液体活检技术的补充，液体活检能检测到流入体液循环或者肿瘤细胞死亡后释放的那些肿瘤体细胞突变的dna，因而可以检测并追踪到肿瘤。
4.申请号为201610911677.x的中国专利申请公开了一种用于肿瘤早期筛查的肿瘤血小板rna定量检测模型及方法，所述模型包括pcr检测特异性引物，用以临床诊断肿瘤血小板rna生物标志物组合，包括cd79a、cd81、sytl1、cenpc、ttn、rhoh、znf101、trabd2a和trac。该方法包括制备样本、提取rna、逆转录合成cdna、pcr检测、用算式计算y值和结果评判等步骤。虽然该发明使用rna联合标志物诊断肿瘤的灵敏度能达到92.5％，高于目前临床常用生物标志物灵敏度，但是整个实验过程繁多、操作复杂，时间长、试剂消耗量大，由于存在样品损失的可能性，因而对低起始量的样品或许无法检测。
5.申请号为201710731914.9的中国专利申请公开了一种用于非小细胞肺癌诊断的
血小板lncrna的定量检测方法，证实nsclc患者血小板长链非编码rna magi2-as3、zfas1的表达低于正常人，基于此制备出用于非小细胞肺癌诊断的实时荧光定量pcr的试剂盒。通过联合magi2-as3和zfas实时荧光定量pcr扩增获得的表达量数据，建立了非小细胞肺癌诊断的logistic回归拟合数据模型，该模型对非小细胞肺癌有较高的诊断效能和敏感性。该方案较201610911677.x有了较大的进步，采用特异性核酸捕获探针对血小板rna样品进行特异性逆转录扩增，并通过链霉亲和素磁珠进行逆转录产物的纯化回收。虽说整个过程实现血小板rna免提取，但实验流程中用含有探针的磁珠捕获血小板中rna的过程十分复杂，也很耗时。
6.因此，针对血小板rna的获得及cdna制备方面，迫切需要开发一种血小板免提取方法路线，使可以直接以血小板为样品，获得对应cdna。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种血小板rna逆转录成cdna的试剂盒，使用其能够直接以血小板为样品，获得对应cdna，并能免提取血小板rna，速度快，效率高。
8.为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
9.一种血小板rna逆转录成cdna的试剂盒，其包括1x反应缓冲液、反应酶、引物和促进剂；
10.所述1x反应缓冲液包含50mmol/ltris-hcl、75mmol/lkcl、3mmol/lmgcl2、10mmol/l二硫苏糖醇、dntp。
11.进一步，所述反应酶包含m-mlv逆转录酶、taq酶和rnase inhibitor。
12.进一步，所述促进剂选自莎梵婷(surfactin)、盐酸胍、异氰盐酸胍、sds、triton x-100、tween 20、np-10、np-40或span 80中的两种以上任意比例的组合，更优选为triton x-100或np-40。
13.所述引物包括但不限于单一基因的特定区域的上下游引物对(如：f：aaagcctgccggtgactaa，r：gcgtcaaaggtggaggagtg，产物大小993bp；或者f：aatgggcagccgttaggaaa，r：gcgcccaatacgaccaaatc，产物大小：168bp)、通用性引物对(如：illumina测序平台read1序列(gatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct)和read2序列(gtgactggagttcagacgtgtcgctcttccgatct))。
14.上述试剂盒在将血小板rna逆转录成cdna中的应用。
15.本发明的有益效果：
16.本发明提供了一种血小板rna逆转录成cdna的试剂盒，与现有技术相比，本发明的试剂盒成分简单，使用其能够直接以血小板为样品，获得对应cdna，并能免提取血小板rna，速度快，效率高。本发明的试剂盒适用于各种途径收集的血小板样品，可以简单快速实现血小板中rna直接逆转录成cdna的过程，无需rna提取，并使cdna产量得到保证。
附图说明
17.图1为采用本发明的试剂盒对血小板进行rt-pcr扩增后的电泳图；
18.图2为采用本发明的试剂盒对血小板进行rt-qpcr扩增后的荧光pcr扩增曲线。
具体实施方式
19.下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
