使用抗体进行的细胞表面MICA和MICB检测的制作方法

使用抗体进行的细胞表面mica和micb检测
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年8月10日提交的美国临时申请号63/063,475的权益；该美国临时申请全文以引用方式并入本文；包括任何附图。
3.对序列表的引用
4.本技术连同电子格式的序列表一起提交。该序列表以2021年8月4日创建、大小为19kb且名称为“mica4_st25”的文件的形式提供。该序列表的电子格式中的信息全部以引用方式并入本文。
技术领域
5.本发明涉及用于检测石蜡包埋组织样品中的感兴趣的蛋白质的研究和诊断工具。本发明还涉及使用所述工具特别是在肿瘤组织中检测多肽的方法。


背景技术：

6.mica(主要组织相容性复合物i类相关链a)和micb(主要组织相容性复合物i类相关链b)是受感染细胞和肿瘤细胞上的应激信号诱导的跨膜蛋白。mica是nkg2d(自然杀伤细胞2族成员d)的配体，而nkg2d是自然杀伤(nk)细胞和γδt细胞亚群上表达的活化型受体。mica与nkg2d之间的相互作用引起介导靶细胞裂解的效应细胞的活化。然而，mica蛋白质在肿瘤微环境中会在金属蛋白酶作用下发生脱落，并且大量可溶性mica与患有各种癌的患者的外周淋巴细胞上的nkg2d下调相关联。除了可溶性mica之外，膜结合mica还能高度有效地下调nkg2d。这些机制允许肿瘤逃避免疫系统的控制。
7.已报道许多肿瘤类型可表达和/或脱落mica。还已报道肿瘤可表达micb。用于检测或诊断用途的抗体通常聚焦于可溶性(脱落)mica而非细胞结合mica的检测。然而，通过基于抗体的方法来评估细胞结合mica和/或micb也可能有价值。这是因为细胞结合mica和/或micb的评估优选地通过蛋白质的直接检测来进行，原因在于由于调控mica/b mrna的过程很复杂，这些转录物的定量不能预测细胞表面处表达的对应蛋白质的量(raulet等人，《2013免疫学年评》(2013annu.rev.immunol.)，2013；31:413-441)。
8.需要新的癌治疗方法，所述方法能够更特异性地利用免疫系统靶向癌细胞，并因此避免传统化学治疗剂特有的副作用。为了更好理解肿瘤环境，通常期望检测存在于肿瘤组织中和/或肿瘤外周处或者附近组织中的感兴趣的蛋白质。这可例如使用冷冻组织样品进行。这不仅在研究中有用，而且还可帮助决定要使用什么类型的治疗，例如通过检测组织(例如，肿瘤环境)是否以存在作为治疗(例如，免疫疗法)的靶标的蛋白质为特征。为了选择能够调节该蛋白质和/或表达该蛋白质的细胞的活性的治疗，该信息可能有价值。
9.除了冷冻组织之外，还可从已保存为甲醛(例如，福尔马林)固定石蜡包埋(ffpe)样品的组织样品检测标记物。脱蜡后，玻片适于例如免疫组织化学方法以检测特异性蛋白质的表达。所述方法常规地用于检测肿瘤组织样品中的肿瘤抗原。遗憾的是，通常不可能找到有效起作用并在ffpe切片中具有特异性的单克隆抗体。据信这是由于福尔马林固定对蛋
白质结构的影响。重组蛋白或细胞上由被描述为具有特异性的抗体结合的表位在用于ffpe中时通常存在于其他蛋白质上，从而使这些抗体是非特异性的。在其他情况下，天然细胞蛋白上的许多表位因福尔马林固定而被破坏，从而使得使用重组蛋白或细胞鉴别的抗体对于染色ffpe切片无效。因此，许多受体不适于生成在石蜡包埋切片中特异性地结合的配体(例如，在福尔马林固定后不再有任何特异性表位)。
10.需要改进的诊断方法和工具，例如以便鉴别最适用于给定患者的治疗。


技术实现要素：

11.本发明尤其涉及组织样品、特别是ffpe组织样品中的细胞表面mica和micb蛋白质的研究、检测和/或监测。本公开源于用于检测人类肿瘤样品上的mica和micb蛋白质的方法的开发。具体地，通过开发能够检测ffpe组织样品中的低水平mica*001、mica*008和micb(包括在仅考虑膜或细胞表面表达时可能存在的更低水平)的高度特异性测试方法。申请人提供了在ffpe组织样品中对许多肿瘤的mica和micb(例如，mica和micb的组合)的染色。ffpe样品中的染色，特别是需要检测低水平蛋白质的能力的膜或细胞表面染色，可能对于鉴别适用于用耗竭性抗mica剂治疗的肿瘤特别有用。
12.这些抗体在ffpe方案中保持对mica和micb多肽的特异性，尤其是它们结合存在于mica和micb多肽上的表位，该表位在福尔马林固定后仍然存在并具有特异性。还进一步地，对于人类群体中的两个高优势mica等位基因mica*001和*008而言，mica多肽上的表位在福尔马林固定后仍然存在并具有特异性。这些抗体在ihc方案中允许抗原检测的高特异性。通过利用使用由在其表面处具有抗体结合靶抗原的细胞(与针对靶抗原的治疗性抗体一起预温育的表达靶抗原的细胞)生成的石蜡包埋细胞团块的抗体制备方法，本发明人获得了识别ffpe材料中的抗原特异性表位、同时能够识别多个mica等位基因和另外micb的抗体。所得诊断抗体可充当用于患者ffpe样品中的靶抗原的一致检测的基于单抗体的通用组合物、试剂盒、体系或方法。可使用这些试剂而不必使用附加多种等位基因特异性抗体来检测组织样品中的mica。可使用这些试剂来检测具有相对较低水平mica和/或micb的表达mica和/或micb的肿瘤。由于肿瘤组织中的恶性细胞可表达mica和/或micb，因此这些试剂可提供检测对mica和micb中的至少一者呈阳性的肿瘤的增加的灵敏度，并且还可进一步提供鉴别可受益于用结合mica和micb剂的治疗剂(例如，nkg2a蛋白质或片段、抗mica/b抗体)治疗的受试者的增强的能力。可使用这些试剂来检测肿瘤细胞的细胞表面或细胞膜处的mica和/或micb(例如，其中与胞质蛋白也包括在该评估中时相比，mica和/或micb的水平更低)。可使用这些试剂来选择或鉴别个体，然后这些个体可用任何合适的抗mica抗体治疗，包括mica等位基因特异性治疗性抗体以及可识别超过一种mica等位基因(例如人类群体中两种或更多种最常见mica等位基因，诸如mica*001和*008)的mica等位基因泛特异性治疗性抗体。
13.甲醛固定(例如，福尔马林固定、多聚甲醛固定)、石蜡包埋(ffpe)组织提供优于其他免疫学方法的两个主要优点：(1)该组织不需要特殊处理；以及(2)充分认知到细胞学和构造特征，从而允许改进组织病理学解释。在本文示例中，在细胞表面处具有不同mica等位基因的细胞、在细胞表面处具有micb的细胞以及具有不同组合表达水平的mica或micb多肽的细胞各自单独地被福尔马林固定并制备为石蜡包埋(ffpe)样品。这些样品的使用使得可发现用于人类ffpe组织样品中的mica染色和研究的抗mica抗体，这些抗mica抗体可用作跨
人类群体的单种试剂，而且适用于检测ffpe样品中的细胞上(例如肿瘤细胞或更通常肿瘤组织中的细胞的表面处)更低水平的组合mica和micb表达。在来自人类供体的多种肿瘤组织中测试了所得抗体，并且发现这些抗体在检测ffpe组织切片中的靶抗原方面保持优异性能。如图所示，当与不始终能够检测ffpe样品中的细胞上更低水平的组合mica和micb表达的比较抗体进行比较时，对于使用比较抗体检测出细胞表面处mica或micb呈阴性的肿瘤类型而言，本公开的抗体能够将组织样品鉴别为细胞表面处mica和/或micb呈阳性(膜染色)。因此该抗体具有允许在个体的ffpe样品中检测更宽范围的mica和/或micb阳性肿瘤的优点，继而允许用mica和/或micb靶向剂(例如，抗mica和/或抗micb耗竭剂)治疗患有mica和/或micb阳性肿瘤的个体。
14.在一个实施方案中，本公开提供了产生特异性地结合石蜡包埋组织中的mica和micb多肽的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供多个候选抗体；以及b)从所述多个中制备或选择特异性地结合由被制备为石蜡包埋细胞样品的细胞表达的mica和micb多肽的抗体(例如，与被制备为石蜡包埋细胞样品的不表达mica或micb多肽的细胞相比)。
15.在一个实施方案中，本公开提供了产生特异性地结合石蜡包埋组织中的mica和micb多肽的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
16.a)提供在其表面处表达mica多肽(例如，并且不表达micb多肽)的细胞并且由此类细胞制备石蜡包埋细胞样品；
17.b)提供在其表面处表达micb多肽(例如，并且不表达mica多肽)的细胞并且由此类细胞制备石蜡包埋细胞样品；以及
18.c)提供多个候选抗体并且从所述多个中制备或选择(i)结合步骤a)的石蜡包埋细胞样品中的mica多肽并(ii)结合步骤b)的石蜡包埋细胞样品中的micb多肽的抗体，任选地所述抗体不结合由缺乏mica多肽和micb多肽的表达的细胞制备的石蜡包埋细胞样品。
19.在一个实施方案中，本公开提供了产生特异性地结合石蜡包埋组织中的mica和micb多肽的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
20.a)提供在其表面处表达mica(例如，mica*001或mica*008)多肽的第一等位基因(例如，将所述第一等位基因表达为唯一mica多肽并且不表达micb多肽)的细胞并且由此类细胞制备石蜡包埋细胞样品；
21.b)提供在其表面处表达与第一等位基因不同的mica的第二等位基因的细胞(例如，这些细胞将第二等位基因表达为唯一mica多肽并且不表达micb多肽)并且由此类细胞制备石蜡包埋细胞样品；
22.c)提供在其表面处表达micb多肽(例如，并且不表达mica多肽)的细胞并且由此类细胞制备石蜡包埋细胞样品；以及
23.d)提供多个候选抗体并且从所述多个抗体中制备或选择(i)结合步骤a)的石蜡包埋细胞样品中的第一mica等位基因多肽、(ii)结合步骤b)的石蜡包埋细胞样品中的第二mica等位基因多肽并(iii)结合步骤c)的石蜡包埋细胞样品中的micb多肽的抗体，任选地所述抗体不结合由缺乏第一mica等位基因多肽和第二mica等位基因多肽以及micb多肽的表达的细胞制备的石蜡包埋细胞样品。任选地，步骤(d)包括：提供多个候选抗体并且从所述多个抗体中制备或选择(i)结合步骤a)的石蜡包埋细胞样品中的mica*001多肽、(ii)结合步骤b)的石蜡包埋细胞样品中的mica*008多肽并(iii)结合步骤c)的石蜡包埋细胞样品
中的micb多肽的抗体，任选地所述抗体不结合由缺乏mica*001多肽、mica*001多肽和micb多肽的表达的细胞制备的石蜡包埋细胞样品。
24.在一个方面，提供了由本公开的抗体产生方法获得的特异性地结合石蜡包埋组织中的mica和micb多肽的抗体或抗体片段。在一个方面，提供了使用由本公开的抗体产生方法获得的抗体来检测福尔马林处理和/或石蜡包埋组织样品中的mica和/或micb(例如，表达mica和/或micb的细胞)的方法。
25.在一个方面，提供了在福尔马林处理和/或石蜡包埋组织样品、任选地肿瘤或肿瘤旁组织样品、任选地取自既往已接受治疗剂(例如，化学治疗剂)治疗的个体的样品中检测mica和/或micb(例如，表达mica和/或micb的细胞)的方法，该方法包括以下步骤：a)使组织样品与抗mica/b抗体(例如，本公开的诊断抗体)接触；以及b)检测组织样品中结合抗体的存在。如果检测到mica和/或micb，则该样品可被确定为包含mica/b(例如，表达mica的细胞、表达micb的肿瘤细胞、表达mica和micb的细胞)。
26.在一个实施方案中，本公开提供了在取自人类肿瘤的样品中检测表达mica/b的细胞(例如，在其表面或细胞膜处表达mica和/或micb的细胞)的方法，该方法包括使取自个体的石蜡包埋肿瘤组织样品与能够特异性地结合石蜡包埋肿瘤组织样品中的人类mica和micb多肽的抗体接触；以及检测切片内结合抗体的存在，任选地进一步检测该抗体对细胞膜(细胞表面)的染色。
27.在任何实施方案中，该抗体能够特异性地结合石蜡包埋肿瘤组织样品中的人类mica和micb多肽，可被表征为能够结合和/或染色已被制备为石蜡包埋细胞团块的bxpc-3细胞；任选地其中该抗体或抗体片段能够在该抗体以低浓度(1μg/ml)提供时结合和/或染色已被制备为石蜡包埋细胞团块的bxpc-3细胞，任选地进一步其中该抗体或抗体片段能够在每种低浓度(1μg/ml)、中等浓度(5μg/ml)和高浓度(10μg/ml)抗体下结合和/或染色已被制备为石蜡包埋细胞团块的bxpc-3细胞。任选地，该抗体或抗体片段能够始终结合和/或染色石蜡包埋bxpc-3细胞，例如当该测试重复多次(例如，10次、20次、100次或更多次)时，每次都观察到该结合和/或染色。
28.在一个实施方案中，能够特异性地结合石蜡包埋肿瘤组织样品中的人类mica和micb多肽的抗体是抗体12c9、具有其重链可变区和轻链可变区的抗体或任何前述抗体的功能保守变体。
29.在一个实施方案中，该抗体与包含具有seq id no:7的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no:8的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争性地结合石蜡包埋细胞样品中的人类mica和/或micb多肽(例如，被制备为石蜡包埋细胞样品的表达mica和/或micb的细胞)。
30.在一个方面，提供了能够特异性地结合人类mica和/或micb多肽(例如，已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica的细胞的样品中的mica和/或micb多肽)的抗体或抗体片段，其中该抗体或抗体片段包含具有与seq id no:7的氨基酸序列有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的重链可变区和具有与seq id no:8的氨基酸序列有至少70％、80％或90％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
31.在一个实施方案中，提供了包含具有seq id no:7的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no:8的氨基酸序列的轻链可变区的抗体或抗体片段或者其功能保守变体。
32.在一个方面，提供了能够特异性地结合人类mica和/或micb多肽(例如，已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica的细胞的样品中的mica和/或micb多肽)的抗体或抗体片段，其中该抗体或抗体片段包含seq id no:7的重链可变区序列的三个cdr和seq id no:8的轻链可变区序列的三个cdr。在一个实施方案中，该抗体或抗体片段与可检测部分缀合或共价结合。在一个实施方案中，该抗体或抗体片段结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica的细胞的样品中的mica多肽，并且结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达micb的细胞的样品中的micb多肽，但不结合mica阴性和micb阴性并已被制备为石蜡包埋细胞团块的细胞。
33.在任何实施方案中，抗体或抗体片段可被表征为还能够结合人类mica*004多肽和/或人类mica*007多肽，例如该抗体或抗体片段结合石蜡包埋细胞样品中的mica*004和/或mica*007多肽。
34.在任何实施方案中，检测表达mica/b的细胞包括以下步骤：
35.●
获得包含细胞(例如，肿瘤细胞、表达mica和/或micb的细胞)的生物样品(例如，作为活检样品、作为细胞团块)；
36.●
对所述样品进行固定、包埋于石蜡中并脱蜡，并且任选地将所述样品转移到玻片；
37.●
使所述切片与特异性地结合人类mica和micb多肽的抗体接触；
38.以及
39.●
检测所述切片内结合抗体的存在。
40.在其他实施方案中，提供了用于制备或产生抗体的方法。在其他实施方案中，提供了试剂盒，所述试剂盒包含结合石蜡包埋细胞样品中的抗原并具有本文所公开的特征的单克隆抗体(诊断抗体)以及能够特异性地结合与诊断抗体相同的靶抗原的第二抗体(例如，治疗性抗体)。在某些实施方案中，提供了具有本文所公开的特征的单克隆抗体在免疫组织化学测定法中(包括但不限于结合人类mica和micb多肽的抗体和抗体片段)、在诊断方法中(包括但不限于在伴随诊断中，例如选择要用治疗性抗体治疗的个体的用途)、在预后方法中、在患者监测方法中的用途。
具体实施方式
41.定义
42.如本说明书中所用，“一个”或“一种”可意指一个(种)或多个(种)。如权利要求中所用，当与词语“包含”结合使用时，词语“一个”或“一种”可意指一个(种)或超过一个(种)。
43.在使用“包含”的情况下，这可任选地被替代为“基本上由...组成”，更任选地被替代为“由...组成”。
