鉴定传染原的方法

1.本发明涉及医学，特别是微生物学和传染病领域。


背景技术：

2.传染原的直接检测、鉴定、分类、定量和表征传统上是通过基于培养、抗原检测/定量、通过目标扩增方法(qpcr、qtma、lamp等)的dna或rna基因组检测/定量和/或通过靶向测序(包括sanger测序或下一代测序[ngs])的dna或rna序列分析的方法来进行。然而，所有这些方法都有局限性，如表1所示。
[0003][0004]
传染综合征的症状通常不是病毒、真菌、细菌或寄生虫病原学特有的。然而，医学
微生物学被人为地分为与每个病原体家族相对应的不同亚专业，主要是因为诊断这些传染原的技术不同。
[0005]
最先进的微生物学技术的主要局限性是检测到的传染原的谱有限。实际上，除了在没有先验条件下生长的细菌/真菌培养物外，这些方法只能检测数量非常有限的预定传染原(例如对于当前的综合征qpcr组(panels)，一种到少于二十种病原体，包括细菌、病毒、真菌和/或寄生虫)。如流行病学研究中所述，可检测和表征的预定传染原列表基于这些病原体作为相应传染综合征中致病原的频率。然而，许多可能导致这些传染的传染原被忽略了，而它们的频率不断变化，并可能在气候变化、大规模迁移、流行病、新的医疗实践(例如移植、免疫抑制、抗传染治疗
……
)等的背景下急剧增加。这些变化无法通过当前寻找有限的预定传染原组的诊断分析反映出来，这些传染原需要不断更新和增加，从而在客户实验室中产生高昂的开发和认证成本。
[0006]
这种情况强调需要一种能够检测、鉴定、分类、量化和表征的技术，而无需预先确定任何导致人类或动物传染的病原体。此外，需要一种能够在常规实践中发现迄今为止未知的新传染性病原体的技术，以填补流行病学和病理生理学知识空白。
[0007]
还需要一种技术能够提供有关分析样品中存在的任何病原体数量的信息。在特定情况下，此信息对于衡量疾病的严重程度、确认病原体在症状中的作用、确定传染的预后、做出治疗决定和/或遵循抗传染治疗的功效是必要的。目前，只有在单一病原体测定基础上(例如hiv、cmv、hcv、hbv)，才能使用目标扩增方法和少量预定病原体进行量化。对于其他传染原，仅开发了内部单一病原体测定方法，其无法转移到常规诊断实验室，而且市场太小，无法确保未来标准化商业检测方法的开发。
[0008]
标准培养可以诊断细菌或真菌传染，但它们很耗时，并且由于培养性能、病原体存活的需要、在培养中生长不良或需要具体条件的病原体的特征，和/或通过施用抗生素而导致鉴定可能存在缺陷。最近靶向的宏基因组学工具提供了一种替代培养的方法。然而，他们的表现被证明不如传统培养。
[0009]
因此，确实需要一种新的快速可靠，无需先验的病原体鉴定方法。