20.下面描述的实例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂、仪器等，若无特殊说明，均可从商业途径得到。
21.实施例1
22.血小板rna逆转录成cdna的试剂盒中各试剂组分配制：
23.1、准备1x反应缓冲液：tris-hcl(1m，阿拉丁，t197247-400ml)、kcl(干粉，阿拉丁，p112143)、mgcl2(1m，阿拉丁，m299562)、二硫苏糖醇(dtt，1m，阿拉丁，d301909)、dntpmix溶液(25mm each，阿拉丁，d292587)；
24.准备反应酶：m-mlv逆转录酶(200u/ul，诺唯赞，r302-01)、rnase inhibitor(40u/ul诺唯赞，r301-01)和taq酶(10u/ul，abclonal，rk20714)；
25.准备促进剂：莎梵婷(干粉，surfactin，阿拉丁，s329585)，triton x-100(100％，阿拉丁，t109027)，np-40(100％，tergitol np-40，阿拉丁，n118821)。
26.2、按照一定比例，将上述试剂配置成相应母液，见表1：
27.表1
28.试剂母液浓度kcl1mdtt1mtritonx-10010％(v/v)np-4010％(v/v)
29.3、配制反应液(5x)：按表2所示配方配制反应液5x反应液1和5x反应液2：
30.表2
31.试剂名称(母液)5x反应液15x反应液2tris-hcl(1m)0.05ml0.05mlkcl(1m)0.075ml0.075mlmgcl2(1m)0.003ml0.003mldtt(1m)0.01ml0.01mldntp(25mmeach)0.02ml0.02mltritonx-100(10％)0.1ml-np-40(10％)-0.2ml水0.742ml0.642ml
32.4、配制反应酶：
33.取m-mlv(200u/ul)、rnase inhibitor(40u/ul)和taq(10u/ul)各0.05ml，混合均匀，得到反应酶。
34.实施例2
35.血小板rna的rt-qpcr反应：
36.1、全血的采集
37.使用bd二钾edta采血管采集受试者2ml静脉血，采集后轻轻颠倒采血管数次，使抗
凝剂与全血充分混匀，全血采集后应在96h内处理。
38.2、超纯血小板的分离：按照《人外周血血小板分离液试剂盒说明书》(索莱宝，p6390)，简要步骤如下：
39.a、取新鲜抗凝全血(edta、枸橼酸钠或肝素抗凝均可)或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血及组织稀释液或者pbs稀释全血。
40.b、在离心管中加入至少5ml的分离液(当血液的体积大于等于3ml，加入2倍体积分离液，但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果)。
41.c、将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰(可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多，加样的时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象)。
42.d、室温，水平转子200-250g，离心15min(血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长)。
43.e、离心后，此时离心管中由上至下分为四层：最上层为富含血小板的血浆层；第三层为分离液层；分离液与血浆层之间是白色细胞层；第四层为红细胞层。
44.f、小心的吸取富含血小板的血浆层到15ml洁净的离心管中，加入10mlpbs或细胞洗涤液(如果需要得到富含血小板的血浆，可直接吸取，不再清洗)。500g，离心20min。
45.g、弃上清，5ml的pbs或细胞洗涤液重悬血小板，500g，离心20min。
46.h、弃上清，用0.15ml的pbs重悬血小板，转移到pcr管中。
47.i、500g，离心20min，保持沉淀无pbs残留，备用。
48.3、取两份步骤2中所得的血小板沉淀，分别加入10ul实施例1中配制的5x反应液1和5x反应液2，并各自加入3ul实施例1中配制的反应酶，gapdh引物mix(f：aaagcctgccggtgactaa，r：gcgtcaaaggtggaggagtg，产物大小993bp，每条引物浓度均为10μm，用量1ul)，最后用h2o补充总体积50ul。