44.如本文所用，“石蜡包埋样品”(或石蜡包埋“细胞”、“细胞团块”、“玻片”或“组织”)是指取自生物体或体外细胞培养物的已被固定、包埋于石蜡中、切片、脱蜡并转移到玻片的细胞或组织。应当理解，固定和石蜡包埋是习惯作法，其在许多方面(例如关于所使用的固定和包埋方法、关于遵循的方案等)可变化，并且出于本发明的目的，涵盖任何此类变型方法，只要其涉及组织的固定(诸如通过福尔马林处理)、包埋于石蜡或等同材料中、切片并转移到玻片即可。
45.如本文所用，术语“生物样品”或“样品”包括但不限于生物流体(例如血清、淋巴、血液)、细胞样品或组织样品(例如骨髓或组织活检样品诸如皮肤、乳腺、肺、结肠、卵巢、胃、粘膜组织诸如取自肠道、肠道固有层)。
46.本文的术语“抗体”以最广泛的意义使用并且具体地包括全长单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及抗体片段和衍生物，只要它们表现出期望的生物活性即可。例如harlow等人，《抗体：实验室手册》(antibodies:a laboratory manual)，冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press)，冷泉港(cold spring harbor)，纽约(n.y.)，(1988)中提供了与抗体产生相关的各种技术。“抗体片段”包括全长抗体的一部分，例如其抗原结合区或可变区。抗体片段的示例包括fab、fab'、f(ab)2、f(ab’)2、f(ab)3、fv(通常为抗体的单臂的vl和vh结构域)、单链fv(scfv)、dsfv、fd片段(通常为vh和ch1结构域)和dab(通常为vh结构域)片段；vh、vl、vhh和v-nar结构域；微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体和κ抗体(参见例如ill等人，《蛋白质工程》(protein eng)，1997；10:949-57)；骆驼igg；ignar；以及由抗体片段和一个或多个分离的cdr或功能互补位形成的多特异性抗体片段，其中分离的cdr或抗原结合残基或多肽可缔合或连接在一起而形成功能抗体片段。各种类型的抗体片段已在例如holliger和hudson，《自然-生物技术》(nat biotechnol)，2005；23，1126-1136；wo2005040219以及公布的美国专利申请20050238646和20020161201中描述或综述。
47.术语“高变区”在本文中使用时是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“cdr”的氨基酸残基(例如，轻链可变结构域中的残基24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)以及重链可变结构域中的31-35(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)；kabat等人，1991)和/或来自“高变环”的那些残基(例如，轻链可变结构域中的残基26-32(l1)、50-52(l2)和91-96(l3)以及重链可变结构域中的26-32(h1)、53-55(h2)和96-101(h3)；chothia和lesk，《分子生物学杂志》(j.mol.biol)，1987；196:901-917)。通常，该区域中的氨基酸残基的编号通过kabat等人，出处同上中所述的方法执行。诸如“kabat位置”、“如kabat中的可变结构域残基编号”和“根据kabat”之类的短语在本文中是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的该编号系统。使用kabat编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可包含与可变结构域的fr或cdr的缩短或向其中的插入相对应的更少或附加氨基酸。例如，重链可变结构域可包含在cdr h2的残基52之后的单氨基酸插入(根据kabat的残基52a)和在重链fr残基82之后插入的残基(例如，根据kabat的残基82a、82b和82c等)。可通过在同源性区域处对给定抗体的序列与“标准”kabat编号序列进行比对来确定该抗体的残基的kabat编号。任一定义应用于指抗体的cdr或其变体均旨在位于如本文所定义和使用的术语的范围内。下表1中列出了涵盖如常用编号方案所定义的cdr的适当氨基酸残基作为比较。涵盖特定cdr的确切残基号将根据cdr的序列和大小而变化。在考虑到该抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可常规地确定哪些残基构成特定cdr。
48.表1
49.cdrkabatchotiaabmhcdr131-3526-3226-35hcdr250-6552-5850-58hcdr395-10295-10295-102
vcdr124-3426-3224-34vcdr260-5650-5250-56vcdr389-9791-9689-97
50.如本文所用，所谓“骨架”或“fr”残基意指除被定义为cdr的那些区域之外的抗体可变结构域的区域。每个抗体可变结构域骨架可被进一步细分为由这些cdr分开的连续区域(fr1、fr2、fr3和fr4)。
51.如本文所定义，所谓“恒定区”意指由轻链或重链免疫球蛋白恒定区基因编码的抗体衍生恒定区。如本文所用，所谓“恒定轻链”或“轻链恒定区”意指由κ(cκ)或λ(cλ)轻链编码的抗体的区域。恒定轻链通常包含单个结构域，并且如本文所定义，是指cκ的位置108-214或cλ，其中编号根据eu索引(kabat等人，1991，《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(sequences of proteins of immunological interest)，第5版，美国公共卫生署(united states public health service)，国立卫生研究院(national institutes of health)，贝塞斯达(bethesda))。如本文所用，所谓“恒定重链”或“重链恒定区”意指由μ、δ、γ、α或ε基因编码的抗体的区域以将抗体的同种型分别定义为igm、igd、igg、iga或ige。对于全长igg抗体而言，如本文所定义的恒定重链是指ch1结构域的n端到ch3结构域的c端，因此包含位置118-447，其中编号根据eu索引。
52.如本文所用，所谓“fab”或“fab区域”意指包含vh、ch1、vl和cl免疫球蛋白结构域的多肽。fab可孤立地指该区域，或指在多肽、多特异性多肽或abd的背景下的该区域，或如本文所概述的任何其他实施方案。
53.如本文所用，所谓“单链fv”或“scfv”意指包含抗体的vh和vl结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。一般来讲，fv多肽还包含vh和vl结构域之间的多肽接头，该多肽接头使scfv能够形成用于抗原结合的期望结构。用于产生scfv的方法在本领域中是熟知的。有关用于产生scfv的方法的综述，参见pluckthun，《单克隆抗体的药理学》(the pharmacology of monoclonal antibodies)，第113卷，rosenburg和moore编辑，施普林格出版社(springer-verlag)，纽约(new york)，第269-315页(1994)。
54.如本文所用，所谓“fv”或“fv片段”或“fv区域”意指包含单一抗体的vl和vh结构域的多肽。
55.如本文所用，所谓“fc”或“fc区域”意指包含将第一恒定区免疫球蛋白结构域排除在外的抗体的恒定区的多肽。因此fc是指iga、igd和igg的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，及ige和igm的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，及这些结构域n端的柔性铰链。对于iga和igm而言，fc可包含j链。对于igg而言，fc包含免疫球蛋白结构域cγ2(ch2)和cγ3(ch3)及cγ1与cγ2之间的铰链。尽管fc区的边界可改变，但是人类igg重链fc区通常被定义为包含残基c226、p230或a231到其羧基端，其中该编号根据eu索引。fc可孤立地指该区域，或指fc多肽的背景下的该区域，如下所述。如本文所用，所谓“fc多肽”或“fc衍生多肽”意指包含全部或部分fc区的多肽。fc多肽包括但不限于抗体、fc融合体和fc片段。
56.如本文所用，所谓“可变区”意指包含基本上由分别构成轻链(包括κ和λ)和重链免疫球蛋白基因座的vl(包括vκ(vk)和vλ)和/或vh基因中的任一者编码的一个或多个ig结构域的抗体的区域。轻链或重链可变区(vl或vh)由被称为“互补决定区”或“cdr”的三个高变区中断的“骨架”或“fr”区组成。骨架区和cdr的范围已如kabat(参见“免疫学感兴趣的蛋白
质的序列(sequences of proteins of immunological interest)”，e.kabat等人，美国卫生与公众服务部(u.s.department of health and human services)，(1983))中及如chothia中精确定义。抗体的骨架区(即，成分轻链和重链的组合骨架区)用于定位并对齐主要负责结合抗原的cdr。
57.相对于表达mica和/或micb的细胞而言的术语“耗竭”意指可杀伤、消除、裂解或诱导此类杀伤、消除或裂解以负面影响存在于样品或受试者中的表达mica和/或micb的细胞的数量的过程、方法或试剂。试剂可例如包括结合mica和/或micb并且引导adcc(抗体依赖性细胞毒性)朝向表达mica和/或micb的细胞的抗体，或该试剂可为结合mica并且直接通过将其细胞毒剂递送至细胞来引起表达mica和/或micb的细胞的死亡的抗体药物缀合物。
58.术语“免疫缀合物”和“抗体缀合物”可互换使用并且是指抗原结合剂，例如抗体结合蛋白或与另一部分(例如，细胞毒剂)缀合的抗体。包含与细胞毒剂缀合的抗原结合剂的免疫缀合物也可称为“抗体药物缀合物”或“adc”。
59.术语“试剂(agent)”在本文中用于表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制备的提取物。术语“治疗剂”是指具有生物活性的试剂。
60.术语“特异性地结合”意指在竞争性结合测定法中抗体或多肽可优先结合结合伴侣，例如mica和micb，如使用这些蛋白质的重组形式、其中的表位或存在于分离的靶细胞的表面上的天然蛋白质来评估的。竞争性结合测定法和其他用于确定特异性结合的方法在下文进一步描述并且是本领域中熟知的。
61.当抗体或多肽被称为与特定单克隆抗体“竞争”时，这意指在使用适当靶分子或表面表达的靶分子(例如由石蜡包埋细胞团块中的细胞表达的mica)的结合测定法中该抗体或多肽与该单克隆抗体竞争。例如，如果测试抗体在结合测定法中减少12c9与mica多肽或表达mica的细胞的结合，则该抗体被称为“与12c9竞争”。
[0062]“功能保守变体”是在不更改多肽的整体构象和功能的情况下改变了蛋白质或酶中的给定氨基酸残基的那些变体，包括但不限于将氨基酸替换为具有类似特性(诸如极性、氢键势能、酸性、碱性、疏水、芳族等)的氨基酸。除被指示为保守的那些氨基酸之外的氨基酸在蛋白质中可不同，使得类似功能的任何两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似度百分比可变化并且可为例如70％至99％，如根据比对方案(诸如通过聚类方法(cluster method))确定，其中相似度基于megalign算法。“功能保守变体”还包括与和其进行比较的天然或亲本蛋白质(例如，重链或轻链或其可变区)具有至少60％、优选地至少75％、更优选地至少85％、还优选地至少90％并且甚至更优选地至少95％的氨基酸同一性(如通过blast或fasta算法确定)，并且具有相同或基本上类似的特性或功能的多肽。
[0063]
如本文所用，术语“亲和力”意指抗体或多肽与表位的结合强度。抗体的亲和力由被定义为[ab]x[ag]/[ab-ag]的解离常数kd给定，其中[ab-ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[ab]是未结合抗体的摩尔浓度，并且[ag]是未结合抗原的摩尔浓度。亲和常数ka由1/kd定义。用于确定mab亲和力的优选方法可见于harlow等人，《抗体：实验室手册》(antibodies:a laboratory manual)，冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press)，冷泉港(cold spring harbor)，纽约(n.y.)，1988)，coligan等人编辑，《当代免疫学方案》(current protocols in immunology)，格林出版联合公司(greene publishing assoc.)和威利跨学科出版社(wiley interscience)，纽约(n.y.)，(1992、
1993)，以及muller，《酶学方法》(meth.enzymol.)，92:589-601(1983)，这些参考文献全文以引用方式并入本文。本领域中熟知的用于确定mab亲和力的一种优选的标准方法是使用表面等离子共振(spr)筛选(诸如通过用biacore
tm
spr分析设备分析)。
[0064]
术语“表位”是指抗原决定簇，并且是抗体或多肽结合的抗原上的区域或区。蛋白质表位可包含直接参与结合的氨基酸残基以及被特异性抗原结合抗体或肽有效封闭的氨基酸残基，即，抗体的“足迹”内的氨基酸残基。其是可与例如抗体或受体组合的复合抗原分子上的最简单形式或最小结构区域。表位可为线性的或构象/结构的。术语“线性表位”被定义为由线性氨基酸序列上连续的氨基酸残基构成的表位(一级结构)。术语“构象或结构表位”被定义为由并不都连续并因此代表通过分子折叠而彼此接近的线性氨基酸序列的分开部分的氨基酸残基构成的表位(二级、三级和/或四级结构)。构象表位取决于三维结构。因此术语“构象”通常可与“结构”互换使用。
[0065]
所谓“氨基酸修饰”在本文中意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。氨基酸修饰在本文中的一个示例是取代。所谓“氨基酸修饰”在本文中意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。所谓“氨基酸取代”或“取代”在本文中意指蛋白质序列中的给定位置处的氨基酸替换为另一氨基酸。例如，取代y50w是指亲本多肽的变体，其中位置50处的酪氨酸被替换为色氨酸。多肽的“变体”是指具有与参考多肽(通常为天然或“亲本”多肽)基本上相同的氨基酸序列的多肽。多肽变体在天然氨基酸序列内的某些位置处可具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。
[0066]“保守”氨基酸取代是氨基酸残基被替换为具有类似物理化学特性的侧链的氨基酸残基的那些取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中是已知的，并且包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
[0067]
术语“同一性”或“相同”在两个或更多个多肽的序列之间的关系中使用时是指多肽之间的序列相关性的程度，如通过两个或更多个氨基酸残基的链之间的匹配数所确定。“同一性”度量通过特定数学模型或计算机程序(即，“算法”)解决的具有空位对齐(如果有的话)的两个或更多个序列中的更小序列之间的相同匹配的百分比。可易于通过已知方法计算相关多肽的同一性。此类方法包括但不限于以下文献中描述的那些：《计算分子生物学》(computational molecular biology)，lesk,a.m.编辑，牛津大学出版社(oxford university press)，纽约(new york)，1988；《生物计算：信息学和基因组计划》(biocomputing:informatics and genome projects)，smith,d.w.编辑，学术出版社(academic press)，纽约(new york)，1993；《序列数据的计算机分析第1部分》(computer analysis of sequence data,part 1)，griffin,a.m.和griffin,h.g.编辑，胡马纳出版社(humana press)，新泽西州(new jersey)，1994；《分子生物学中的序列分析》(sequence analysis in molecular biology)，von heinje,g.，学术出版社(academic press)，1987；《序列分析引物》(sequence analysis primer)，gribskov,m.和devereux,j.编辑，m.斯托克顿出版社(m.stockton press)，纽约(new york)，1991；以及carillo等人，《工业和应用
