用于胰腺类器官培养和移植的脱细胞胰腺组织衍生支架及其制备方法与流程

1.本发明涉及用于胰腺类器官培养和移植的脱细胞胰腺组织衍生支架及其制备方法。


背景技术：

2.最近备受关注的类器官作为能够应用于新药筛选、药物毒性评估、疾病建模、细胞治疗剂、组织工程等各种临床应用的组织类似物，是一种在全世界范围内快速发展的技术。类器官不仅由构成人体特定脏器以及组织的各种细胞在三维结构体中组成，而且还可以实现它们之间的复杂的相互作用，因此与现有的主要使用的药物评估模型相比，例如简单的细胞系模型或动物模型等，其可以用作更准确的体外模型平台。
3.除胰腺外，各脏器都有各种类型的类器官，但到目前为止，研究上述类器官的世界各地的众多研究团队共同使用基质胶(matrigel)产品作为培养类器官的培养支架。但由于基质胶是从鼠的肉瘤癌组织中提取的成分，产品的品质难以保持一致，价格昂贵，并且在动物源性感染菌以及病毒转移等安全性方面存在问题，因此作为一种类器官培养系统，基质胶具有很多需要解决的问题。尤其是，作为癌组织衍生材料，其不能提供培养特定组织类器官所需的最佳的组织特异性微环境。虽然已经进行了一些以高分子为基础的水凝胶来替代基质胶的开发研究，但目前还没有报告表示有能够替代基质胶的水平的材料。
4.胰腺类器官通过从胰腺组织中提取成体干细胞并培养，或将人类诱导性多能干细胞或胚胎干细胞等全能干细胞分化为胰腺祖细胞后培养的方法制备。然而，由于基质胶并不能实现体内复杂的胰腺组织特异性微环境，因此需要改善胰腺类器官的分化效率和功能。所以迫切需要开发一种培养体系来制备更成熟、更具功能性的胰腺类器官。
5.此外，需要一种用于在体外实现急性和慢性胰腺炎、糖尿病、胰腺癌等发生大量的细胞损失以及胰腺功能下降的难治性胰腺疾病，并揭示其机制的疾病建模研究以及药物测试的体外模型平台。
6.为解决目前在胰腺类器官培养及相关应用技术中遇到的技术问题，本发明提出了，由胰腺组织通过脱细胞过程制作胰腺组织衍生脱细胞支架并将其使用于胰腺类器官培养的新平台。开发的脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架含有丰富的胰腺组织特异性的多种细胞外基质和生长因子，从而与使用基质胶时相比，增强了胰腺类器官的分化、成熟度和功能性。


技术实现要素：

7.发明所要解决的问题
8.本发明通过对猪胰腺组织进行化学处理，获得了大量脱细胞组织，并基于此制作水凝胶支架，应用于胰腺类器官培养。
9.然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，本领域技术人员通过以下描述
将清楚地理解其他未提及的问题。
10.用于解决问题的方案
11.本发明的一个方面，提供一种用于胰腺类器官培养和移植的支架，其包括胰腺组织衍生细胞外基质(pancreas extracellular matrix；pem)。
12.作为本发明的一个具体例，上述胰腺组织衍生细胞外基质可以是通过对胰腺组织处使用曲拉通x-100(聚乙二醇辛基苯基醚)和氢氧化铵的混合溶液进行处理而脱细胞的。
13.作为本发明的一个具体例，上述支架中上述胰腺组织衍生细胞外基质的浓度可以为1mg/ml至10mg/ml。
14.本发明的另一方面，提供一种用于胰腺类器官培养和移植的支架的制备方法，其包括：步骤1)，将分离的胰腺组织进行破碎；以及步骤2)，对破碎的上述胰腺组织使用曲拉通x-100和氢氧化铵进行处理而脱细胞，以制备脱细胞胰腺组织衍生细胞外基质(pem)。
15.作为本发明的一个具体例，在上述步骤2)之后，还可以包括：步骤3)，将上述脱细胞胰腺组织衍生细胞外基质(pem)冷冻干燥，制备冷冻干燥的胰腺组织衍生细胞外基质。
16.作为本发明的一个具体例，在上述步骤3)之后，还可以包括：4)使上述冷冻干燥的胰腺组织衍生细胞外基质形成为水凝胶形态的用于胰腺类器官培养和移植的支架。
17.作为本发明的一个具体例，上述步骤4)中可以将上述冷冻干燥的胰腺组织衍生细胞外基质溶解在胃蛋白酶溶液中进行溶液化后，调节ph进行水凝胶化。
18.本发明的另一方面，提供一种在支架中培养胰腺类器官的方法，其在是上述支架或根据上述制备方法制备的支架中进行培养。
19.发明效果
20.本发明开发的用于胰腺类器官培养和移植的支架作为新型胰腺类器官培养支架而开发，其克服了现有的作为代表性类器官培养用支架的基质胶所具有的局限性，其被应用为各种临床前和临床研究的要素技术，例如基于胰腺类器官的大规模新药筛选平台或用于组织再生的细胞治疗剂等，有望在产业和经济方面创造高附加值，促进医疗新产业的发展。
21.与现有培养方式相比，使用本发明开发的用于胰腺类器官培养和移植的支架，可以制作出高度化的胰腺类器官，因此可以作为超越现有用于药物测试的体外模型的，具有经济性且更加准确的平台来使用。据此，基于高度化的胰腺类器官的体外模型平台有望大幅提高新药开发的成功率，并大幅降低成本和所需时间，从而能够为医疗行业的发展做出重大贡献。
22.脱细胞胰腺组织衍生人工基质支架有望能够在多个领域广泛使用，如在体外实现各种难治性胰腺疾病(急性/慢性胰腺炎、糖尿病、胰腺癌等)揭示其机制的疾病建模研究以及移植治疗平台的构建等。由于最近这些难治性胰腺疾病患病率大幅增加，需要大量研究，因此作为研究用试剂也能够产生收益。
23.胰腺类器官可以应用于全球患病率超过10％且引起各种并发症的糖尿病的研究，也可以应用于癌症中生存率最低的胰腺癌的研究，因此具有很大的价值。
24.本发明开发的支架不仅可以应用于组织干细胞衍生胰腺类器官培养，还可以应用于胰腺癌类器官培养，从而对难治性疾病及癌症患者定制型疾病模型的构建做出贡献，能够作为精准医学平台技术使用，考虑到最近急增的精准医学市场的规模，有望可以创造巨