技术实现要素：

[0010]
本发明提供了检测、鉴定、分类、量化和/或遗传表征传染原的方法。本发明满足了上述需求。特别地，本发明由以下权利要求限定。
[0011]
本发明涉及一种鉴定传染原的方法，包括以下步骤：
[0012]
a.提供核酸序列样品；
[0013]
b.从核酸序列样品中分离出高质量核酸序列；
[0014]
c.从高质量核酸序列中分离出至少一种非动物高质量核酸序列；
[0015]
d.从多个已知序列中鉴定最接近的已知序列，其中最接近的已知序列与多个已知序列中的至少一个非动物高质量核酸序列共享最大量的信息，并且其中多个已知序列包含传染原的序列，优选至少一个目标真菌鉴定基因，其中所述鉴定指示传染原。
[0016]
该方法使得检测、鉴定、分类、量化和/或遗传表征传染原成为可能。
[0017]
如本文所用，术语“传染原”是指引起动物传染的微生物。通常，生物体是病毒、细菌、寄生虫、原生动物和/或真菌。
[0018]
如本文所用，术语“动物”是指包括人类的所有哺乳动物。它还包括处于所有发育阶段的单个动物，包括胚胎和胎儿阶段。该术语包括农场动物(猪、山羊、绵羊、牛、马、兔等)、啮齿动物(例如小鼠)和家养宠物(例如猫和狗)。本发明的方法特别适用于鉴定人中的传染原。
[0019]
与其他已知技术不同，本发明可以足够准确地进行传染原的鉴定以应用于传染及其致病传染原的诊断。具体而言，该方法可以从污染物中区分目标传染原。为此，该方法可以进一步包括在于从去除任何目标核酸序列的样品中分离出高质量核酸序列的步骤。因此，如果在核酸序列样品中发现，所有鉴定的序列都被认为是污染物并被忽略。
[0020]
该方法还可以包括进一步的步骤，在于对含有至少一个已知序列的核酸序列样品重复步骤a)至d)。此步骤允许验证该方法的使用条件并检测任何异常。此外，可以使用截止值来解释属于一种正确鉴定的传染原的序列数量，以确定样品对于传染原的存在是否应被视为阴性或阳性。传染原的存在(阳性检测)可以列在可用于微生物实验室的医学解释的报告中。
[0021]
该方法还可以包括以下任何步骤：量化病原体载量，重建传染原的基因组并进行变异检出以鉴定与参考序列相比的核苷酸或氨基酸差异。
[0022]
如本文所用，术语“核酸序列”是指单链或双链形式的dna或rna分子。“分离的核酸序列”是指不再存在于其分离的自然环境中的核酸序列，例如细胞中的核酸序列。
[0023]
因此，核酸序列样品可能由大量dna和rna序列组成，但rna序列可能足以实现本发明方法的目标。样品可以通过任何方式获得。可从患者或动物身上采集的样品性质多种多样。事实上，该技术已在组织(来自各种器官的冷冻和石蜡包埋活检)和体液(脑脊液、支气管肺泡灌洗液、痰液、全血、血浆、血清、脓液、尿液、房水、骨髓、腹水等)上得到验证。
[0024]
优选地，管理工具可以监测来自多个患者或动物的多个样品并允许匿名跟踪目标样品。
[0025]
在一些实施方案中，步骤a)包括在于提取核酸序列的子步骤，并且其中监控所述子步骤以产生至少包括提取进度和样品来源的信息。
[0026]
为了提供核酸序列样品，可以进行在于样品的机械、酶促和化学裂解的组合的预提取，以及在于通过去除膜、脂质、蛋白质和任何其他细胞或细胞外成分的核酸的纯化的提取，以提供高质量核酸。
[0027]
本发明的方法对仅从rna序列中鉴定传染原特别有效。根据iso15189规范的建议，可以包括环境对照(阴性对照)和阳性对照(包含8种细菌、2种真菌和4种病毒)。
[0028]
在一些实施方案中，制备提取物的核酸序列文库，然后对所述核酸序列进行测序。
[0029]
如本文所用，术语“测序”是指确定核酸中核苷酸顺序的过程。用于对核酸进行测序的多种方法是本领域众所周知的并且可以使用。在一些实施方案中，进行下一代测序。如本文所用，术语“下一代测序”具有本领域的一般含义，并且是指与传统的基于sanger和毛细管电泳的方法相比具有更高通量的测序技术，例如能够产生一次读取数十万或数百万个相对较短的序列。下一代测序仪是本领域公知的并且可以包括基于不同技术的多种不同测序仪，例如illumina(solexa)测序、roche454测序、iontorrent测序、solid测序、pacbio测序等。可用于本方法的测序技术的一个例子是illumina平台。illumina平台基于使用折返pcr(fold-back pcr)和锚定引物(例如捕获寡核苷酸)在固体表面(例如流动池)上扩增dna