数学会应用数学杂志》(siam j.applied math.)，48，1073(1988)。
[0068]
用于确定同一性的优选方法被设计为给出所测试的序列之间的最大匹配。确定同一性的方法在公开可用的计算机程序中有所描述。用于确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括gcg程序包，包括gap(devereux等人，《核酸研究》(nucl.acid.res.)，12，387(1984)；威斯康星大学遗传学计算机小组(genetics computer group,university of wisconsin)，威斯康星州麦迪逊(madison,wis.))、blastp、blastn和fasta(altschul等人，《分子生物学杂志》(j.mol.biol.)，215，403-410(1990))。blastx程序可从美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information，ncbi)和其他来源(《blast手册》(blast manual)，altschul等人，ncb/nlm/nih贝塞斯达(bethesda)，马里兰州(md.)20894；altschul等人，出处同上)公开获得。熟知的smith waterman算法也可用于确定同一性。
[0069]“分离的”分子是这样的分子，其是发现该分子的组合物中相对于该分子所属于的分子类别而言主要的物质(即，其构成该组合物中的该分子类型的至少约50％并且通常将构成该组合物中的该分子物质(例如肽)的至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多)。通常，多肽的组合物对于该组合物中的所有存在的肽物质的背景下的多肽或至少相对于所提议用途的背景下的基本上活性的肽物质将表现出98％、98％或99％同源性。
[0070]
在本文的上下文中，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指预防、缓解、管理、治愈或减轻疾病或障碍的一种或多种症状或临床相关表现，除非与上下文相矛盾。例如，尚未鉴别出疾病或障碍的症状或临床相关表现的患者的“治疗”是预防或预防性疗法，而已鉴别出疾病或障碍的症状或临床相关表现的患者的“治疗”通常不构成预防或预防性疗法。
[0071]
每当在该整篇说明书内参考抗mica结合剂(例如，抗mica/micb抗体)提及“癌的治疗”等时，都意指：(a)癌治疗方法，所述方法包括以下步骤：将抗mica结合剂(优选地在药学上可接受的载体材料中)以允许癌治疗的剂量(治疗有效量)、优选地以如本文所指定的剂量(量)施用(以进行至少一次治疗)给需要此类治疗的个体、哺乳动物，尤其是人类；(b)抗mica结合剂用于癌治疗的用途，或用于所述治疗(尤其是在人类中)的抗mica结合剂；(c)抗mica结合剂用于制造癌治疗用药物制剂的用途、使用抗mica结合剂制造癌治疗用药物制剂的方法(包括将抗mica结合剂与药学上可接受的载体混合)或包含适于癌治疗的有效剂量的抗mica结合剂的药物制剂；或(d)根据容许在提交本技术的国家取得专利授权的主题的a)、b)和c)的任何组合。
[0072]
用于检测mica和micb的抗体
[0073]
mica(perb11.1)是指mhc i类多肽相关序列a(参见例如uniprotkb/swiss-prot q29983)、其基因和cdna及其基因产物或它们的天然存在的变体。mica基因和蛋白质的命名连同对不同等位基因的序列的登录号的引用一起描述于frigoul a.和lefranc,m-p.，《人类遗传学近期研究进展》(recent res.devel.human genet.)，3(2005):95-145isbn:81-7736-244-5中，该文献的公开内容以引用方式并入本文。mica基因和蛋白质序列(包括蛋白质和dna水平的多态性)也可从由英国癌症研究所(cancer research uk)和欧洲生物信息研究所(european bioinformatics institute，ebi)维护的http://www.ebi.ac.uk/ipd/
imgt/hla/align.html获得。
[0074]
mica的氨基酸序列最初描述于bahram等人(1994)，《美国国家科学院院刊》(proc.nat.acad.sci.)，91:6259-6263和bahram等人(1996)，《免疫遗传学》(immunogenetics)，44:80-81中，这些文献的公开内容以引用方式并入本文。mica基因是多态性的，展示出其细胞外α1、α2和α3结构域中的多个变体氨基酸的异常分布。为了进一步定义mica的多态性，petersdorf等人(1999)在具有常见和罕见hla基因型的275名个体之中检查了其等位基因。人类mica的细胞外α1、α2和α3结构域的氨基酸序列在seq id no:1-5中示出。全mica序列还包含23个氨基酸的前导序列以及跨膜结构域和细胞质结构域。mica*001的氨基酸序列在与genbank登录号aab41060相对应的seq id no:1中示出。人类mica等位基因mica*004的氨基酸序列在与genbank登录号aab41063相对应的seq id no:2中示出。人类mica等位基因mica*007的氨基酸序列在与genbank登录号aab41066相对应的seq id no:3中示出。人类mica等位基因mica*008的氨基酸序列在与genbank登录号aab41067相对应的seq id no:4中示出。人类mica等位基因mica*019的氨基酸序列在与genbank登录号aad27008相对应的seq id no:5中示出。
[0075]
micb(也称为perb11.2)是指mhc i类多肽相关序列b(参见例如uniprotkb/swiss-prot q29980)。示例性人类micb多肽的氨基酸序列在genbank登录号cai18747(seq id no:6)中示出。
[0076][0077][0078]
虽然mica在某些细胞中组成性地表达，但低水平的mica表达通常不会引起宿主免
疫细胞攻击。然而，mica在快速增殖的细胞诸如肿瘤细胞上出现上调。mica是所有nkg2d配体中表达程度最高的配体，并且已在广泛范围的肿瘤类型(例如，普通癌、膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、普通恶性血液病、急性髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴性白血病)中发现。最近，tsuboi等人(2011)(《欧洲分子生物学学报》(embo j)：1-13)报道，o-聚糖分支酶核心2β-1,6-n-乙酰葡糖胺转移酶(c2gnt)在表达mica的肿瘤细胞中有活性并且来自肿瘤细胞的mica包含核心2o-聚糖(包含与n-乙酰半乳糖胺相连的n-乙酰葡糖胺分支的o-聚糖)。
[0079]
bauer等人，《科学》(science)，285:727-729，1999提供了mica作为nkg2d的逆境诱导配体的作用。如本文所用，“mica”是指任何mica多肽，包括它们涉及的mica基因或编码蛋白质的任何变体、衍生物或同种型。mica基因是多态性的，展示出其细胞外α-1、α-2和α-3结构域中的多个变体氨基酸的异常分布。已报道了mica多肽(例如，mica)的各种等位基因变体，这些等位基因变体中的每一者由相应术语涵盖，包括例如人类mica多肽mica*001、mica*002、mica*004、mica*005、mica*006、mica*007、mica*008、mica*009、mica*010、mica*011、mica*012、mica*013、mica*014、mica*015、mica*016、mica*017、mica*018、mica*019、mica*020、mica*022、mica*023、mica*024、mica*025、mica*026、mica*027、mica*028、mica*029、mica*030、mica*031、mica*032、mica*033、mica*034、mica*035、mica*036、mica*037、mica*038、mica*039、mica*040、mica*041、mica*042、mica*043、mica*044、mica*045、mica*046、mica*047、mica*048、mica*049、mica*050、mica*051、mica*052、mica*053、mica*054、mica*055、mica*056以及另外的mica等位基因mica*057-mica*087。
[0080]
如本文所用，“nkg2d”以及除非另外指明或与上下文相矛盾，否则术语“hnkg2d”、“nkg2-d”、“cd314”、“d12s2489e”、“klrk1”、“杀伤细胞凝集素样受体亚家族k成员1”或“klrk1”是指人类杀伤细胞活化型受体基因、其cdna(例如，genbank登录号nm_007360)和其基因产物(genbank登录号np_031386)或它们的天然存在的变体。在nk和t细胞中，hnkg2d可与诸如dap10的蛋白质形成异二聚体或更高阶复合物(genbank登录号aag29425、aad50293)。本文中归因于hnkg2d的任何活性例如细胞活化、抗体识别等也可归因于异二聚体诸如hnkg2d-dap10或与这两种(和/或其他)组分的更高阶复合物的形式的hnkg2d。
[0081]
已确定了与nkg2d复合的mica的3d结构(参见例如li等人，《自然-免疫学》(nat.immunol.)，2001；2:443-451；以及imgt/3dstructure-db中的代码1hyr(kaas等人，《核酸研究》(nucl.acids res.)，2004；32:d208-d210))。当mica与nkg2d同源二聚体复合时，micaα2的残基63至73(igmt编号)排序，从而添加将近两圈螺旋。nkg2d的两个单体同等地促成与mica的相互作用，并且每个nkg2d单体中的七个位置与micaα1或α2螺旋结构域之一相互作用。
[0082]
本公开的抗体(例如，诊断抗体)特别是在固定样品诸如石蜡包埋组织切片中特异性地结合人类mica(包括mica*001和mica*008，任选地另外的mica*004、mica*007和/或mica*019)和micb。这些抗体可在包含已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica和micb的细胞的生物样品(例如，ffpe切片)中特异性地结合其靶抗原。
[0083]
这些抗体可任选地被表征为这样的抗体或抗体片段，其结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica*001的细胞的样品中的人类mica*001多肽，结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica*008的细胞的样品中的人类mica*008多肽，并且结合已被制备为石蜡
包埋细胞团块的表达micb的细胞的样品中的人类micb多肽，但不结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的micb阴性细胞(例如raji细胞)。在任何实施方案中，该抗体或抗体片段可任选地被进一步表征为结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica*002的细胞的样品中的人类mica*002多肽的抗体或抗体片段。在任何实施方案中，该抗体或抗体片段可任选地被进一步表征为结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica*007的细胞的样品中的人类mica*007多肽的抗体或抗体片段。在任何实施方案中，该抗体或抗体片段可任选地被进一步表征为结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica*004的细胞的样品中的人类mica*004多肽的抗体或抗体片段。
[0084]
这些抗体特异性地结合石蜡包埋组织切片中的mica和micb的能力使得它们可用于许多应用，特别是用于检测表达mica和/或micb的细胞(例如，肿瘤细胞、有助于肿瘤进展的细胞、有助于肿瘤逃避宿主免疫系统的控制或裂解的细胞)以及表达mica和/或micb的细胞的水平或分布以达到诊断或治疗目的，如本文所述。在某些实施方案中，这些抗体用于在取自个体(例如，患有癌或肿瘤的个体)的样品(例如，活检样品)中确定肿瘤组织中或附近的表达mica和/或micb的细胞的存在或水平。任选进一步地，在一个实施方案中，在组织样品中评估和/或检测mica和/或micb在细胞(例如，肿瘤细胞)膜处的存在。任选进一步地，在一个实施方案中，如果在组织样品中检测到mica和/或micb，则确定存在表达mica和/或micb的细胞。任选地，在另一个实施方案中，如果在组织样品中检测到mica和/或micb(任选地如果检测到预先确定的水平的mica和/或micb染色)，则确定该个体适合用结合mica和/或micb的治疗性抗体(例如，耗竭性抗mica和/或micb抗体)治疗。任选地，在一个实施方案中，该个体已用结合靶抗原的治疗性抗体治疗(例如，在正在进行或既往的疗程中)。
[0085]
该抗体与mica和/或micb的结合的检测可以以多种方式中的任何方式执行。例如，该抗体可以直接用可检测部分(例如发光化合物，诸如荧光部分)或用放射性化合物、用金、用生物素(这允许后续与亲和素例如亲和素-ap的扩增结合)或用酶(诸如碱性磷酸酶(ap)或辣根过氧化物酶(hrp))标记。另选地，间接地评估该抗体与样品中的靶抗原的结合，例如通过使用二抗，该二抗结合抗靶抗原的一抗且自身被标记，优选地被诸如辣根过氧化物酶(hrp)或碱性磷酸酶(ap)之类的酶标记；然而，应当理解，可使用任何合适的方法标记或检测二抗。在一个优选的实施方案中，扩增系统用于增强该二抗所提供的信号，例如envision系统，其中二抗结合聚合物(例如，葡聚糖)，而该聚合物结合可检测化合物或酶诸如hrp或ap的许多拷贝(参见例如wiedorn等人，(2001)，《组织化学与细胞化学杂志》(the journal of histochemistry&cytochemistry)，第49卷(9):1067
–
1071；等人，(2001)，《组织化学与细胞化学杂志》(journal of histochemistry and cytochemistry)，第49卷，623-630；这些文献的全部公开内容以引用方式并入本文)。
[0086]
在一个方面，本公开提供了产生可检测ffpe样品中的mica和/或micb的抗体的方法。mica和/或micb或其一个或多个免疫原性片段可用作引发抗体的免疫原，并且抗体可识别如本文所述石蜡包埋样品上的靶抗原多肽内的表位。优选地，识别的表位存在于细胞表面上，即它们可接近存在于细胞之外的抗体。在一个方面，该表位是由抗体12c9在石蜡包埋细胞团块样品中特异性地识别的表位。在一个方面，抗体与抗体12c9竞争性地结合由抗体12c9在石蜡包埋细胞团块样品中特异性地识别的表位。此外，识别相同表位或与12c9竞争性地结合由抗体12c9在mica内识别的表位的抗体可用于在已接受或可能已接受不同既往
疗法、特别是已用或可能已用指向靶抗原多肽(例如，mica和/或micb、mica*001和mica*008及另外的micb)的治疗性抗体治疗的人类个体群体中以最大功效和广度结合mica和/或micb。
[0087]
可通过本领域中已知的多种技术(例如如本文实施例2中所阐述)来产生这些抗体。通常，通过用包含mica和/或micb多肽(例如，mica*001、mica*008和micb多肽)(优选地，人类多肽)的免疫原对非人动物(优选地，小鼠)进行免疫接种来产生这些抗体。该多肽可包含人类多肽的全长序列或其片段或衍生物，通常为免疫原性片段，即包含在表达mica多肽的细胞表面上暴露的表位(优选地，12c9抗体识别的表位)的多肽的一部分。此类片段通常包含成熟多肽序列的至少约7个连续氨基酸，甚至更优选地其至少约10个连续氨基酸。片段通常基本上衍生自受体的细胞外结构域。在一个实施方案中，该免疫原包含野生型人类mica多肽或其片段。在一个具体实施方案中，该免疫原包含完整细胞，特别是完整人类细胞，任选地其经过处理或裂解。
[0088]