大的附加值。
25.综上所述，与胰腺类器官的应用所必需的基质胶相比，本发明开发的人工支架作为培养体系表现出优于基质胶的功能性，并且更安全，在成本方面也具有非常有利的优势。因此，预测仅凭这种基质胶替代作用，也可以创造巨大的经济收益。
附图说明
26.图1是示出用于胰腺类器官培养的脱细胞胰腺组织衍生支架(pancreas extracellular matrix；pem)的制作过程和制作的脱细胞胰腺组织衍生支架的图。
27.图2是示出用于胰腺类器官培养的脱细胞胰腺组织衍生支架(pem)的分析结果的图。
28.图3是示出根据脱细胞胰腺组织衍生支架(pem)的浓度对物性分析的图。
29.图4和图5是示出脱细胞胰腺组织衍生支架(pem)的蛋白质组分析的图。
30.图6是示出根据脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架的pem浓度对小鼠胰腺类器官形成和分化能力差异分析的图。
31.图7是示出在脱细胞胰腺组织衍生支架(pem)和现有的培养支架(mat)中形成的胰腺类器官的生长比较的图。
32.图8示出了在脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架中培养的胰腺类器官的分析结果。
33.图9是验证使用脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架(pem)的胰腺类器官的分化增强效果的图。
34.图10是确认使用脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架(pem)的胰腺类器官的长期培养可能性的图。
35.图11和图12示出了验证脱细胞胰腺组织衍生水凝胶(pem)的长期保管可能性的结果。
36.图13是示出使用脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架的人类诱导性多能干细胞(human-induced pluripotent stem cell；hipsc)衍生胰腺类器官培养的图。
37.图14示出了使用脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架培养的人类诱导性多能干细胞(human-induced pluripotent stem cell；hipsc)衍生胰腺类器官的分析结果。
38.图15是确认使用脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架的人类诱导性多能干细胞(human-induced pluripotent stem cell；hipsc)衍生胰腺类器官的长期培养可能性的图。
39.图16示出了确认用于人类诱导性多能干细胞衍生胰腺类器官培养的脱细胞胰腺组织衍生pem支架的组织特异性效果的结果。
40.图17是确认使用脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架的胰腺癌类器官的培养结果的图。
41.图18示出了确认脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架作为移植用材料的使用可能性的结果。
42.图19至图21示出了使用脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架的胰腺类器官体内移植的结果。
具体实施方式
43.以下，将参照附图描述本发明。然而，本发明能够以几种不同的形态实施，因此不限于这里描述的实施例。当某个部分“包括”某个组件时，除非另有说明，否则意味着可以进一步包括其他组件，而不是排除其他组件。
44.除非另有定义，分子生物学、微生物学、蛋白质纯化、蛋白质工程和dna测序分析可以在本领域技术人员的能力范围内通过重组dna领域中常用的常规技术进行。这样的技术是本领域技术人员已知的，并且在许多标准化的教科书和参考书中都有描述。
45.除非本说明书中另有定义，否则使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同含义。
46.包含本说明书所含术语的各种科学词典在本领域中是众所周知的，并且在本领域可使用。虽然在本技术的执行或实验中，使用了与本说明书中年说明的类似或等效的任意的方法和物质，但仍然描述了几种方法和物质。特定的方法学、方案和试剂不用于限定本发明，因为可以根据本领域技术人员使用的脉络，被多样化使用。以下，将更详细地描述本发明。
47.本发明的一个方面，提供了一种用于胰腺类器官培养和移植的支架，其包括胰腺组织衍生细胞外基质(pancreas extracellular matrix；pem)。
48.上述“细胞外基质(extracellular matrix)”是指通过对在哺乳类以及多细胞生物(multicellular organisms)中发现的组织进行脱细胞化来制备的用于细胞生长的天然支架。上述细胞外基质可以通过透析或交联进一步处理。
49.上述细胞外基质不限于胶原蛋白(collagens)、弹性蛋白(elastins)、层粘连蛋白(laminins)、糖胺聚糖(glycosaminoglycans)、蛋白聚糖(proteoglycans)、抗菌剂(antimicrobials)、化学引诱剂(chemoattractants)、细胞因子(cytokines)和生长因子，可以为结构型和非结构型生物分子(biomolecules)的混合物。
50.在哺乳动物中，上述细胞外基质可以以多种形态含有约90％的胶原蛋白。由于各组织所需的固有作用，多种活体组织衍生的细胞外基质整体结构以及组成可能不同。