49.4、pcr反应：按照反应程序为53℃30min，95℃1min，(95℃10s，60℃1min35cycles)，72℃1min，4℃hold进行pcr扩增反应。
50.5、扩增结束后，将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
51.图1为采用本发明的试剂盒对血小板进行rt-pcr扩增后的电泳图，图中通道1对应的是5x反应液1，通道2对应5x反应液2，可以看出，根据试剂盒配制的两种5x反应液均能够实现本发明所描述的效果，在这两种5x反应液中，血小板样品可以直接实现gapdh引物的扩增，并获得特异性目的条带。
52.实施例3
53.血小板rna的rt-qpcr反应：
54.1、样品制备：按照实施例2的过程与方法获得血小板沉淀，同时准备1ug以上的人源纯的rna样品。
55.2、rt-qpcr体系添加：取两份血小板沉淀，分别加入10ul实施例1中配制的5x反应液1和5x反应液2，并分别加入3ul实施例1中配制的反应酶，gapdh引物mix(f：aatgggcagccgttaggaaa，r：gcgcccaatacgaccaaatc，产物大小：168bp，每条引物浓度均为10μm，用量1ul)，1ul的50x sybr green荧光染料，最后用h2o补充总体积50ul。
56.3、为了比较实验效果，设置一组对照：取200ng rna样品，加入10ul实施例1中所述的5x反应液1，并加入3ul的实施例1中所述的酶mix，gapdh引物mix，1ul的50x sybr green荧光染料，最后用h2o补充总体积50ul。
57.4、rt-qpcr反应：在荧光pcr仪中，按照反应程序为53℃30min，95℃1min，(95℃10s，60℃1min并收集信号45cycles)，72℃1min，4℃hold进行pcr扩增反应。
58.5、扩增结束后，所得扩增曲线为图2，具体见附图。
59.图2为采用本发明的试剂盒对血小板进行rt-qpcr扩增后的荧光pcr扩增曲线，图中结果表明，在较低血小板样品的情况下，采用本发明所述的方法，qpcr结果相当于200ng rna所得结果，说明本发明方法可以有效提高低起始量样品的反应效率。
60.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种血小板rna逆转录成cdna的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1x反应缓冲液、反应酶、引物和促进剂；所述1x反应缓冲液包含50mmol/ltris-hcl、75mmol/lkcl、3mmol/lmgcl2、10mmol/l二硫苏糖醇、dntp。2.如权利要求1所述血小板rna逆转录成cdna的试剂盒，其特征在于，所述反应酶包含m-mlv逆转录酶、taq酶和rnaaseinhibitor。3.如权利要求1所述血小板rna逆转录成cdna的试剂盒，其特征在于，所述促进剂选自莎梵婷、盐酸胍、异氰盐酸胍、sds、tritonx-100、tween20、np-10、np-40或span80中的一种或两种以上任意比例的组合。4.如权利要求3所述血小板rna逆转录成cdna的试剂盒，其特征在于，所述促进剂为tritonx-100或np-40。5.权利要求1-4任一项所述试剂盒在将血小板rna逆转录成cdna中的应用。

技术总结
本发明为一种血小板RNA逆转录成cDNA的试剂盒，所述试剂盒包括1x反应缓冲液、反应酶、引物组合物和促进剂；所述1x反应缓冲液包含50mmol/LTris-HCl、75mmol/LKCl、3mmol/LMgCl2、10mmol/L二硫苏糖醇、dNTP，所述反应酶组合物包含M-Mlv逆转录酶和Taq酶。与现有技术相比，本发明的试剂盒成分简单，使用其能够直接以血小板为样品，获得对应cDNA，并能免提取血小板RNA，速度快，效率高。本发明的试剂盒适用于各种途径收集的血小板样品，可以简单快速实现血小板中RNA直接逆转录成cDNA的过程，无需RNA提取并使cDNA产量得到保证。需RNA提取并使cDNA产量得到保证。需RNA提取并使cDNA产量得到保证。


技术研发人员：孙倩 尹凌帝 刘文洁 洪鸣
受保护的技术使用者：江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）
技术研发日：2023.03.30
技术公布日：2023/8/5