用抗原对非人哺乳动物进行免疫接种的步骤可以以本领域中熟知的用于刺激小鼠中产生抗体的任何方式进行(参见例如e.harlow和d.lane，《抗体：实验室手册》(antibodies:a laboratory manual)，冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press)，冷泉港(cold spring harbor)，纽约(n.y.)，(1988))。将免疫原混悬或溶解于缓冲液中，任选地与佐剂诸如完全或不完全弗氏佐剂一起混悬或溶解。用于确定免疫原的量、缓冲液的类型和佐剂的量的方法为本领域技术人员所熟知并且不以任何方式对本发明构成限制。这些参数对于不同免疫原可能不同，但容易阐明。
[0089]
类似地，足以刺激产生抗体的免疫接种的位置和频率也是本领域中熟知的。在典型免疫接种方案中，在第1天向非人动物的腹膜内注射抗原并且约一周后再注射一次。之后在第20天左右进行抗原的回忆注射(recall injection)，任选地与佐剂诸如不完全弗氏佐剂一起注射。这些回忆注射在静脉内执行，并且可在连续几天内重复。随后在第40天进行静脉内或腹膜内加强注射，通常不用佐剂。该方案在约40天后引起产生抗原特异性抗体的b细胞的生成。也可使用其他方案，只要它们引起表达针对免疫接种中所用抗原的抗体的b细胞的生成即可。
[0090]
在一个另选实施方案中，将未免疫接种的非人哺乳动物的淋巴细胞分离，使之体外生长，然后在细胞培养中暴露于免疫原。随后收获淋巴细胞，并进行下文所述的融合步骤。
[0091]
可从免疫接种的非人哺乳动物中分离脾细胞，随后将那些脾细胞与永生化细胞融合以形成产生抗体的杂交瘤。从非人哺乳动物中分离脾细胞是本领域中熟知的，并且通常涉及从麻醉的非人哺乳动物中取出脾，将其切成小块并通过细胞滤器的尼龙网将脾细胞从脾包膜挤进适当的缓冲液中而产生单细胞悬液。将细胞洗涤、离心并重悬于裂解任何红细胞的缓冲液中。将该溶液再次离心，最后将团块中剩余的淋巴细胞重悬于新鲜缓冲液中。
[0092]
一旦被分离且存在于单细胞悬液中，这些淋巴细胞就可融合于永生细胞系。这通常为小鼠骨髓瘤细胞系，但本领域中已知还有许多可用于生成杂交瘤的其他永生细胞系。优选的鼠骨髓瘤细胞系包括但不限于可从美国圣地亚哥的索尔克研究所细胞分配中心(salk institute cell distribution center,san diego,u.s.a.)获得的衍生自mopc-21和mpc-11小鼠肿瘤的细胞系、可从美国马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心
(american type culture collection,rockville,maryland u.s.a.)获得的x63ag8653和sp-2细胞。该融合是使用聚乙二醇等实现的。随后使所得的杂交瘤在选择培养基中生长，该选择培养基含有一种或多种抑制非融合亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(hgprt或hprt)，则用于杂交瘤的培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(hat培养基)，这些物质防止hgprt缺陷细胞的生长。
[0093]
杂交瘤通常生长在巨噬细胞的饲养层上。这些巨噬细胞优选地来自用于分离脾细胞的非人哺乳动物的同窝仔，并且通常在接种杂交瘤之前几天用不完全弗氏佐剂等进行致敏。融合方法描述于goding，“单克隆抗体：原理与实践(monoclonal antibodies:principles and practice)”，第59-103页(学术出版社(academic press)，1986)中，该文献的公开内容以引用方式并入本文。
[0094]
允许这些细胞在选择培养基内生长足够时间而形成集落和产生抗体。这通常在约7天与约14天之间。
[0095]
可针对特异性地结合表达mica和/或micb的固定和石蜡包埋细胞团块上的mica和/或micb的抗体的产生来测定杂交瘤集落，任选地针对与抗体12c9竞争性地结合表达mica和/或micb的固定石蜡包埋细胞团块来测定杂交瘤。检查对期望的抗体产生呈阳性的孔以确定是否存在一个或多个不同集落。如果存在多于一个集落，可将细胞再次克隆和生长以确保只有单个细胞形成产生期望抗体的集落。可使天然不表达靶抗原(例如，mica)的细胞表达靶抗原(例如，通过用表达靶抗原的核酸转染)，将其制备为细胞团块，福尔马林固定，包埋于石蜡中，切片，脱蜡，并且转移到玻片。不表达靶抗原的对照细胞(例如，与上文相同但未用靶抗原转染的细胞)可用作阴性对照。
[0096]
可使确认会产生期望单克隆抗体的杂交瘤在适当培养基诸如dmem或rpmi-1640中生长成更大的量。另选地，可使杂交瘤细胞在动物体内生长为腹水瘤。在充分生长以产生期望单克隆抗体之后，将包含单克隆抗体的生长培养基(或腹水)与细胞分离开并且纯化存在于其中的单克隆抗体。纯化通常是通过凝胶电泳、透析、使用蛋白a或蛋白g-琼脂糖的层析或者与固相支持体(诸如琼脂糖或琼脂糖微珠)相连的抗小鼠ig来实现的(所有都描述于例如《抗体纯化手册》(antibody purification handbook)，生物科学(biosciences)，出版号18-1037-46，ac版中，该文献的公开内容据此以引用方式并入)。通常使用低ph缓冲液(ph 3.0或更低的甘氨酸或乙酸盐缓冲液)，通过立即中和含抗体的级分而从蛋白a或蛋白g的柱洗脱结合抗体。将这些级分合并、透析并按需进行浓缩。
[0097]
通常再次克隆具有单个明显集落的阳性孔并且再次测定以确保检测到并产生仅一种单克隆抗体。
[0098]
还可通过选择免疫球蛋白的组合文库来产生抗体，如例如(ward等人，《自然》(nature)，341(1989)，第544页，该文献的全部公开内容以引用方式并入本文)中所公开。例如，可使用噬菌体展示技术生成文库。
[0099]
根据一个另选实施方案，可首先针对特异性地结合靶抗原多肽(例如，mica和/或micb)的抗体的产生来测定杂交瘤，并且将编码抗体的dna从杂交瘤分离并置于适当的表达载体中以转染进适当的宿主细胞中。然后该宿主细胞用于该抗体或其变体(诸如该抗体的功能片段、包含该抗体的抗原识别部分的嵌合抗体或包含可检测部分的型式)的重组产生。
然后可针对特异性地结合表达mica和/或micb的固定和石蜡包埋细胞团块上的mica和/或micb的抗体的产生来测定重组产生的抗体，任选地针对与抗体12c9竞争性地结合表达mica和/或micb的固定石蜡包埋细胞团块来测定杂交瘤。
[0100]
结合mica和/或micb、特别是与单克隆抗体12c9竞争性地结合mica和/或micb(或由12c9结合的其上的表位)的一种或多种抗体的鉴别可易于使用多种免疫筛选测定法中的任何一种来确定，在这些免疫筛选测定法中可根据本文所述的方法或任何其他合适的方法评估抗体竞争。
[0101]
在某些实施方案中，在施加到mica和/或micb抗原样品(例如，表达mica和/或micb的石蜡包埋细胞团块样品)之前，将对照抗体(例如，12c9)与不同量的测试抗体(例如，约1:10或约1:100)预混合一定时间段。在其他实施方案中，可在暴露于mica和/或micb抗原样品期间将对照抗体与不同量的测试抗体简单混合。只要可将结合抗体与游离抗体区分开(例如，通过使用分离或洗涤技术以消除未结合抗体)以及将12c9与测试抗体区分开(例如，通过使用物种特异性或同种型特异性二抗或通过用可检测标记特异性地标记12c9)，就可确定测试抗体是否减少了12c9与抗原的结合，从而指示测试抗体与12c9竞争性地结合抗原。在不存在完全无关的抗体的情况下，(标记的)对照抗体的结合可用作对照高值。可通过将标记的(12c9)抗体与完全相同类型(12c9)的未标记抗体一起温育而获得对照低值，其中竞争将会发生并且减少标记的抗体的结合。在测试测定法中，在存在测试抗体的情况下，标记抗体反应性的显著减少指示与标记的(12c9)抗体“交叉反应”的测试抗体。在约1:10与约1:100之间的12c9:测试抗体的任何比率下将12c9与mica和/或micb的结合减少至少约50％诸如至少约60％或更优选地至少约70％(例如，约65％-100％)的任何测试抗体均被认为是与12c9竞争的抗体。优选地，此类测试抗体会将12c9与mica和/或micb抗原的结合减少至少约90％(例如，约95％)。
[0102]
在脊椎动物或细胞中免疫接种和产生抗体(或例如，生成候选抗体的文库，任选地这些抗体的核酸或氨基酸序列的文库)后，可执行特定选择步骤以分离受权利要求书保护的抗体。就这一点而言，在一个具体实施方案中，本发明还涉及产生此类抗体的方法，所述方法包括：(a)提供抗体的文库和/或用包含mica和/或micb多肽的免疫原对非人哺乳动物进行免疫接种并且由所述免疫接种的动物制备抗体；以及(b)从步骤(a)中选择能够特异性地结合石蜡包埋细胞团块(例如，ffpe细胞团块)中的所述mica和/或micb多肽的抗体。
[0103]
编码本发明的单克隆抗体(例如，抗体12c9)的dna可易于使用常规规程来分离和测序(例如，通过使用能够特异性地结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。一旦分离，就可将dna置于表达载体中，然后将表达载体转染进宿主细胞诸如大肠杆菌(e.coli)细胞、猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或骨髓瘤细胞中(这些细胞原本不产生免疫球蛋白)，以实现单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。如在本说明书的其他地方所述，可修饰此类dna序列以用于大量目的中的任一个目的，例如用于人源化抗体，产生片段或衍生物，或用于修饰抗体的序列(例如，在抗原结合位点中)，以优化抗体的结合特异性。
[0104]
本公开提供了基于甲醛处理石蜡包埋细胞团块(ffpe细胞团块)的筛选方法，所述细胞团块在福尔马林处理之后，而且包括当细胞在固定之前与其他抗mica抗体(例如，中和抗体)一起温育时，显露存在的mica和/或micb表位。因此，在一个方面，本公开提供了特异性地结合被保存为石蜡包埋细胞团块(并在分析之前脱蜡)的样品中的表达mica和/或micb
多肽的细胞(例如，使之表达mica和/或micb的细胞)的单克隆抗体。任选地，该抗体进一步通过不结合石蜡包埋细胞团块中的mica和micb阴性细胞(不表达mica或micb的细胞)来表征。任选地，该抗体进一步通过结合石蜡包埋组织切片中的表达mica和/或micb多肽的细胞来表征。
[0105]
在一个方面，本公开提供了特异性地结合人类mica和micb多肽的单克隆抗体(例如，第一抗体)，其中所述抗体(例如，第一抗体)特异性地结合已使用甲醛(例如，福尔马林、多聚甲醛)处理(或固定)的生物样品中的所述mica和micb多肽。甲醛固定可特别用于制备石蜡包埋组织切片，然后可对石蜡包埋组织切片进行脱蜡并且分析感兴趣的标记物(例如，mica)的存在。
[0106]
在一个方面，提供了特异性地结合由已被保存在石蜡中的细胞(例如，已被保存为石蜡包埋细胞团块的细胞)表达的人类mica多肽的单克隆抗体。任选地，将这些细胞团块化、甲醛处理(例如，甲醛、福尔马林、多聚甲醛)，然后石蜡包埋。任选地，表达人类mica多肽的细胞位于在抗体结合和分析之前已经脱蜡的生物样品中。
[0107]
在一个方面，这些抗体结合存在于ffpe细胞团块样品中的mica和micb上(任选地在mica*001、mica*008和micb上)的抗原决定簇。在一个方面，这些抗体结合与抗体12c9基本上相同的表位或决定簇，或与12c9竞争性地结合ffpe细胞团块样品中的mica和/或micb上的此类表位。在一个实施方案中，这些抗体结合与抗体12c9所结合的表位至少部分地重叠或包括该表位中的至少一个残基的mica和/或micb的表位。该抗体所结合的残基可被指定为存在于mica和micb多肽的表面上，任选地还存在于细胞的表面上表达的mica和micb多肽的表面上，任选地还存在于已被保存为石蜡包埋细胞团块的细胞的表面上表达的mica和micb多肽的表面上。
[0108]
抗体12c9的重链可变区的氨基酸序列被列出为seq id no:7，轻链可变区的氨基酸序列被列出为seq id no:8。在一个具体实施方案中，抗体基本上结合与单克隆抗体12c9相同的表位或决定簇；任选地，该抗体包含抗体12c9的高变区。在本文任何实施方案中，抗体12c9可由氨基酸序列和/或编码其的核酸序列表征。在一个实施方案中，单克隆抗体包含12c9的fab或f(ab')2部分。还提供了包含12c9的重链可变区或其功能保守变体的单克隆抗体。根据一个实施方案，单克隆抗体包含12c9的重链可变区的三个cdr。还提供了进一步包含12c9的可变轻链可变区或其功能保守变体的单克隆抗体。根据一个实施方案，单克隆抗体包含12c9的轻链可变区的三个cdr。任选地，所述轻链或重链cdr中的任何一个或多个轻链或重链cdr可包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如，取代、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包含抗体12c9的部分或全部抗原结合区的任何轻链和/或重链可变区融合于igg型的免疫球蛋白恒定区，任选地人类恒定区，任选地人类igg1、igg2、igg3或igg4同种型，任选地还包含氨基酸取代，例如以修饰(例如，减少)效应子功能(结合人类fcγ受体)或提供感兴趣的部分(例如，可检测部分)的缀合。
[0109]
在一个方面，抗mica抗体包含与具有seq id no:7的氨基酸序列的重链可变区有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多的同一性)的重链可变区。
[0110]
在一个方面，抗mica抗体包含与具有seq id no:8的氨基酸序列的轻链可变区有至少约80％序列同一性(例如，至少约85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多的同一性)
的轻链可变区。
[0111]
在一个方面，该抗体包含：具有氨基酸序列：gyymn(seq id no:9)的hcdr1或其至少4个邻接氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；具有氨基酸序列：tinpyygsstynqkfkg(seq id no:10)的hcdr2或其至少4、5、6、7、8、9或10个邻接氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；具有氨基酸序列：vdgdhgyfdy(seq id no:11)的hcdr3或其至少4、5或6个邻接氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；具有氨基酸序列：rssqslvhsngntylh(seq id no:12)的lcdr1或其至少4、5、6、7、8、9或10个邻接氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；具有氨基酸序列：kvstrfs(seq id no:13)的lcdr2区或其至少4、5或6个邻接氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸取代；和/或具有氨基酸序列：sqsthvpft(seq id no:14)的lcdr3区或其至少4、5、6、7或8个邻接氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可缺失或被不同氨基酸取代。
[0112]
指定的重链、轻链、可变区、骨架和/或cdr序列可包含序列修饰，例如取代(1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个序列修饰)。在一个实施方案中，氨基酸序列包含一个、两个、三个或更多个氨基酸取代，其中被取代的残基是存在于人源序列中的残基。在一个实施方案中，该取代是保守修饰。保守序列修饰是指不显著影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可通过本领域中已知的标准技术(诸如定点诱变和pcr介导的诱变)将修饰引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代通常是氨基酸残基被替换为具有类似物理化学特性的侧链的氨基酸残基的那些取代。指定的氨基酸序列可包含一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸插入、缺失或取代。在进行取代的情况下，优选的取代将为保守修饰。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明的抗体的cdr区内的一个或多个氨基酸残基可被替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基并且可使用本文所述的测定法测试改变的抗体的保留功能(即，本文所阐述的特性)。