51.上述“衍生(derive)”和“衍生的(derived)”是指通过有用的方法从所述来源获得的成分。
52.作为本发明的一个具体例，上述胰腺组织衍生细胞外基质可以是通过对胰腺组织使用曲拉通x-100和氢氧化铵的混合溶液进行处理而脱细胞的。
53.作为本发明的一个具体例，上述支架内上述胰腺组织衍生细胞外基质的浓度可以为1mg/ml至10mg/ml，具体为2mg/ml至8mg/ml。作为上述胰腺细胞外基质的浓度的示例，可以为2mg/ml至8mg/ml、2mg/ml至6mg/ml、2mg/ml至4mg/ml、4mg/ml至8mg/ml、4mg/ml至6mg/ml或6mg/ml至8mg/ml，作为一个实施例，可以为2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml或8mg/ml。当以上述范围之外的浓度包含时，不能获得本发明期望的效果。
54.上述支架包括基于脱细胞化获得的胰腺组织衍生细胞外基质制备的三维水凝胶，可有效应用于胰腺类器官培养。
55.上述脱细胞化胰腺组织含有实际组织特异性细胞外基质成分，因此可以提供相应组织的物理、机械以及生化环境，并且在增强向胰腺组织细胞分化以及组织特异性功能方面非常有效。
56.上述“类器官(organoid)”是指将组织或全能干细胞(totipotent stem cell)衍生的细胞以3d形态培养，制作成人工脏器形态的超小型活体器官。
57.上述类器官作为包含由干细胞产生并以类似于活体内状态的方式进行自组织(或自模式)的脏器特异性细胞的三维组织类似物，可以通过对有限的要素(例如，生长因子)进行模式化而发育成特定组织。
58.上述类器官具有细胞的本来的生理学特性，并且可以具有模拟细胞混合物原始状态的解剖学结构(不仅包括限定的细胞类型，还包括残留的干细胞、近端生理生态位(physiological niche))。上述类器官通过三维培养方法使得细胞和细胞功能得到更好的排列，可以具有如具备功能性的器官的形态和组织特异性功能。
59.本发明的另一方面，提供一种用于用于胰腺类器官培养和移植的支架的制备方法，上述制备方法包括：步骤1)，将分离的胰腺组织进行破碎；以及步骤2)，对破碎的上述胰腺组织使用曲拉通x-100和氢氧化铵进行处理而脱细胞，以制备脱细胞胰腺组织衍生细胞外基质(pem)。
60.上述步骤1)是将分离的胰腺组织破碎的步骤，上述胰腺组织可以为从已知的动物中分离的，作为上述动物的具体示例，可以为牛、猪、猴、人类等。此外，在本发明中，由于脱细胞是在破碎上述分离的胰腺组织之后进行的，因此脱细胞效率高。将分离的胰腺组织破碎的方法可以通过公知的方法进行。在本发明中，由于是将上述胰腺组织破碎而进行脱细胞工艺，因此能够更有效并高水平的去除细胞。
61.上述步骤2)是对破碎的上述胰腺组织使用曲拉通x-100和氢氧化铵进行处理来脱细胞，以制备脱细胞胰腺组织衍生细胞外基质(pem)的步骤。与现有的脱细胞方式不同，本发明仅使用曲拉通x-100和氢氧化铵进行处理，将组织损伤最小化，从而可以更多的保存胰腺组织内的多种蛋白质。作为具体示例，可以将破碎的胰腺组织与曲拉通x-100和氢氧化铵一起搅拌来进行脱细胞工艺。
62.作为本发明的一个具体例，在上述步骤2)之后，还可以包括：步骤3)，将上述脱细胞胰腺组织衍生细胞外基质(pem)进行冷冻干燥，从而制备冷冻干燥的胰腺组织衍生细胞外基质。
63.上述步骤3)是将上述脱细胞胰腺组织衍生细胞外基质(pem)进行冷冻干燥，从而制备冷冻干燥的胰腺组织衍生细胞外基质的步骤。上述冷冻干燥的胰腺组织衍生细胞外基质在干燥后，可以暴露于电子束、伽马辐射、环氧乙烷气体或超临界二氧化碳来灭菌。
64.作为本发明的一个具体例，在上述步骤3)之后，还可以包括：步骤4)，使上述冷冻干燥的胰腺组织衍生细胞外基质形成为水凝胶形态的用于胰腺类器官培养和移植的支架。
65.上述步骤4)是使上述冷冻干燥的胰腺组织衍生细胞外基质形成为水凝胶形态的用于胰腺类器官培养和移植的支架的步骤。上述步骤可以通过凝胶化(gelation)的方式进行，具体地，可以将上述冷冻干燥的胰腺组织衍生细胞外基质溶解在胃蛋白酶溶液中进行溶液化后，调节ph进行水凝胶化。可以使上述脱细胞胰腺组织衍生细胞外基质交联，制作三维水凝胶形态的支架，凝胶化的支架不仅可应用于实验和筛选，还可以多样地应用于与类器官培养相关的领域。
66.上述“水凝胶”是以水为分散介质的液体通过溶胶-凝胶相变，变硬失去流动性，并形成多孔性结构的物质，可以通过使具有三维网络结构和微晶结构的亲水性聚合物含有水
并膨胀而形成。
67.上述凝胶化可以为在酸性溶液中，通过用胃蛋白酶或胰蛋白酶等蛋白水解酶将冷冻干燥的胰腺组织衍生细胞外基质进行溶液化，并调节ph，具体地，通过使用10x pbs和1m naoh调节到中性ph和1x pbs缓冲液的电解质状态，在37℃的温度下进行30分钟。
68.本发明的另一方面，提供一种培养胰腺类器官的方法，该方法在上述支架或根据上述制备方法制备的支架中培养胰腺类器官。
69.现有的基于基质胶的培养系统作为动物癌组织衍生的提取物，批次间差异大，不能模拟实际的胰腺环境，分化、发育成胰腺类器官的效率微弱，但上述支架可以营造类似于胰腺组织的环境，因此适用于培养胰腺类器官。
70.上述培养是指在适合的条件下使细胞维持和生长的过程，适合的条件可以指例如，维持细胞的温度、营养素可溶性、大气co2含量和细胞密度。
71.用于维持、增殖、扩增和分化不同类型细胞的适当培养条件在本领域中是已知的并记录在案。适合于上述类器官形成的条件可以为使细胞分化和多细胞结构形成变得容易或允许的条件。
72.本发明的最佳实施方式