[0113]
在一个实施方案中，本发明的抗体是保留其结合和/或功能特性的抗体片段。本发明的抗体的片段和衍生物(除非另外指明或与上下文相矛盾，否则它们被如本技术中所用的术语“抗体(antibody)”或“抗体(antibodies)”涵盖)，优选地12c9样抗体，可通过本领域中已知的技术来产生。“片段”包含完整抗体的一部分，通常为抗原结合位点或可变区。抗体片段的示例包括fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2和fv片段；双抗体；作为具有由邻接氨基酸残基的一个不间断序列组成的一级结构的多肽的任何抗体片段(在本文中称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链fv分子，(2)仅包含一个轻链可变结构域的单链多肽或包含轻链可变结构域的三个cdr而没有相关联的重链部分的其片段，以及(3)仅包含一个重链可变区的单链多肽或包含重链可变区的三个cdr而没有相关联的轻链部分的其片段；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，通过将抗体或抗体片段与可
检测部分缀合或共价结合来使抗体或抗体片段衍生化。
[0114]
ffpe样品的制备和染色
[0115]
本发明抗体具有能够有效且特异性地结合存在于固定组织或细胞样品中的多肽(例如，mica和micb多肽)的特定特性。制备和使用此类组织制备物的各种方法在本领域中是熟知的，并且可使用任何合适的制备方法或类型。这些抗体还能够结合样品中的其靶抗原，其中在固定时或之前存在治疗性(例如，功能中和)抗体。
[0116]
取自个体的生物样品中的ffpe材料通常是组织。ffpe组织是首先通过解剖或活检而从标本动物(例如，人类个体)分离的一块组织。然后，固定该组织以防止其腐烂或腐化并且允许在显微镜下清楚地检查该组织，从而进行组织学、病理学或细胞学研究。固定是将组织固定化、杀死并保存以用于染色和在显微镜下观察该组织的目的的过程。固定后处理使组织可透过染色试剂并且使其大分子交联，使得它们被固定化并锁定在适当位置。然后将该固定组织包埋于蜡中以允许其被切成薄切片并用苏木精和伊红染液染色。之后，通过切出细切片来进行显微切片以在显微镜下研究用抗体进行的染色。
[0117]
例如，应当理解，本发明抗体可与不同合适的固定细胞或组织制备物和所使用的不同特定固定或包埋方法一起使用。例如，虽然最常用的甲醛基固定规程涉及福尔马林(例如，10％)，但可使用另选方法，诸如多聚甲醛(pfa)、布安溶液(福尔马林/苦味酸)、醇、锌基溶液(举个例子来说，参见例如lykidis等人，(2007)，《核酸研究》(nucleic acids research)，2007，1
–
10，该文献的全部公开内容全部并入本文)和其他(参见例如hope方法，《病理学研究与实践》(pathology research and practice)，第197卷，第12期，2001年12月，第823-826页(4)，该文献的全部公开内容以引用方式并入本文)。类似地，虽然石蜡是优选的，但其他材料也可用于包埋，例如聚酯蜡、聚乙二醇基配方、乙二醇甲基丙烯酸酯、jb-4塑料和其他材料。有关用于制备和使用组织制备物的方法的综述，参见例如gillespie等人，(2002)，《美国病理学杂志》(am j pathol.)，2002年2月；160(2):449
–
457；fischer等人，《csh方案》(csh protocols)；2008；renshaw(2007)，《免疫组织化学：方法快报系列》(immunohistochemistry:methods express series)；bancroft(2007)，《组织学技术的理论与实践》(theory and practice of histological techniques)；以及pct专利公布号wo06074392；这些文献的全部公开内容以引用方式并入本文)。
[0118]
在本发明的一个实施方案中，ffpe组织是肿瘤组织或肿瘤旁组织，例如人类肿瘤组织。肿瘤可以是例如头颈部鳞状细胞癌、肺癌(例如，nsclc)、间皮瘤、乳腺癌、雌激素阳性乳腺癌、雌激素阴性乳腺癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌或黑色素瘤的肿瘤。
[0119]
将该抗体(例如，抗mica和/或micb抗体)与ffpe材料一起温育以检测mica和/或micb多肽。术语温育步骤涉及使ffpe材料与本发明的抗体接触不同时间段，这取决于材料、抗体和/或抗原的种类。温育过程还取决于各种其他参数，例如检测灵敏度、哪种优化遵循本领域技术人员已知的常规规程。添加化学溶液和/或应用物理规程(例如热影响)可改善样品中的靶结构的可及性。因该温育而形成具体的温育产物。
[0120]
用于检测所形成的抗体/抗原复合物的合适测试是本领域技术人员已知的或可容易被设计为例行事项。许多不同类型的测定法是已知的，下文阐述了这些测定法的示例。
[0121]
例如，待检查的样品(组织或细胞)可通过取自生物流体、肿瘤组织或健康组织的
活检样品及切片(例如，3mm厚或更小)来获得并且使用福尔马林或等效固定方法(参见上文)来固定。固定的时间取决于应用，但可在几小时到24小时或更多小时的范围内。固定后，将组织包埋于石蜡(或等效材料)中，并且在显微切片机中切出极薄切片(例如，5微米)，然后将这些切片封固到(优选地涂布于)玻片上。之后将玻片干燥，例如风干。
[0122]
可将玻片上的固定和包埋组织切片干燥并且无限期地储存。对于免疫组织化学而言，将玻片脱蜡，然后再水化。例如，对这些玻片进行一系列洗涤，首先用二甲苯洗涤，随后用含乙醇的二甲苯洗涤，然后用水中百分比减少的乙醇洗涤。
[0123]
在抗体染色之前，可对组织进行抗原修复步骤(例如，酶促的或基于热的)以使固定期间形成并可掩盖表位的甲烷桥断裂。在一个优选的实施方案中，使用沸腾10mm柠檬酸盐缓冲液ph 6中的处理。
[0124]
一旦已使玻片再水化并且已理想地执行抗原修复，就可将这些玻片与一抗一起温育。首先，用例如tbs洗涤玻片，然后在采用例如血清/bsa的封闭步骤之后，可施加该抗体。该抗体的浓度将取决于其形式(例如，纯化)、其亲和力、所使用的组织样品，但合适的浓度为例如1g/ml至10μg/ml。在一个实施方案中，所使用的浓度为10μg/ml。温育的时间也可变化，但过夜温育通常是合适的。在例如tbs中的后抗体洗涤步骤后，随后处理这些玻片以检测抗体结合。
[0125]
所使用的检测方法将取决于所使用的抗体、组织等，并且可例如涉及与一抗缀合的发光或另外可见或可检测的部分的检测，或通过使用可检测的二抗。抗体检测的方法在本领域中是熟知的并且例如在以下文献中教导：harlow等人，《抗体：实验室手册》(antibodies:a laboratory manual)，冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press)，第1版(1988年12月1日)；fischer等人，《csh方案》(csh protocols)；2008；renshaw(2007)，《免疫组织化学：方法快报系列》(immunohistochemistry:methods express series)；bancroft(2007)，《组织学技术的理论与实践》(theory and practice of histological techniques)；pct专利公布号wo06074392；这些文献中的每篇文献的全部公开内容全部并入本文。
[0126]
许多直接或间接检测方法是已知的并且可适于使用。直接标记包括附接到抗体的荧光或发光标签、金属、染料、放射性核素等。可使用用碘-125(
125
i)标记的抗体。使用对蛋白质具有特异性的化学发光抗体的化学发光测定法适用于蛋白质水平的灵敏、非放射性检测。用荧光染料标记的抗体也是合适的。荧光染料的示例包括但不限于dapi、荧光素、hoechst33258、r-藻蓝蛋白、b-藻红蛋白、r-藻红蛋白、罗丹明、德克萨斯红和丽丝胺。
[0127]
间接标记包括本领域中熟知的各种酶，诸如辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(ap)、β-半乳糖苷酶、脲酶等。抗mica抗体与酶的共价键合可通过不同方法(诸如与戊二醛偶联)来执行。该酶和该抗体均经由游离氨基与戊二醛互连，并且去除网络化的酶和抗体的副产物。在另一种方法中，如果该酶为糖蛋白(诸如过氧物酶)，则该酶经由糖残基偶联到该抗体。该酶由高碘酸钠氧化并且与该抗体的氨基直接互连。其他含碳水化合物的酶也可以以这种方式偶联到该抗体。酶偶联也可通过使用异双功能接头(诸如琥珀酰亚胺基6-(n-马来酰亚胺基)己酸酯)将该抗体的氨基与酶(诸如β-半乳糖苷酶)的游离硫醇基互连来执行。辣根过氧化物酶检测系统可例如与显色底物四甲基联苯胺(tmb)一起使用，该tmb在存在过氧化氢的情况下产生在450nm处可检测的可溶性产物。碱性磷酸酶检测系统可与例如显色
底物磷酸对硝基苯酯一起使用，该磷酸对硝基苯酯产生可易于在405nm处检测的可溶性产物。类似地，β-半乳糖苷酶检测系统可与显色底物邻硝基苯基-β-d-吡喃半乳糖苷(onpg)一起使用，该onpg产生在410nm处可检测的可溶性产物。脲酶检测系统可与诸如脲-溴甲酚紫之类的底物一起使用。
[0128]
在一个实施方案中，一抗的结合通过结合标记的二抗、优选地与诸如hrp或ap之类的酶共价连接的二抗来检测。在一个特别优选的实施方案中，使用用于抗体检测的放大的多种方法中的任何方法来放大该二抗的结合所生成的信号。例如，可使用envision方法(参见例如美国专利号5,543,332和欧洲专利号594,772；等人，(2001)，《组织化学与细胞化学杂志》(journal of histochemistry and cytochemistry)，第49卷，623-630；wiedorn等人，(2001)，《组织化学与细胞化学杂志》(the journal of histochemistry&cytochemistry)，第49卷(9):1067
–
1071；这些文献的全部公开内容以引用方式并入本文)，其中二抗连接到聚合物(例如，葡聚糖)，而该聚合物自身连接到ap或hrp的许多拷贝。
[0129]
在一个示例中，将福尔马林固定石蜡包埋块切成5μm厚的切片并且在discovery ultra或benchmark ultra自动机(范迪纳公司(ventana))上执行免疫染色。在用细胞调理1预处理之后，将切片在37℃下与2μg/ml(用于在discovery ultra上染色)或6.6μg/ml(用于在benchmark ultra上染色)的抗mica/b一抗或小鼠igg1同种型对照一起温育1小时。然后，执行使用discovery amp hq
tm
试剂盒或ultraview
tm
试剂盒的信号放大。在用3,3-二氨基联苯胺显色、用苏木精复染和发蓝处理之后，对切片进行洗涤、脱水、清洁和盖上盖玻片。最后在玻片扫描仪(s60 nanozoomer
tm
、hamamatsu或pannoramic scan ii、3dhistech
tm
)上扫描染色的切片。由确定肿瘤细胞上的mica/b表达的训练有素的病理学家对染色进行解释和评分。具有超过指定百分比(例如，1％、5％、10％等)mica/b阳性肿瘤细胞的样品被认为是mica/b阳性的。
[0130]
组合物及在诊断、预后和疗法中的用途
[0131]
本公开的抗体能特别有效地检测被制备为ffpe的生物样品内的mica和/或micb(例如，包括人类群体中的mica的多个最主要等位基因，并且包括至少mica*001和mica*008等位基因)，而没有在不表达mica或micb多肽的组织或细胞上的非特异性染色。因此这些抗体将具有用于在mica和/或micb多肽和/或表达mica和/或micb的细胞的检测和/或定位令人感兴趣的疾病中研究、评估、诊断、预后和/或监测的优点。例如，其肿瘤或肿瘤旁组织由表达mica和/或micb的细胞(例如，表达mica和/或micb的肿瘤细胞)表征的患者可具有肿瘤进展的不良预后。此类患者可例如受益于用适于其预后和/或mica和/或micb表达谱的治疗剂和方案治疗，包括例如免疫疗法、化学疗法和特定联合治疗。
[0132]
因此，提供了检测、诊断或监测受试者体内的癌的方法，该方法包括以下步骤：(例如，在体外)使肿瘤细胞与本公开的抗mica/micb抗体或抗体片段接触以及检测肿瘤相关mica和/或micb多肽。在相关实施方案中，该诊断方法将包括免疫组织化学(ihc)。在某些实施方案中，肿瘤样品被化学固定和/或石蜡包埋。本领域技术人员将进一步理解，此类mica/micb检测剂可用效应子、标记物或报告子来标记或与之缔合，并且使用多种标准成像技术中的任何一种技术来检测。在其他实施方案中，抗mica/micb抗体将未被直接标记并且将使用可检测的次级剂(例如，标记的抗鼠抗体)来检测。在某些实施方案中，本公开提供了用于鉴别或选择要施用疗法(例如，化学疗法、免疫疗法)的个体的方法，该方法包括使用本发明
的抗mica/micb组合物和检测方法中的任一者来诊断个体，并且基于该结果来定制疗程。
[0133]
在一个实施方案中，本公开提供了在取自患有头颈部鳞状细胞癌、肺癌(例如，nsclc)、间皮瘤、乳腺癌、雌激素阳性乳腺癌、雌激素阴性乳腺癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌或黑色素瘤的个体的样品中检测表达mica/micb的细胞的方法，该方法包括使取自个体的石蜡包埋肿瘤组织样品与能够特异性地结合石蜡包埋肿瘤组织样品中的人类mica和micb多肽的抗体接触；以及检测切片内结合抗体的存在，任选地进一步检测该抗体对细胞膜(细胞表面)的染色。在该切片内检测到结合抗体，任选地在该切片内检测到该抗体对细胞膜(细胞表面)的染色后，该个体可被确定或视为患有mica和/或micb阳性的肿瘤。
[0134]
在一个实施方案中，本公开提供了在取自患有尿路上皮癌、胰腺癌、肝细胞癌(hcc)或子宫内膜癌的个体的样品中检测表达mica/b的细胞的方法，该方法包括使取自个体的石蜡包埋肿瘤组织样品与能够特异性地结合石蜡包埋肿瘤组织样品中的人类mica和micb多肽的抗体接触；以及检测切片内结合抗体的存在，任选地进一步检测该抗体对细胞膜(细胞表面)的染色。在该切片内检测到结合抗体，任选地在该切片内检测到该抗体对细胞膜(细胞表面)的染色后，该个体可被确定或视为患有mica和/或micb阳性的肿瘤。
[0135]
在一个实施方案中，本公开提供了在取自人类肿瘤的样品中检测表达mica/b的细胞(例如，在其表面或细胞膜处表达mica和/或micb的细胞)的方法，该方法包括使取自个体的石蜡包埋肿瘤组织样品与能够特异性地结合石蜡包埋肿瘤组织样品中的人类mica和micb多肽的抗体接触；以及检测切片内结合抗体的存在，任选地进一步检测该抗体对细胞膜(细胞表面)的染色。
[0136]
在一个实施方案中，本公开提供了在取自患有头颈部鳞状细胞癌、肺癌(例如，nsclc)、间皮瘤、乳腺癌、雌激素阳性乳腺癌、雌激素阴性乳腺癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌或黑色素瘤的个体的样品中检测表达mica/b的细胞的方法，该方法包括使取自个体的石蜡包埋肿瘤组织样品与能够特异性地结合石蜡包埋肿瘤组织样品中的人类mica和micb多肽的抗体接触；以及检测切片内结合抗体的存在，任选地进一步检测该抗体对细胞膜(细胞表面)的染色。
[0137]
在一个实施方案中，本公开提供了在取自人类肿瘤的样品中检测表达mica/b的细胞的方法，该方法包括使取自个体的石蜡包埋肿瘤组织样品与能够特异性地结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的细胞的表面上的人类mica和micb多肽的抗体接触；以及检测切片内结合抗体的存在，任选地进一步检测该抗体对细胞膜(细胞表面)的染色。
[0138]
在一个实施方案中，本公开提供了在取自人类肿瘤的样品中检测表达mica/b的细胞的方法，该方法包括使取自个体的石蜡包埋肿瘤组织样品与抗体接触，已评估该抗体其特异性地结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的细胞的表面上的人类mica和micb多肽的能力(或已确定该抗体能特异性地结合所述人类mica和micb多肽)；以及检测切片内结合抗体的存在，任选地进一步检测该抗体对细胞膜(细胞表面)的染色。
[0139]
在一个实施方案中，本公开提供了在取自患有肿瘤的个体的肿瘤组织样品中检测表达mica/b的细胞的方法，该方法包括：
[0140]