73.本发明通过对胰腺组织进行脱细胞化，以制备去除所有细胞成分而保留胰腺特异性细胞外基质成分的脱细胞胰腺组织，并将以此为基础的三维水凝胶应用于胰腺类器官的培养。
74.本发明开发的脱细胞胰腺组织衍生支架由于去除了所有作为抗原的细胞且仅由纯细胞外基质成分组成，因此在移植时不会引起组织的炎症反应及免疫排斥反应，并且生物相容性非常优异。由于制作容易且制备单价低，因此与基质胶相比，其经济性高，且可作为安全的培养材料及移植材料而应用。
75.实际上通过蛋白质组分析，确认了脱细胞胰腺组织衍生支架含有胰腺组织特异性的多种细胞外基质和因子。确认了干细胞衍生胰腺类器官可以在制作的脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架中生成和生长，并测试脱细胞胰腺组织支架的各种浓度，筛选了针对胰腺类器官培养最优的水凝胶浓度条件。
76.经确认，与在作为对照组的基质胶中培养的类器官相比，在开发的脱细胞胰腺组织衍生支架中培养的胰腺类器官的分化能力维持为相似或得到了提升。由此验证了脱细胞胰腺组织衍生支架可以替代现有的基质胶用于胰腺类器官的培养。通过这一系列的结果，确认了在本发明开发的支架中培养的胰腺类器官比在现有基质(基质胶)中培养的类器官更能真实地实现胰腺组织的组成和功能。
77.以下，示出优选实施例以帮助理解本发明。然而，提供以下实施例只是为了更容易地理解本发明，本发明的内容不受以下实施例的限制。
78.用于胰腺类器官培养的脱细胞胰腺组织衍生支架(pancreas extracellular matrix；pem)的制作(图1)
79.为了制作用于胰腺类器官培养的培养支架，由猪胰腺组织制作了脱细胞支架(pancreas extracellular matrix；pem)。经确认，与现有被报告的方式不同，本发明的脱细胞工艺仅使用1％的曲拉通x-100和0.1％的氢氧化铵的混合溶液使组织损伤最小化，从而可以使得胰腺组织内的多种蛋白质得以更多的保存。此外，由于在将胰腺组织切细后进
行脱细胞工艺，因此具有更高效、可以完全去除细胞的优点。
80.具体地，图1的(a)中示出了用于胰腺类器官培养的脱细胞胰腺组织衍生支架的制作模拟图。
81.(b)将猪胰腺组织切细后，通过进行使用曲拉通x-100溶液和氢氧化铵溶液的化学处理将组织内细胞成分全部去除并冷冻干燥，从而以粉末的形态获得。
82.(c)用4mg/ml的胃蛋白酶溶液(将胃蛋白酶粉末(4mg)溶解于0.02m hcl(1ml)中的溶液)处理粉末形态的10mg的脱细胞胰腺组织基质(冻干pem)并在搅拌器中以240rpm溶化48小时后进行溶液化。此后，使用10x pbs和1mnaoh调节至中性ph，在37℃温度条件下诱导凝胶化(gelation)30分钟。将制作的三维水凝胶用作胰腺类器官培养支架。
83.用于胰腺类器官培养的脱细胞胰腺组织衍生支架(pem)的分析(图2)
84.(a)实施h&e染色确认了制作的脱细胞胰腺组织支架内细胞成分被全部去除，并实施马松三色染色(masson's trichrome)确认了在经过脱细胞过程后胶原蛋白(collagen)成分也保存和维持完好。进一步地，通过阿尔新蓝(alcian blue)染色，确认了糖胺聚糖(glycosaminoglycan)在脱细胞胰腺组织衍生支架中保存完好。
85.(b)脱细胞后，为了确认在胰腺组织内ecm蛋白，如纤连蛋白(fibronectin)和层粘连蛋白(laminin)等是否维持完好，实施了免疫染色。结果证实，诸如纤连蛋白(fibronectin)和层粘连蛋白(laminin)的ecm蛋白在脱细胞胰腺组织基质中保存完好。
86.(c)通过扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，sem)分析，确认了脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架具有纳米纤维束形态的多孔型内部结构，从而确认了可以提供适合胰腺类器官培养的三维微环境。
87.(d)通过脱细胞过程前后的dna定量比较，定量确认了通过脱细胞过程细胞成分大部分被去除。此外，通过对代表性细胞外基质成分之一的糖胺聚糖(gag)的定量分析，确认了gag在脱细胞胰腺组织内保存并保留完好。在脱细胞后对胶原蛋白(collagen)的量进行定量时，也确认了其在脱细胞组织基质内维持完好。
88.根据脱细胞胰腺组织衍生支架(pem)的浓度的物性分析(图3)
89.为了解pem支架的不同浓度的物性的差异，在4种浓度条件(2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml)下诱导pem水凝胶的形成，然后通过流变学分析测定了机械物性。通过确认，在所有浓度条件下，储能模量(storage modulus(g
′
))值始终高于损耗模量(loss modulus(g
″
))值，确认了通过水凝胶内交联形成了稳定的高分子网络。确认了随着pem浓度增加物性也会增加，并且确认了与对照组基质胶(mat)组相比，整体物性较低。
90.脱细胞胰腺组织衍生支架(pem)的蛋白质组分析(1)(图4)
91.(a)为了掌握脱细胞胰腺组织衍生支架(pem)的组成成分，通过实施蛋白质组(proteomics)分析，确认了胰腺组织特异性的多种细胞外基质(胶原蛋白、糖蛋白(glycoproteins)、蛋白聚糖(proteoglycans)等)以及生长因子蛋白包含在pem中。结果证实，在构成pem的ecm成分中，以胶原蛋白和蛋白聚糖为大部分，其次为ecm调节因子(regulators)和糖蛋白的顺序构成。
92.(b)将脱细胞胰腺组织衍生支架(pem)与作为现有的常规支架的基质胶进行了比较，结果证实，基质胶大部分为糖蛋白，而pem则由胶原蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白等多种成分构成。
93.(c)为了观察基质胶和pem的蛋白质表达差异，通过热图(heatmap)和火山图(volcano plot)进行了比较，确认了通过热图的整体蛋白质的表达量分布方面，两种支架表现出巨大差异，并且通过火山图确认了在每个支架中明显表达更多的蛋白质，其相互也表现出不同的表达模式。
94.由此预测，与作为现有常规类器官培养支架的基质胶相比，脱细胞胰腺组织衍生支架(pem)由不同的细胞外基质蛋白质成分构成，并且能够更好地实现体内胰腺组织的微环境。
95.脱细胞胰腺组织衍生支架(pem)的蛋白质组分析(2)(图5)
96.(a)经确认，脱细胞胰腺组织衍生pem支架中包含的前10的ecm成分中，占比最高的col6a1和col6a2是胰腺胰岛(langerhans islets)的主要组成成分也是胰岛细胞生存所必要的成分，而双塘链蛋白聚糖(biglycan，bgn)、基膜聚糖(lumican，lum)和无孢蛋白(asporin，aspn)是对胰腺的发育和结构形成重要的ecm蛋白。由此证实，制作的脱细胞胰腺组织衍生细胞外基质(pem)支架含有在胰腺结构和功能中起着重要作用且存在于实际胰腺组织中的各种细胞外基质蛋白。
97.(b)为了解脱细胞胰腺组织衍生pem支架中所包含的前10的ecm成分的功能而进行基因本体论(gene ontology)分析，确认了这些成分具有对胰腺炎和胰腺癌代谢调节至关重要的硫氨基酸(sulfur amino acid，saa)代谢相关功能以及胰腺干细胞自我再生所必要的谷胱甘肽(glutathione)代谢相关功能，从而在胰腺功能和分化发育中起着重要作用。
98.(c)在对脱细胞胰腺组织衍生pem成分整体进行基因本体论(gene ontology)分析时也确认了，与前10的ecm成分的基因本体论分析相似地，主要负责免疫系统过程(immune system process)或此外与胰腺功能及分化发育相关的碳水化合物代谢过程(carbohydrate metabolic process)、nad/nadh代谢过程(nad/nadh metabolic process)等作用。
99.由此认为，使用经过脱细胞工艺而制备的pem水凝胶支架，能够实现高效的胰腺类器官培养。
100.根据脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架的pem浓度对小鼠胰腺类器官形成和分化能力差异分析(图6)
101.制作了各个浓度的脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架，并将其应用于小鼠胰腺类器官培养，通过定量pcr(qpcr)方法比较并分析了在各浓度条件下培养7天的类器官的胰腺分化相关基因表达。将作为常规培养支架的基质胶(mat)用作对照组。
102.(a)当将脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶以多种pem浓度条件应用于胰腺类器官培养时，确认了在所有浓度条件(2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml)下，都能很好的形成与作为对照组的基质胶(mat)中的相似形态的胰腺类器官。
103.(b)在培养第7天，比较根据脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架浓度的胰腺类器官形成效率时，确认了在2mg/ml和4mg/ml条件下形成效率最高。
104.(c)按照各pem浓度条件比较基因表达，则与干细胞特性(stemness)相关的基因(lgr5)在pem水凝胶中培养的胰腺类器官中相似或略有减少，但胰腺分化相关标志物(krt19，pdx1)表现出表达增强的倾向。在pem浓度条件中，考虑到浓度为4mg/ml的pem水凝胶在胰腺类器官的形成效率上与基质胶没有显著差异，且胰腺分化标志物的表达进一步增
强，之后将pem水凝胶浓度决定为4mg/ml的pem条件，应用于胰腺类器官培养。
105.在脱细胞胰腺组织衍生支架(pem)和现有的培养支架(mat)中形成的胰腺类器官的生长比较(图7)
106.比较了在最广泛用于类器官培养的基质胶中和在优化的4mg/ml浓度条件的脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架中培养的小鼠胰管细胞衍生胰腺类器官的生长速度。确认了在各支架中形成的胰腺类器官在胰管中开始形成，随着尺寸逐渐增大而得到良好地培养。确认了在pem水凝胶中培养的胰腺类器官生长时表现出与在基质胶中培养的类器官相似的形态和生长速度。
107.在脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架中培养的胰腺类器官的分析(图8)
108.对在最广泛用于类器官培养的基质胶中和在脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶(4mg/ml)支架中培养的胰腺类器官进行了免疫染色。使用从鼠胰腺组织中提取的胰管细胞制作了胰腺类器官，并在培养第7天通过免疫染色进行了比较。