(a)提供取自个体的石蜡包埋肿瘤组织样品，并且使该样品在体外与单克隆抗体接触，该单克隆抗体能够结合石蜡包埋细胞团块中的表达mica和/或micb的细胞，而不结合
石蜡包埋细胞团块中的mica/micb阴性细胞，以及
[0141]
(b)评估该抗体是否结合肿瘤细胞的表面，其中该抗体结合肿瘤细胞的表面的确定指示该肿瘤对于表达mica/b的细胞呈阳性和/或适合用耗竭抗mica剂治疗。
[0142]
在任何实施方案中，ffpe组织可以是从既往已接受用抗癌治疗(例如，化学治疗剂)、任选地已知能够上调mica和/或micb表达癌细胞的抗癌治疗的治疗的个体获得的肿瘤或肿瘤旁组织。已表明，某些化学治疗剂或其他治疗可诱导和/或增加肿瘤细胞上的mica和/或micb表达(以及任选地另外的nkg2d配体)。这包括熟知的化学疗法，包括电离和紫外辐射、dna复制的抑制剂、dna聚合酶的抑制剂、染色质修饰处理剂、抗代谢剂(例如，丙酮酸盐的卤代类似物诸如3-溴丙酮酸)以及细胞凋亡诱导剂诸如hdac抑制剂曲古抑菌素a和丙戊酸。示例性试剂是活化dna损伤应答通路的那些试剂，例如活化atm(共济失调毛细血管扩张突变)或atr(atm和rad3相关)蛋白激酶或chk1或还另外的chk2或p53的那些试剂。后者的示例包括电离辐射、dna复制的抑制剂、dna聚合酶抑制剂和染色质修饰剂或处理剂(包括hdac抑制剂)。上调nkg2d配体的组合物进一步在gasser等人(2005)，《自然》(nature)，436(7054):1186-90中描述。另外的化学治疗剂包括烷基化剂、细胞毒性抗生素诸如拓扑异构酶i抑制剂、拓扑异构酶ii抑制剂、植物衍生物、rna/dna抗代谢物和抗有丝分裂剂。优选的示例可包括例如顺铂(cddp)、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、博莱霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依托泊苷(vp16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、紫杉醇、吉西他滨、诺维本、反式铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤或前述物质的任何类似物或衍生变体。既往已接受用抗癌治疗的治疗并且具有肿瘤细胞上的mica和/或micb表达的个体可被确定为适合用抗mica和/或micb抗体治疗。
[0143]
在一个实施方案中，当检测到mica和/或micb时，ffpe组织可以是从作为用抗mica和/或micb抗体治疗的候选者的个体获得的肿瘤或肿瘤旁组织。
[0144]
在一个实施方案中，当检测到mica和/或micb时，ffpe组织可以是从已接受用抗mica和/或micb抗体治疗(例如，已经历或正经历采用这种抗体的疗程)的个体获得的肿瘤或肿瘤旁组织。
[0145]
本公开还提供了用于选择患有表达mica和/或micb的肿瘤的个体来施用治疗性干预的方法。治疗性干预的示例包括结合mica和/或micb的抗体，任选地引起表达mica和/或micb的细胞的耗竭的抗体。在一个示例中，治疗性干预是缓解或减轻mica和/或micb的免疫抑制效应的试剂(例如，结合mica的抗体)，例如缓解或减轻由可溶性mica多肽诱导的nk和/或cd8 t细胞表面处的nkg2d下调的试剂。如果该个体被确定或视为患有mica和/或micb阳性的肿瘤，则本公开的方法可任选地被进一步指定为包括以下步骤：例如如果该个体被确定为患有表达mica和/或micb的肿瘤(如通过使用能够特异性地结合ffpe样品中的人类mica和/或micb的抗体实现的ffpe样品中的染色、任选地细胞膜(细胞表面)染色确定的)，则用该治疗性干预治疗该个体。
[0146]
在任何实施方案中，可在没有确定或评估个体表达mica的哪个(些)等位基因的附加或先前步骤的情况下使用该抗体。在任何实施方案中，可跨人类群体使用该抗体。
[0147]
本文所述的抗体可用于检测(优选地在体外)表达mica和/或micb的细胞(例如肿瘤细胞)的存在。这种方法通常将涉及使取自个体的生物样品(例如，已脱蜡的ffpe样品)与
根据本公开的抗体接触以及检测由该抗体与生物样品之间的免疫反应引起的免疫复合物的形成。该复合物可直接地通过标记根据本公开的抗体来检测，或间接地通过添加揭示根据本发明的抗体的存在的分子(二抗、链霉亲和素/生物素标签等)来检测。例如，标记可通过使该抗体与放射性或荧光标签偶联来实现。这些方法是本领域技术人员熟知的。因此，本发明还涉及根据本公开的抗体用于制备诊断组合物的用途，该诊断组合物可用于检测表达mica和/或micb的细胞(例如，肿瘤细胞)的存在，任选地用于检测病变(其中存在表达mica和/或micb的细胞)的存在，任选地用于在体内或体外表征癌或其他病变。
[0148]
在一些实施方案中，本公开的抗体将可用于预测癌进展。癌预后、癌或癌进展的预后包括提供以下任一者或多者的预报或预测(预后)：易患癌或被诊断为患有癌的受试者的生存持续时间、易患癌或被诊断为患有癌的受试者的无复发生存持续时间、无进展生存持续时间、易患癌或被诊断为患有癌的受试者或受试者组中的治疗应答率、和/或受试者中治疗后的应答持续时间、应答程度或生存期。示例性生存期终点包括例如ttp(进展时间)、pfs(无进展生存)、dor(应答持续时间)和os(总生存期)。一般来讲，疾病进展和应答可根据标准的肿瘤应答标准约定，例如根据“实体瘤应答评估标准(response evaluation criteria in solid tumors)”(recist)v1.1(如eisenhauer,ea等人，实体瘤的新应答评估标准：修订的recist指南(new response evaluation criteria in solid tumours:revised recist guideline)(版本1.1)，《欧洲癌症杂志》(eur j cancer)，2009:45:228-247所详述；该文献的公开内容以引用方式并入本文)来确定。
[0149]
诊断mica/micb阳性肿瘤、预测癌进展和/或为患有癌的个体定制治疗方案可例如基于肿瘤或肿瘤旁组织样品中染色阳性的mica细胞的百分比的测量。就这一点而言，在用抗mica/micb抗体探询时在固定ihc样品中表现出一定百分比的染色阳性的细胞的患者将被视为mica/micb+并且将被选择以根据本文的教导内容来治疗。在此类实施方案中，当被测量为阳性细胞百分比时，表现出大于1％、大于5％、大于10％、大于20％、大于30％、大于40％或大于50％阳性细胞染色的肿瘤样品可被分类为mica/micb+。在某些方面，当被测量为阳性百分比时，mica/micb+肿瘤将在》50％的成分细胞中表达mica和/或micb。
[0150]
在其他实施方案中，可依据一定强度的mica和/或micb阳性细胞染色的百分比来预测患者诊断和/或选择。举例来说，》10％、任选地》20％的细胞表现出2+强度或更大的肿瘤可被视为适合用化学治疗剂或免疫治疗剂治疗。在其他实施方案中，当用抗mica/micb抗体染色并根据例如如本文所公开的标准ihc方案检查时，如果》10％、》20％、》30％、》40％或》50％的肿瘤细胞表现出1+强度或更大，则患者将为用化学治疗剂或免疫治疗剂治疗的候选者。在其他某些实施方案中，当用抗mica/micb抗体染色并根据例如如本文所公开的标准ihc方案检查时，如果》10％、》20％、》30％、》40％或》50％的肿瘤细胞表现出2+强度或更大，则个体将适合用化学治疗剂或免疫治疗剂治疗。
[0151]
在一些方面，可使用本文所公开的抗体来表征或评估取自患有癌的个体的组织样品(例如，肿瘤或肿瘤旁组织样品)以评估肿瘤中或肿瘤外周处的mica和/或micb多肽和/或表达mica和/或micb的细胞。
[0152]
在一个实施方案中，由表达mica和/或micb的细胞表征的癌或肿瘤(或患有此类癌或肿瘤的个体)可被鉴别为适合(例如，受益于)用化学治疗剂或免疫治疗剂(例如，耗竭抗mica和/或micb抗体)治疗。
[0153]
在一个实施方案中，本公开提供了用于有需要的个体中的癌的诊断、预后、监测和/或表征的体外方法，该方法包括提供取自个体的石蜡包埋肿瘤或肿瘤旁样品，以及使用特异性地结合固定组织样品(任选地石蜡包埋组织样品)中的人类mica和micb多肽的单克隆抗体来检测样品中的mica和/或micb多肽(例如，表达mica和/或micb的细胞)，其中mica和/或micb多肽的检测指示该个体适于(例如，受益于)用化学治疗剂或抗mica和/或micb治疗剂的治疗。抗mica和/或micb治疗剂可例如为结合人类mica和micb多肽的试剂，任选地其中该试剂是耗竭剂，例如具有wo2013/117647、wo2013/049527、wo2014/040903、wo2015/085210、wo2018/217688(例如，7c6抗体)、wo2018/081648和wo2019/183551(例如，1d5抗体)(这些专利的公开内容以引用方式并入本文)中所公开的任何已知抗体的重链和轻链cdr或可变区的抗mica抗体(或其功能保守变体)。此类试剂可用于治疗具有以可检测和/或升高水平的mica和/或micb表达为特征的肿瘤或肿瘤组织的个体。
[0154]
在一个实施方案中，本公开提供了用于有需要的个体中的头颈部鳞状细胞癌、肺癌(例如，nsclc)、间皮瘤、乳腺癌、雌激素阳性乳腺癌、雌激素阴性乳腺癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、黑色素瘤、尿路上皮癌、胰腺癌、肝细胞癌(hcc)或子宫内膜癌的治疗或预防的方法，该方法包括：
[0155]
a)任选地在取自该个体的福尔马林处理和/或石蜡包埋肿瘤组织样品(或肿瘤细胞样品)中的细胞表面处检测mica和/或micb多肽(例如，膜mica和/或micb染色)，以及
[0156]
b)在确定肿瘤样品(或肿瘤细胞)包含mica多肽(例如，表达mica的细胞)(任选地与参考水平相比其水平增加)后，向该个体施用抗癌剂，任选地结合人类mica和/或micb多肽的抗体或化学治疗剂。在一个实施方案中，该个体既往已接受化学治疗剂治疗(在步骤(a)之前)。检测mica和/或micb多肽可使用本公开的抗体进行。
[0157]
在任何方面，使用抗体来检测样品中的mica和/或micb多肽可包括以下步骤：使取自个体的生物样品(例如，已脱蜡的ffpe样品)与该抗体接触，以及检测由该抗体与生物样品之间的免疫反应引起的免疫复合物的形成。
[0158]
还提供了例如用于癌的诊断或预后试剂盒，该试剂盒包含根据本公开的用于检测mica和/或micb的抗体。任选地，该试剂盒包含本发明的抗体以及结合非mica/micb多肽以用作诊断或预后的抗体(例如，1、2、3、4、5、10种或更多种抗体)。所述试剂盒另外可包含用来检测由生物(例如，肿瘤组织)样品与抗体之间的免疫反应产生的免疫复合物的装置，特别是实现所述抗体的检测的试剂。
[0159]
本发明方法可用于一系列癌的研究、评估、诊断、预后和/或监测，这些癌例如为头颈部鳞状细胞癌、肺癌(例如，nsclc)、间皮瘤、乳腺癌、雌激素阳性乳腺癌、雌激素阴性乳腺癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、黑色素瘤、尿路上皮癌、胰腺癌、肝细胞癌(hcc)或子宫内膜癌。
[0160]
实施方案：
[0161]
1.一种能够特异性地结合人类mica多肽和人类micb多肽的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no:7的重链可变区序列的三个cdr和seq id no:8的轻链可变区序列的三个cdr，其中cdr根据kabat编号来确定。
[0162]
2.一种能够特异性地结合人类mica和micb多肽的抗体或抗体片段，其中此类结合位于表达此类mica和/或micb多肽并且已被制备为石蜡包埋细胞团块的细胞样品中，其中
所述抗体或抗体片段包含具有与seq id no:7的氨基酸序列有至少80％、任选地至少90％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域以及具有与seq id no:8的氨基酸序列有至少80％、任选地至少90％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。
[0163]
3.根据实施方案1或2所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与可检测部分缀合或共价结合。
[0164]
4.根据上述实施方案中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica的细胞的样品中的mica多肽，但不结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的mica和micb阴性细胞，任选地raji细胞。
[0165]
5.根据上述实施方案中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica*001的细胞的样品中的mica*001多肽，并且进一步结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica*008的细胞的样品中的mica*008多肽。
[0166]
6.根据上述实施方案中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达micb的细胞的样品中的micb多肽，但不结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的mica和micb阴性细胞，任选地raji细胞。
[0167]
7.根据上述实施方案中任一项所述的抗体或抗体片段，其中抗体或抗体片段结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的bxpc-3细胞；任选地其中所述抗体或抗体片段能够在所述抗体以低浓度(1μg/ml)
[0168]
提供时对已被制备为石蜡包埋细胞团块的bxpc-3细胞进行染色，任选地进一步其中所述抗体或抗体片段能够在所述抗体以低浓度(1μg/ml)、中等浓度(5μg/ml)和高浓度(10μg/ml)提供时对已被制备为石蜡包埋细胞团块的bxpc-3细胞进行染色。
[0169]
8.根据实施方案2至7中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no:7的重链可变区序列的三个cdr和seq id no:8的轻链可变区序列的三个cdr，其中cdr根据kabat编号来确定。
[0170]
9.根据上述实施方案中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与包含具有seq id no:7的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no:8的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争性地结合由被制备为石蜡包埋细胞样品的细胞(例如，表达mica的细胞)表达的人类mica多肽。
[0171]
10.一种在取自人类个体的样品内检测mica和/或micb多肽的体外方法，所述方法包括提供取自所述个体的石蜡包埋样品，以及使用根据实施方案1至9所述的抗体或抗体片段来检测所述样品中的mica多肽。
[0172]
11.一种在取自人类个体的样品内检测mica和/或micb多肽的体外方法，所述方法包括提供取自所述个体的石蜡包埋样品，以及使用抗体或抗体片段来检测所述样品中的mica多肽，所述抗体或抗体片段结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica*001的细胞的样品中的人类mica*001多肽，结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica*008的细胞的样品中的人类mica*008多肽，并且结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达micb的细胞的样品中的人类micb多肽，但不结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的mica和micb阴性细胞，任选地raji细胞。
[0173]
12.根据实施方案11所述的方法，其中抗体或抗体片段结合已被制备为石蜡包埋
细胞团块的bxpc-3细胞；任选地其中所述抗体或抗体片段能够在所述抗体以低浓度(1μg/ml)提供时对已被制备为石蜡包埋细胞团块的bxpc-3细胞进行染色，任选地进一步其中所述抗体或抗体片段能够在所述抗体以低浓度(1μg/ml)、中等浓度(5μg/ml)和高浓度(10μg/ml)提供时对已被制备为石蜡包埋细胞团块的bxpc-3细胞进行染色。