109.通过对胰腺特异性标志物的免疫染色，与在对照组基质胶(matrigel)中培养的胰腺类器官进行比较，确认了在脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架中培养的胰腺类器官中，胰腺组织特异性标志物也以与基质胶组相似的水平表达良好；krt19(胰管标志物(pancreatic duct marker))、sox9(胰管祖细胞标志物(pancreatic duct progenitor marker))、pdx1(胰腺内胚层标志物(pancreatic endoderm marker))。
110.细胞增殖标志物(proliferative cell marker)ki67的表达在两种支架(pem，基质胶)组中也以相似的水平被观察到。
111.使用脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架(pem)的胰腺类器官分化增强效果的验证(图9)
112.在替代现有的培养支架基质胶的同时，为了确认可以通过胰腺特异性微环境增强类器官分化的组织特异性功能，比较了在脱细胞胰腺组织衍生细胞外基质(pem)水凝胶中和在其他脏器(肝脏)组织衍生细胞外基质(lem)水凝胶中培养的胰腺类器官的分化能力。将基质胶组用作对照组。
113.(a)为了确认脱细胞胰腺组织衍生支架的分化增强效果，除了在pem组外，还在lem组中培养了胰腺类器官。确认了类器官在所有培养支架中均以正常形状良好地形成。
114.(b)通过qpcr分析，对干细胞特性(stemness)或胰腺分化(differentiation)相关标志物的基因表达进行定量比较，确认了干细胞特性相关基因表达为相似或略有增加，而胰腺分化标志物(krt19、pdx1)的表达在胰腺组织特异性pem组中增加最为显著。
115.使用脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架(pem)的胰腺类器官的长期培养可能性确认(图10)
116.在之前建立的脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架内，尝试了胰腺类器官的长期培养，并分析了胰腺特异性分化标志物的表达。将基质胶(mat)组用作对照组。
117.(a)确认了胰腺类器官即使在pem水凝胶内持续传代培养1个月以上(5代)也生长良好，并且形状和大小与在基质胶中培养的胰腺类器官相似。
118.(b)在胰腺类器官培养的第10天(p1)和第30天(p5)比较干细胞标志物和胰腺分化标志物的基因表达，确认了与在基质胶中培养的类器官相比，在脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架中培养的胰腺类器官中，干细胞特性(stemness)基因表达维持相似，胰腺分化标
志物表达得以增强。在pem水凝胶中长期培养30天的胰腺类器官中，分化标志物的表达始终高于基质胶组，通过此可以确认使用pem水凝胶的胰腺类器官的长期培养可能性。
119.脱细胞胰腺组织衍生水凝胶(pem)的长期保管可能性的验证(1)(图11)
120.将脱细胞胰腺组织衍生pem溶液在-80℃冷冻和4℃冷藏条件下长时间保管后，将其解冻并用于胰腺类器官培养。将基质胶作为对照组使用，在培养第7天比较了光学显微镜图像和形成效率。
121.(a)当分别使用对照组基质胶、在类器官培养前新制备的pem水凝胶、在-80℃冷冻和4℃冷藏条件下长时间保管的pem水凝胶培养胰腺类器官时，确认了在所有基质组中类器官形成良好。
122.(b)在培养第7天比较胰腺类器官形成效率时，确认了在使用冷冻及冷藏保管2个月或4个月的pem溶液制作的水凝胶中，胰腺类器官以与在胰腺类器官培养前新制备的pem水凝胶中相似的水平形成得良好，并且在形成效率上无显著差异。
123.脱细胞胰腺组织衍生水凝胶(pem)的长期保管可能性的验证(2)(图12)
124.将脱细胞胰腺组织衍生pem溶液在-80℃冷冻和4℃冷藏条件下长时间保管后，将其解冻并用于胰腺类器官培养。将基质胶作为对照组使用，在培养第7天通过定量pcr分析比较胰腺标志物的基因表达量。
125.(a)比较在分别使用基质胶(mat)、培养前新制备的pem水凝胶、冷冻以及冷藏保管2个月或4个月的pem溶液制作的水凝胶中培养的胰腺类器官的胰腺标志物基因表达量，确认了与基质胶组相比，在pem水凝胶组中胰腺分化标志物(hnf1β、pdx1、krt19)均得以增加，与保管条件无关，无显著差异。
126.(b)为了测量在培养前新制备的pem水凝胶与长期保管的pem水凝胶的物性差异进行了流变学分析，确认了即使将pem溶液在冷藏和冷冻条件下长期保管后制作水凝胶，其物性也没有太大变化，始终维持30-40pa值。由此证实，即使长时间保管，脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶也能够无改性并稳定的维持，可用于胰腺类器官培养。
127.使用脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架的人类诱导性多能干细胞(human-induced pluripotent stem cell；hipsc)衍生胰腺类器官培养(图13)
128.为了由人类诱导性多能干细胞形成胰腺类器官，经过定形内胚层(definitive endoderm，de)、胰腺内胚层(pancreatic endoderm，pe)分化为胰腺祖细胞(pancreatic progenitor，pp)，然后封装(encapsulation)在pem水凝胶内进行3d培养。将基质胶(mat)组用作对照组。
129.(a)将人类诱导性多能干细胞衍生胰腺祖细胞培养在pem(4mg/ml)水凝胶和mat内时，确认了两组均在2天内形成了3d类器官。