[0174]
13.根据实施方案11或12所述的方法，其中抗体或抗体片段是根据实施方案1至9所述的抗体或抗体片段。
[0175]
14.根据实施方案11或12所述的方法，其中所述抗体或抗体片段是包含具有seq id no:7的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no:8的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；与包含具有seq id no:7的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no:8的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争性地结合由被制备为石蜡包埋细胞样品的细胞表达的人类mica多肽的抗体或抗体片段；或包含具有seq id no:7的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no:8的氨基酸序列的轻链可变区的所述抗体或抗体片段的功能保守变体。
[0176]
15.根据实施方案10至14中任一项所述的方法，其中检测mica和/或micb多肽的所述步骤包括使所述样品与所述抗体或抗体片段接触，以及检测由所述抗体或抗体片段与所述样品之间的免疫反应引起的免疫复合物的形成。
[0177]
16.根据实施方案10至14中任一项所述的方法，其中检测mica和/或micb多肽的所述步骤包括使所述样品与所述抗体或抗体片段接触，以及检测由所述抗体或抗体片段与所述样品之间的免疫反应引起的免疫复合物在细胞膜处的形成。
[0178]
17.根据实施方案10至16中任一项所述的方法，其中所述样品是肿瘤组织。
[0179]
18.根据实施方案10至17中任一项所述的方法，其中所述个体患有头颈部鳞状细胞癌、肺癌(例如，nsclc)、间皮瘤、乳腺癌、雌激素阳性乳腺癌、雌激素阴性乳腺癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、黑色素瘤、尿路上皮癌、胰腺癌、肝细胞癌(hcc)或子宫内膜癌。
[0180]
19.根据实施方案10至18中任一项所述的方法，其中所述个体是已接受、正接受抗mica抗体或抗体片段治疗或为抗mica抗体或抗体片段治疗的候选者的个体。
[0181]
20.根据实施方案10至19中任一项所述的方法，其中所述个体是既往已接受化学治疗剂治疗的个体。
[0182]
21.根据上述实施方案中任一项所述的方法或组合物，其中所述石蜡包埋组织样品已被固定、包埋于石蜡中、切片、脱蜡并转移到玻片。
[0183]
22.根据上述实施方案中任一项所述的方法或组合物，其中mica和/或micb多肽使用特异性地结合与mica和/或micb多肽结合的所述抗体的二抗来检测。
[0184]
23.一种在既往已接受化学治疗剂治疗的个体中评估mica和micb表达的体外方法，所述方法包括提供取自所述个体的石蜡包埋肿瘤或肿瘤旁组织样品，以及使用抗体或抗体片段来检测所述样品中的mica和/或micb多肽，所述抗体或抗体片段结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica*001的细胞的样品中的人类mica*001多肽，结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica*008的细胞的样品中的人类mica*008多肽，并且结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达micb的细胞的样品中的人类micb多肽，但不结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的mica和micb阴性细胞，其中mica和/或micb多肽的检测指示所述个体适合用治疗剂治疗，任选地其中所述治疗剂是结合人类mica和/或micb多肽的抗体。
[0185]
24.一种评估患有肿瘤的个体对于用治疗剂治疗的适合性的体外方法，所述方法包括提供取自所述个体的石蜡包埋肿瘤或肿瘤旁组织样品，以及使用根据实施方案1至9所述的抗体或抗体片段或根据实施方案10至22中任一项所述的方法来检测所述样品中的mica和/或micb多肽，其中mica和/或micb多肽的检测指示所述个体适合用治疗剂治疗，任选地其中所述治疗剂是结合人类mica和/或micb多肽的抗体。
[0186]
25.根据实施方案23至24所述的方法，所述方法还包括向所述个体施用结合人类mica和/或micb多肽的所述抗体的步骤。
[0187]
26.根据实施方案10至25所述的方法，其中所述个体既往已接受已知能够引起肿瘤细胞的mica和/或micb表达的上调的放射或化学治疗剂治疗。
[0188]
27.一种在患有癌的个体中预测癌进展的方法，所述方法包括提供取自所述个体的石蜡包埋肿瘤组织样品，以及依照根据实施方案9至21中任一项所述的方法或使用根据实施方案1至9中任一项所述的抗体或抗体片段来检测所述样品中的mica多肽。
[0189]
28.根据实施方案27所述的方法，其中所述样品中的mica多肽的检测(或与参考值相比更大数量的此类表达mica的细胞的检测)指示所述个体具有癌进展的不良预后。
[0190]
29.根据实施方案10至28中任一项所述的方法，其中使用抗体来检测所述样品中的细胞包括：
[0191]
●
获得包含细胞的生物样品(例如，作为活检样品)；
[0192]
●
对所述样品进行固定、包埋于石蜡中并脱蜡，并且任选地将所述样品转移到玻片；
[0193]
●
使所述切片与所述抗体接触；以及
[0194]
●
检测所述切片内结合抗体的存在。
[0195]
30.一种包含根据实施方案1至9中任一项所述的抗体或抗体片段的试剂盒，任选地其中所述试剂盒还包含特异性地识别根据实施方案1至9中任一项所述的抗体的标记二抗。
[0196]
31.一种包含根据实施方案1至9中任一项所述的抗体或抗体片段以及治疗性、任选地耗竭和/或中和抗mica抗体的试剂盒。
[0197]
32.一种编码根据实施方案1至9所述的抗体或抗体片段的核酸或核酸组。
[0198]
33.一种产生根据实施方案1至9所述的抗体或包含根据实施方案32所述的核酸的杂交瘤或重组宿主细胞。
[0199]
34.一种产生特异性地结合石蜡包埋组织中的人类mica和micb多肽的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
[0200]
a)提供在其表面处表达mica多肽的细胞，提供在其表面处表达micb多肽的细胞，以及提供在其表面处既不表达mica也不表达micb多肽的细胞，并且对于每个所述细胞而言，制备单独的石蜡包埋细胞样品；
[0201]
b)提供多个候选抗体；以及
[0202]
c)从所述多个中制备或选择结合步骤a)的表达mica的所述石蜡包埋细胞并结合步骤a)的表达micb的所述石蜡包埋细胞，但不结合步骤a)的在其表面处既不表达mica也不表达micb的所述石蜡包埋细胞的抗体。
[0203]
35.根据实施方案34所述的方法，所述方法还包括制备所选择的抗体的衍生物的
步骤。
[0204]
36.根据实施方案35所述的方法，其中制备衍生物包括使所述抗体与可检测部分缀合或共价结合。
[0205]
37.根据实施方案34至36所述的方法，其中所述mica多肽是mica*001多肽。
[0206]
38.根据实施方案34至37所述的方法，其中所述方法包括：
[0207]
a)提供在其表面处表达mica*001多肽的细胞，提供在其表面处表达mica*008多肽的细胞，提供在其表面处表达micb多肽的细胞，以及提供在其表面处既不表达mica也不表达micb多肽的细胞，并且对于每个所述细胞而言，制备单独的石蜡包埋细胞样品；
[0208]
b)提供一个候选抗体或多个候选抗体；以及
[0209]
c)测试所述候选抗体对以下细胞的结合，或从所述多个候选抗体中制备或选择结合以下细胞的抗体：步骤a)的表达mica*001的所述石蜡包埋细胞、步骤a)的表达mica*008的所述石蜡包埋细胞以及步骤a)的表达micb的所述石蜡包埋细胞，但不结合步骤a)的在其表面处既不表达mica也不表达micb的所述石蜡包埋细胞。
[0210]
39.一种依照根据实施方案34至38所述的方法获得或产生的抗体。
[0211]
40.一种依照根据实施方案34至39所述的方法获得或产生的抗体，所述抗体用于在取自人类个体的样品内检测mica和/或micb多肽的方法，任选地用于根据实施方案10至29中任一项所述的方法。
[0212]
本发明的另外方面和优点将在下面的实验部分中公开，该实验部分应当被认为是例示性的而不是限制本技术的范围。
[0213]
实施例
[0214]
实施例1：bamo1抗体在ffpe样品中的性能
[0215]
mica及其近缘micb是nk细胞活化型受体nkg2d的高度多态性配体。mica和micb由细胞应激(诸如感染和肿瘤转化)在细胞表面处诱导。实际上，mica在若干高度普遍的实体瘤(包括乳腺、结肠直肠和肺)上特异性地表达。为了确定抗mica/b治疗性抗体的治疗指征，需要通过免疫组织化学(ihc)来评估不同ffpe肿瘤样品中的mica/b表达。肿瘤中的阳性细胞百分比以及细胞质或膜表达水平将有助于确定抗mica/b治疗性抗体的合适指征。
[0216]
本研究的目标是测试不同方法以尝试改善使用可用抗体的mica/b人工免疫染色的灵敏度。抗体bamo1(安迪生物科技公司(r&d systems inc.))被描述为能够检测人类胰腺的福尔马林固定石蜡包埋组织切片中的mica，并且被选择以进行测试。
[0217]
为了评估mica/b染色灵敏度的改善，选择具有低表达水平的mica/b的细胞系。挑战实际上是通过ihc检测甚至更低的表达。为了评估用于ffpe切片中的mica/b检测的抗体，将mica/b阳性和阴性细胞解冻并培养，然后固定并包埋于石蜡中以进行ihc染色。表3汇总了所使用的细胞。
[0218]
表3
[0219][0220]
先前的流式细胞术表型分析研究允许我们预先选择具有低表达水平的mica/b的不同细胞系。为了确认该选择，再次通过流式细胞术来评估这些细胞上的mica/b表达水平。bxpc-3、hs 700t、ht-29和mia paca-2细胞全都以相对较低的水平表达mica/b。
[0221]
一旦通过流式细胞术确认了细胞表型(mica/b阳性)，就将这些细胞固定并包埋于石蜡中以进行ihc染色。
[0222]
结果表明，使用bamo1抗体在mia paca-2细胞上清楚检测到mica/b表达。在hs 700t和ht-29细胞上，染色呈阳性但并未在所有细胞上染色。使用bamo1抗体在bxpc-3细胞上未检测到mica/b表达。尽管通过流式细胞术检测到mica/b表达，但是一些细胞系并未显示出由ihc实现的任何mica/b染色。这表明初始方案的灵敏度不足以检测低表达水平的mica/b。因此选择这些细胞以测试mica/b染色灵敏度的改善。
[0223]
测试了若干条件以优化mica/b ihc染色并且测试了以下条件：
[0224]
●
洗涤步骤：束流与浴槽
[0225]
●
在初级温育之前与之后封闭内源性过氧物酶
[0226]
●
二氨基联苯胺(dab)温育：5分钟与20分钟
[0227]
●
酪胺系统放大(tsa)
[0228]
●
envision flex试剂盒(一抗与hrp二抗之间的接头)
[0229]
使用tsa，在mia paca-2细胞上、在bxpc-3细胞上并且在较小程度上在ht-29细胞上检测到mica/b表达。遗憾的是，这些结果不可再现(尤其是染色在重复实验过程中不一致的bxpc3细胞)并且染色强度仍然较低。
[0230]
qifikit用于获得mica/b细胞表面表达的定量确定。使用qifikit在所选择的细胞系上执行四个实验。不同细胞系的细胞表面上发现的抗原数量在不同实验中是等同的。表2所示的数据代表这4个实验。所选择的细胞可基于细胞表面抗原位点来分类：mia paca-2》bxpc3》hs700t》ht-29。值得注意的是，qifikit仅评估细胞表面抗原而不评估细胞质抗原。由于bamo1不能始终通过ihc来检测bxpc3，我们可假设使用抗体bamo1通过ihc来检测hs700t细胞，因为与bxpc-3相比，它们很可能表达更多的细胞质mica/b。
[0231]
表2
[0232] qifikit
–
abc值计算微珠
–
阴性对照1197ht-29细胞6411hs 700t细胞13972bxpc3细胞16319mia paca2细胞23062
[0233]
无法优化在福尔马林固定石蜡包埋样品上使用bamo1的mica/b ihc染色。此外，由于该抗体不允许使用少量细胞表面mica/b蛋白质始终对细胞进行染色，因此认为通过ihc来在ffpe样品上检测mica/b表达是有问题的。
[0234]
实施例2：对ffpe样品中具有低细胞表面mica/b的细胞进行染色的抗体的鉴别
[0235]
由于用于ffpe样品上的ihc的令人满意的抗体不可用，因此对小鼠进行免疫接种并且执行筛选以鉴别可一致且特异性地对具有低mica/b表达的细胞进行染色的抗体。
[0236]
简而言之，使用用3种蛋白质(mica*001、mica*008和micb)免疫接种的五(5)只balb/c小鼠执行免疫接种。通过c1rneo、c1r mica*008和c1r micb ffpe细胞团块上的ihc来测试取自这五只不同动物的血清。选择三只动物来进行融合，因为取自这些动物的血清允许以强染色强度对大量mica/b细胞进行染色。在杂交瘤培养和选择之后，通过ihc使用手动方案在2种抗原修复条件(ph6和8)下在ffpe细胞团块(c1r mica*008+c1r micb细胞的混合物)上以及使用采用ventana discovery ultra自动机和cc1或cc2预处理的自动化方案在raji、bxpc-3、c1r mica*001、c1r mica*008和c1r micb ffpe细胞团块上测试508份上清液(未稀释)。下文将进一步详述该实验。
[0237]
将不同细胞系解冻并且传代培养。将raji、c1r-neo、bxpc-3、c1r mica*001、c1r mica*008和c1r micb培养于补充有10％去补体的(decomplemented)胎牛血清(fbs)、1％ l-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸和1％丙酮酸钠的洛斯维帕克纪念研究所(roswell park memorial institute)培养基(rpmi)(gibco)中。使raji、c1r-neo、c1r mica*001、c1r mica*008和c1r micb悬浮生长。bxpc-3是贴壁细胞并且使用pbs-edta 2mm来分离。用遗传霉素1.8mg/ml选择c1r mica*001、c1r mica*008和c1r micb。在培养结束时以及在raji细胞传代6次、bxpc3传代7或8次、c1r-neo传代2次、c1r mica*001传代2次、c1r mica*008传代3次以及c1r micb传代3或4次之后，将细胞在福尔马林中固定并包埋于石蜡中。
[0238]
在包埋之前，用抗mica/b单克隆抗体(mab；克隆19e9，参见wo2013/117647)(pe缀合)、抗mica单克隆抗体(mab；克隆20c6，参见wo2013/117647)(pe缀合)和商业抗micb单克隆抗体(mab；236511r&d)(pe缀合)对细胞进行染色，并且通过流式细胞术来分析细胞以评估mica/b、mica和micb表达。在raji细胞上未观察到mica/b表达并且在c1r-neo上观察到极低的内源性mica/b表达。在bxpc-3细胞上观察到低mica表达。最后，发现c1r mica*001和c1r mica*008细胞呈强mica阳性并且c1r micb细胞呈micb阳性。
[0239]
本研究中使用的细胞系的特性汇总如下：
[0240]-没有mica/b表达的raji细胞(生物体：智人(homo sapiens)，人类/细胞类型：b淋巴细胞/组织：淋巴母细胞/疾病：伯基特淋巴瘤/来源：atcc)
[0241]-具有极低内源性mica/b表达的c1r-neo细胞(生物体：智人(homo sapiens)，人类/细胞类型：b淋巴母细胞；爱泼斯坦-巴尔病毒转化/组织：外周血淋巴瘤/atcc参考号crl-2369)
[0242]-具有低内源性mica表达的bxpc-3细胞(生物体：智人(homo sapiens)，人类/组织：胰腺/疾病：腺癌淋巴瘤/atcc参考号crl-1687)
[0243]-c1r mica*001细胞：用人类mica*001转染的c1r-neo细胞(高mica*001表达水平)
[0244]-c1r mica*008细胞：用人类mica*008转染的c1r-neo细胞(高mica*008表达水平)
[0245]-c1r micb：用人类micb*002转染的c1r-neo细胞(高micb表达水平)
[0246]
在通过流式细胞术进行表型分析的同时，将细胞系在福尔马林中固定并包埋于石蜡中。简而言之，用福尔马林4％固定20x106至40x106个细胞1小时。将细胞在pbs中洗涤两次，然后重悬于histogel中。将细胞团块脱水并且包埋于石蜡中。对于每种细胞系而言，制备若干ffpe细胞团块。还将细胞(c1r mica*008(15.106个细胞)和c1r micb(15.106个细胞))包埋于石蜡中。执行ffpe细胞团块的切片并且通过ihc来进行mica/b染色。简而言之，将5μm厚的切片温育、脱蜡、送交抗原修复步骤并且与免疫或非免疫血清、杂交瘤上清液、链组合ab或纯化和商业ab一起温育，之后进行信号放大步骤。最后使用3,3
’‑
二氨基联苯胺(dab)执行酶显色。对于采用小鼠血清的ihc染色而言，通过归属团块切片中染色细胞的百分比以及使用以下标准的强度评分来进行染色解释：
“‑”
：阴性染色；“+”：弱阳性染色；“++”：强度中等的ihc信号以及“+++”：强阳性染色。
[0247]
首先使用mica/b重组蛋白(mica*001、mica*008和micb)(2次腹膜内注射)与经ihc测试的血清的混合物对五只balb/c小鼠进行免疫接种。通过ihc在3种不同稀释度(1/1000、1/5000和1/10000)和3种不同抗原修复条件(ph6、ph8和ph9)下在c1r neo细胞及c1r mica*008+c1r micb ffpe细胞团块的混合物上测试免疫前血清和免疫血清。
[0248]
使用免疫前血清时未见任何染色。由于在血清以1/5000或1/10000稀释时在c1r mica*008+c1r micb的混合物上获得较弱且异质的染色，因此决定执行第三次腹膜内注射以增强免疫应答。在该第三次注射后再次通过ihc来测试取自这5只小鼠的血清并且我们观察到第三次注射后总体更强的反应性。取自3只小鼠的血清得到最佳结果(有更高数量强染色强度的c1r mica*008和c1r micb染色细胞)。相比之下，取自另一只小鼠的血清以更低强度对c1r mica*008和c1r micb细胞进行染色；并且另一只小鼠在以1/5000和1/10000使用时对更少数量的c1r mica*008细胞进行染色并在以1/5000和1/10000使用时未获得染色c1r micb细胞。选择得到最佳结果的3只小鼠进行最后加强(mica/b重组蛋白混合物的静脉内注射)。对动物施行安乐死并且摘除其脾并将该脾用作与骨髓瘤细胞融合的细胞源。在甲基纤维素半固体培养基中培养之后，挑取杂交瘤集落并将其培养于27个不同的96孔板中。然后，执行elisa以仅选择分泌igg的小鼠杂交瘤。该测试之后进行另一elisa并且测试先前鉴别的阳性杂交瘤(分泌igg)以消除抗标签杂交瘤。最后，保留了508个杂交瘤，对其进行扩增并且产生1.5ml的上清液/杂交瘤。
[0249]
首先通过ihc使用不同抗原修复条件(ph6、ph8)在c1r mica*008+c1r micb ffpe细胞团块切片的混合物上测试上清液。在508份上清液之中，选择了46份(其中11份对ph6和ph8均呈阳性)，因为它们在c1r mica*008+c1r micb细胞的混合物上得出了最佳结果(强阳性和均质的染色)。
[0250]
在c1r mica*008+c1r micb细胞的混合物上实现染色的46份上清液再次通过ihc在cc1或cc2预处理的情况下在ventana上的c1r-neo、bxpc-3、cr1 mica*001、c1r mica*008和c1r micb ffpe细胞团块切片上测试。由于它们在所测试的所有阳性细胞上实现了最强染色并且在c1r-neo细胞上没有染色或有弱染色，因此选择并产生6份上清液(包括12c9)作为具有小鼠γ1(γ1)链的小鼠抗体(migg1同种型)。
[0251]
同时，在c1r mica*008+c1r micb细胞的混合物上部分呈阳性的66份上清液再次在ventana上的raji、bxpc-3、cr1 mica*001、c1r mica*008、c1r micb ffpe细胞团块切片上测试。由于它们实现了最强染色并且对mica或micb具有特异性，因此选择并产生三份上
清液(一份是mica特异性的，另两份是micb特异性的)。
[0252]
在过渡转染(transitional transfection)之后，通过ihc使用cc1discovery细胞调理1(cc1)或ribocc(cc2)预处理条件在ventana discovery ultra自动机上的raji、bxpc-3、c1r mica*001、c1r mica*008、c1r micb ffpe细胞团块切片上选择并测试的每种抗体获得了不同重排。六个抗体在所测试的所有细胞上实现了阳性染色并且在raji细胞上没有染色。选择并产生这些抗体作为具有小鼠γ1(γ1)链的小鼠抗体(migg1同种型)。
[0253]
通过ihc使用cc1或cc2预处理条件在ventana自动机上3种不同浓度(1、5和10μg/ml)的raji、bxpc-3、c1r mica*001、c1r mica*008、c1r micb ffpe细胞团块切片中测试了所产生并经纯化的抗体。
[0254]
所测试的三个抗体(包括12c9)在mica和micb转染的细胞上实现了强膜染色并且在raji细胞上没有染色。在所测试的染色条件下，这些抗体中的两个抗体显示出在低浓度(1μg/ml)下在bxpc-3上没有染色或只有很弱的染色并且在中等浓度(5μg/ml)和高浓度(10μg/ml)下具有异质染色。仅12c9展示出在所测试的三种浓度下对bxpc-3ffpe细胞团块切片进行染色的能力。
[0255]
下面示出了12c9的重链和轻链可变区的氨基酸序列(kabat cdr带下划线)。
[0256]
12c9重链可变区(vh)：
[0257]
eiqlqqsgpelekpgasvkisckasgyaftgyymnwmkqrngksl dwigtinpyygsstynqkfkgkatltvdessstaymqltsltsedsavyy carvdgdhgyfdywgrgttltvss(seq id no:7)
[0258]
12c9轻链可变区(vl)：
[0259]
dvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvstrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsthvpftfgsgtkleik
[0260]
(seq id no:8)

技术特征：
1.一种能够特异性地结合人类mica多肽和人类micb多肽的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no:7的重链可变区序列的三个cdr和seq id no:8的轻链可变区序列的三个cdr，其中cdr根据kabat编号来确定。2.一种能够特异性地结合人类mica和micb多肽的抗体或抗体片段，其中此类结合位于表达此类mica和/或micb多肽并且已被制备为石蜡包埋细胞团块的细胞样品中，其中所述抗体或抗体片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与seq id no:7的氨基酸序列具有至少80％、任选地至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与seq id no:8的氨基酸序列具有至少80％、任选地至少90％同一性的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与可检测部分缀合或共价结合。4.根据上述权利要求中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica的细胞的样品中的mica多肽，但不结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的mica和micb阴性细胞，任选地raji细胞。5.根据上述权利要求中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica*001的细胞的样品中的mica*001多肽，并且进一步结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica*008的细胞的样品中的mica*008多肽。6.根据上述权利要求中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达micb的细胞的样品中的micb多肽，但不结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的mica和micb阴性细胞，任选地raji细胞。7.根据上述权利要求中任一项所述的抗体或抗体片段，其中抗体或抗体片段结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的bxpc-3细胞；任选地其中所述抗体或抗体片段能够在所述抗体以低浓度(1μg/ml)提供时对已被制备为石蜡包埋细胞团块的bxpc-3细胞进行染色，任选地进一步其中所述抗体或抗体片段能够在所述抗体以低浓度(1μg/ml)、中等浓度(5μg/ml)和高浓度(10μg/ml)提供时对已被制备为石蜡包埋细胞团块的bxpc-3细胞进行染色。8.根据权利要求2至7中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no:7的重链可变区序列的三个cdr和seq id no:8的轻链可变区序列的三个cdr，其中cdr根据kabat编号来确定。9.根据上述权利要求中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与包含具有seq id no:7的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no:8的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争性地结合由被制备为石蜡包埋细胞样品的细胞(例如，表达mica的细胞)表达的人类mica多肽。10.一种在取自人类个体的样品内检测mica和/或micb多肽的体外方法，所述方法包括提供取自所述个体的石蜡包埋样品，以及使用根据权利要求1至9所述的抗体或抗体片段来检测所述样品中的mica多肽。11.一种在取自人类个体的样品内检测mica和/或micb多肽的体外方法，所述方法包括提供取自所述个体的石蜡包埋样品，以及使用抗体或抗体片段来检测所述样品中的mica多肽，所述抗体或抗体片段结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica*001的细胞的样品中的人类mica*001多肽，结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达mica*008的细胞的样品
中的人类mica*008多肽，并且结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的表达micb的细胞的样品中的人类micb多肽，但不结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的mica和micb阴性细胞，任选地raji细胞。12.根据权利要求11所述的方法，其中抗体或抗体片段结合已被制备为石蜡包埋细胞团块的bxpc-3细胞；任选地其中所述抗体或抗体片段能够在所述抗体以低浓度(1μg/ml)提供时对已被制备为石蜡包埋细胞团块的bxpc-3细胞进行染色，任选地进一步其中所述抗体或抗体片段能够在所述抗体以低浓度(1μg/ml)、中等浓度(5μg/ml)和高浓度(10μg/ml)提供时对已被制备为石蜡包埋细胞团块的bxpc-3细胞进行染色。13.根据权利要求11或12所述的方法，其中抗体或抗体片段是根据权利要求1至9所述的抗体或抗体片段。14.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述抗体或抗体片段是包含具有seq id no:7的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no:8的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；与包含具有seq id no:7的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no:8的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争性地结合由被制备为石蜡包埋细胞样品的细胞表达的人类mica多肽的抗体或抗体片段；或包含具有seq id no:7的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no:8的氨基酸序列的轻链可变区的所述抗体或抗体片段的功能保守变体。15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中检测mica和/或micb多肽的步骤包括使所述样品与所述抗体或抗体片段接触，以及检测由所述抗体或抗体片段与所述样品之间的免疫反应引起的免疫复合物的形成。16.根据权利要求10至15中任一项所述的方法，其中所述样品是肿瘤组织。17.根据权利要求10至16中任一项所述的方法，其中所述个体患有头颈部鳞状细胞癌、肺癌(例如，nsclc)、间皮瘤、乳腺癌、雌激素阳性乳腺癌、雌激素阴性乳腺癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、黑色素瘤、尿路上皮癌、胰腺癌、肝细胞癌(hcc)或子宫内膜癌。18.根据权利要求10至17中任一项所述的方法，其中所述个体是已接受、正接受抗mica抗体或抗体片段治疗或为抗mica抗体或抗体片段治疗的候选者的个体。19.根据权利要求10至18中任一项所述的方法，其中所述个体是既往已接受化学治疗剂治疗的个体。20.根据上述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中所述石蜡包埋组织样品已被固定、包埋于石蜡中、切片、脱蜡并转移到玻片。21.根据上述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中mica和/或micb多肽使用特异性地结合与mica和/或micb多肽结合的所述抗体的二抗来检测。22.一种在患有癌的个体中预测癌进展的方法，所述方法包括提供取自所述个体的石蜡包埋肿瘤组织样品，以及依照根据权利要求9至21中任一项所述的方法或使用根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗体片段来检测所述样品中的mica多肽。23.根据权利要求10至22中任一项所述的方法，其中使用抗体来检测所述样品中的细胞包括：
·
获得包含细胞的生物样品(例如，作为活检样品)；
·
对所述样品进行固定、包埋于石蜡中、切片并脱蜡，并且任选地将所述样品转移到玻
片；
·
使所述切片与所述抗体接触；以及
·
检测所述切片内结合抗体的存在。24.一种试剂盒，包含根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗体片段，任选地其中所述试剂盒还包含特异性地识别根据权利要求1至9中任一项所述的抗体的标记二抗。25.一种编码根据权利要求1至9所述的抗体或抗体片段的核酸或核酸组。26.一种产生根据权利要求1至9所述的抗体或包含根据权利要求25所述的核酸的杂交瘤或重组宿主细胞。27.一种产生特异性地结合石蜡包埋组织中的人类mica和micb多肽的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供在其表面处表达mica多肽的细胞，提供在其表面处表达micb多肽的细胞，以及提供在其表面处既不表达mica也不表达micb多肽的细胞，并且对于所述细胞中的每个细胞，制备单独的石蜡包埋细胞样品；b)提供多个候选抗体；以及c)从所述多个中制备或选择结合步骤a)的表达mica的所述石蜡包埋细胞并结合步骤a)的表达micb的所述石蜡包埋细胞，但不结合步骤a)的在其表面处既不表达mica也不表达micb的所述石蜡包埋细胞的抗体。

技术总结
本发明涉及用于特异性地检测石蜡包埋组织样品中的MICA和MICB多肽的研究和诊断工具。本发明还涉及使用所述工具特别是在肿瘤组织中检测MICA和MICB多肽的方法。中检测MICA和MICB多肽的方法。


技术研发人员：M
受保护的技术使用者：先天制药公司
技术研发日：2021.08.06
技术公布日：2023/8/6