130.(b)通过定量pcr(qpcr)方法比较两组中培养10天的胰腺类器官的基因表达，确认了多能性(pluripotency)标志物oct4的表达在pem组中略有减少，而胰腺分化相关标志物(foxa2、sox9、krt19、pdx1)的表达在pem组中显著增加；oct4(多能性标志物(pluripotency marker))、foxa2(胰腺β细胞分化标志物(pancreaticβ-cell differentiation marker))、sox9(胰管祖细胞标志物)、krt19(胰管标志物)、pdx1(胰腺内胚层标志物)。该结果表明，与使用基质胶培养时相比，使用pem水凝胶培养的胰腺类器官可以增强类器官的胰腺分化和成熟度。
131.使用脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架培养的人类诱导性多能干细胞(human-induced pluripotent stem cell；hipsc)衍生胰腺类器官的分析(图14)
132.对在基质胶(mat)和在脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶(4mg/ml)中培养的胰腺类器官进行了免疫染色。由人类诱导性多能干细胞分化的胰腺祖细胞制作胰腺类器官，并在类器官形成后第7天通过免疫染色进行了比较。
133.通过对胰腺特异性标志物的免疫染色，与在对照组基质胶(mat)中培养的胰腺类器官进行比较时，确认了在脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架中培养的胰腺类器官中，胰腺组织特异性标志物也以与基质胶组相似的水平表达良好；krt19(胰管标志物)、sox9(胰管祖细胞标志物)、pdx1(胰腺内胚层标志物)、nkx6.1(胰腺β-细胞分化标志物)。
134.细胞增殖标志物ki67(proliferative cell marker)的表达在两种支架(pem、基质胶)组中也以相似的水平被观察到。
135.使用脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架的人类诱导性多能干细胞(human-induced pluripotent stem cell；hipsc)衍生胰腺类器官的长期培养可能性的确认(图15)
136.在之前建立的脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架内，尝试了胰腺类器官的长期培养，并分析了胰腺特异性分化标志物的表达。将基质胶(mat)组用作对照组。
137.(a)确认了胰腺类器官即使在pem水凝胶内持续传代培养25天以上也生长良好，并且形状和大小与在基质胶中培养的胰腺类器官相似。
138.(b)确认了即使将胰腺类器官长期培养25天以上时，与基于基质胶的类器官相比，在脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架中培养的胰腺类器官中胰腺分化标志物表达增强；并确认了随着长时间培养，胰腺类器官的分化在pem水凝胶中进一步增强。
139.用于人类诱导性多能干细胞衍生胰腺类器官培养的脱细胞胰腺组织衍生pem支架的组织特异性效果的确认(图16)
140.为了确认脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架中所含的胰腺特异性细胞外基质成分在胰腺类器官培养中是否表现出组织特异性效果，进行了在其他脏器衍生脱细胞支架中培养胰腺类器官并比较的实验。在各组织衍生脱细胞支架中将胰腺类器官培养5天后比较了基因表达量。
141.(a)尝试使用心脏、胃、肠、肌肉和胰腺衍生脱细胞水凝胶进行培养，结果证实，在心脏组织衍生水凝胶中没有生成胰腺类器官，但在其他组织衍生脱细胞水凝胶中形成了类器官。
142.(b)在各脏器衍生脱细胞支架中培养5天后，通过定量pcr分析比较了胰腺类器官分化相关的基因表达量。在分析与胰管细胞分化相关的标志物sox9、krt19，与胰腺内胚层分化相关的标志物pdx1以及与胰腺祖细胞发育相关的标志物nkx6.1时，确认了在脱细胞胰腺组织衍生支架中培养的类器官中的表达水平最高。由此，确认了胰腺组织衍生脱细胞支架在胰腺类器官培养中的组织特异性效果。
143.使用脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架的胰腺癌类器官培养(图17)
144.使用脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架确认了胰腺癌类器官的培养可能性。确认了将人类来源的panc-1胰腺癌细胞系在pem水凝胶中进行三维培养时，会形成癌类器官(培养第5天进行类器官图像分析和免疫染色分析)。
145.通过光学显微镜图像分析，确认了胰腺癌类器官在基质胶和pem水凝胶中均形成良好，并且通过免疫染色检测外分泌胰腺癌中过表达的所有krt13和krt19蛋白，从而确认了胰腺癌类器官内细胞增殖活跃，胰腺癌相关标志物表达良好。
146.通过本实验，确认了脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架不仅可以培养干细胞衍生胰腺类器官，还可以培养胰腺癌类器官，从而确认了pem水凝胶能够作为用于建立胰腺癌体外模型的培养平台的要素技术而应用的可能性。
147.脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架的作为移植用材料的使用可能性(图18)
148.为了确认脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架在移植时是否会诱导免疫反应，将pem水凝胶移植到小鼠的皮下，并用一周时间确认了是否有免疫反应和炎症反应。
149.通过h&e染色与正常组织进行比较时，确认了pem水凝胶移植部位和真皮(dermis)均未发生炎症反应和免疫细胞的浸润(infiltration)，并且通过用于对移植时渗入的肥大细胞(mast cell)染色的甲苯胺蓝(toluidine blue)染色，渗入一周的肥大细胞也未被染色，由此确认了脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶在移植时不会诱导免疫反应，从而确认了作为类器官移植用材料的使用可能性。
150.使用脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架的胰腺类器官体内移植(1)(图19)
151.进行用于将脱细胞胰腺组织衍生pem水凝胶支架作为胰腺类器官移植用材料的动物实验，并进行了组织学分析。为了使胰腺类器官有效地递送并植入到小鼠急性胰腺炎模型的受损胰腺组织内，使用4mg/ml的pem水凝胶移植了1000-1200个胰腺类器官。移植时将水凝胶调节为容易注射的粘度，并且为了类器官的有效植入，将类器官与50μl的pem水凝胶一起混合并移植。
152.(a)通过腹腔注射，每1小时给药40μg/kg的雨蛙素(cerulein)，投入5次，以制作急性胰腺炎小鼠模型，并通过h&e染色确认了诱导程度。确认了与注射pbs的组相比，注射雨蛙素来诱导胰腺炎的组织中发生了细胞质空泡化(vacuolization)、免疫细胞侵袭，表现出了胰腺炎的特征。
153.(b)利用脱细胞pem水凝胶支架将胰腺类器官移植到小鼠急性胰腺炎模型中，并在移植的第1周和第2周通过h&e染色观察了植入和组织再生与否。确认了移植到胰腺组织表面的类器官植入良好，由于移植的类器官的生长，相比第1周，第2周的移植面积变大，并且与现有组织的整合进行得更好。
154.使用脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架的胰腺类器官体内移植(2)(图20)
155.利用脱细胞pem水凝胶支架将用dii荧光试剂标记的胰腺类器官移植到小鼠急性胰腺炎模型中，并在移植1周后通过荧光表达观察是否植入。确认了移植到受损胰腺组织部位的胰腺类器官在1周内良好地植入并存在。此外，当同时染色胰管(pancreatic duct)细胞标志物krt19时，确认了具有胰管特征的胰腺类器官与周围胰腺组织的胰管部一同使krt19标志物良好地表达。在未移植的组织中未观察到dii荧光。
156.从上述结果可知，pem水凝胶不仅可以应用于胰腺类器官的培养，还可以作为体内移植用材料来应用。
157.使用脱细胞胰腺组织衍生水凝胶支架的胰腺类器官体内移植(3)(图21)
158.利用脱细胞pem水凝胶支架将用dii荧光试剂标记的胰腺类器官移植到小鼠急性胰腺炎模型中，并在移植2周后通过荧光表达观察是否植入。确认了移植到受损胰腺组织部
位的胰腺类器官在2周内植入良好并存在。此外，当同时染色胰管(pancreatic duct)细胞标志物krt19时，确认了具有胰管特征的胰腺类器官与周围胰腺组织的胰管部一同使krt19标志物良好地表达。在未移植的组织中未观察到dii荧光。
159.上述结果表明，pem水凝胶不仅可以应用于胰腺类器官的培养，还可以作为体内移植用材料来应用。
160.以上对本发明的描述是为了举例，本发明所属领域的普通技术人员可以理解，在不改变本发明的技术思想或必要特征的情况下，可以很容易地将其修改为其他具体形态。因此，应当理解，上述实施例在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。

技术特征：
1.一种用于胰腺类器官培养和移植的支架，其包括胰腺组织衍生细胞外基质。2.根据权利要求1中所述的支架，其特征在于，所述胰腺组织衍生细胞外基质是通过对胰腺组织使用曲拉通x-100和氢氧化铵的混合溶液进行处理而脱细胞的。3.根据权利要求1中所述的支架，其特征在于，所述支架中所述胰腺组织衍生细胞外基质的浓度为1mg/ml至10mg/ml。4.一种用于胰腺类器官培养和移植的支架的制备方法，其包括：步骤1)，将分离的胰腺组织进行破碎；以及步骤2)，对破碎的所述胰腺组织使用曲拉通x-100和氢氧化铵进行处理而脱细胞，以制备脱细胞胰腺组织衍生细胞外基质。5.根据权利要求4中所述的用于胰腺类器官培养和移植的支架的制备方法，其特征在于，在所述步骤2)之后，还包括：步骤3)，将所述脱细胞胰腺组织衍生细胞外基质冷冻干燥，以制备冷冻干燥的胰腺组织衍生细胞外基质。6.根据权利要求5中所述的用于胰腺类器官培养和移植的支架的制备方法，其特征在于，在所述步骤3)之后，还包括：步骤4)，使所述冷冻干燥的胰腺组织衍生细胞外基质形成为水凝胶形态的用于胰腺类器官培养和移植的支架。7.根据权利要求6中所述的用于胰腺类器官培养和移植的支架的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中将所述冷冻干燥的胰腺组织衍生细胞外基质溶解在胃蛋白酶溶液中进行溶液化后，调节ph进行水凝胶化。8.一种在支架中培养胰腺类器官的方法，在根据权利要求1所述的支架或根据权利要求4所述的制备方法制备的支架中进行培养。

技术总结
本发明涉及使用脱细胞胰腺组织(Pancreas Extracellular Matrix；PEM)的用于胰腺类器官培养和移植的支架。培养和移植的支架。培养和移植的支架。


技术研发人员：赵胜禹 金洙谦 崔利鲜
受保护的技术使用者：赛拉尔研究有限公司
技术研发日：2021.11.17
技术公布日：2023/8/6