(在rna逆转录后)。为了使用illumina平台进行测序，dna会因此被片段化，并且将适配子添加到片段的两个末端(参见前面的步骤)。通过捕获能够与片段的适配子末端杂交的寡核苷酸，将dna片段附着在流动池通道的表面。然后将dna片段延伸并桥接扩增。在固相扩增随后变性的多个循环之后，产生了数百万个空间固定的核酸簇或单链核酸群的阵列。每个簇可能包含大约数百到一千个相同模板的单链dna分子拷贝。illumina平台使用合成测序方法，其中包含可检测标记(例如，荧光团)的测序核苷酸被连续添加到游离的3'羟基。核苷酸掺入后，可以使用特异于标记核苷酸的波长的激光来激发标记。捕获图像并记录核苷酸碱基的身份。可以重复这些步骤来对其余碱基进行测序。根据该技术的测序描述于例如美国专利公开申请号2011/0009278、2007/0014362、2006/0024681、2006/0292611和美国专利申请号第7,960,120、7,835,871、7,232,656和7,115,200号，每一个都通过引用整体并入本文。
[0030]
根据本发明，将获得多个读长。如本文所用，术语“读长”是指从核酸样品的一部分中读取的序列。通常，读长代表样品中连续碱基对的短序列。读长可以通过样品部分的a、t、c和g中的碱基对序列以及碱基正确性的概率估计(质量得分)来象征性地表示。
[0031]
根据本发明，可以确定生成的序列的质量，从而去除低质量的核酸序列。步骤b)中分离出的高质量核酸序列优选为质量得分高于预定阈值的序列，优选phred得分高于20。如本文所用，术语“phred得分”具有本领域的一般含义，并且代表自动测序产生的核碱基的鉴定质量。phred得分越高，质量越高。例如，phred得分为10代表碱基检出准确率为90％，而phred得分为20则代表碱基检出准确率为99％。此外，可以计算核酸序列的信息得分以进行额外过滤，以便仅保留包含有意义信息量的序列。例如，同聚物序列包含很少的鉴定信息，因为它可以对应许多不同的基因组。
[0032]
然后可以从获得的高质量/信息量序列中减去宿主细胞核酸序列，以便从中仅获得非动物核酸序列。可以实施用于分离至少一种非动物高质量核酸序列的任何其他方法。
[0033]
可以有利地进行后续轮次的删除以去除其他类型的核酸序列，例如哺乳动物、昆虫、植物序列等；以便仅保留目标序列，例如寄生虫、真菌、细菌或病毒。这些序列对应于待鉴定的传染原，然后将其序列与多个已知的传染原序列进行比较，以便从这多个已知序列中鉴定出最接近的已知序列。
[0034]
步骤d)的多个已知核酸序列可以例如存在于数据库中。通常，此类数据库包含细菌、病毒、真菌和/或寄生虫核酸序列。例如，这样的数据库可能来自国家生物技术信息中心(ncbi)数据库。通常，它包含丰富的ncbi数据库，该数据库由ncbi数据库组成，其中添加了已知的目标序列，以便提供多个与最初提供的核酸序列样品的来源尽可能相关的已知序列。ncbi数据库有利地使用分类学分类对每个系统发育点进行编号，即使分类单元有多个名称，也可以鉴定分类单元，而不管数据库中使用的名称如何。
[0035]
为了确定与待鉴定序列共享最高相似性的核酸序列，可以使用几种方法。优选的方法在于迭代地比较待确定的序列与多个已知序列。可以考虑不同的参数，例如公共部分的长度，公共部分的数量等。此外，序列的非信息部分可以通过任何已知的均值来鉴定，并在分析中在任何时候在计算中赋予较低的权重。用于计算核酸序列之间的系统发育距离的已知方法也可用于此目的。
[0036]
根据本发明的方法还可以包括在于检查最接近的已知序列与至少一个非人高质量核酸序列之间的相似性的量是否高于预定阈值的步骤。如果没有这样的步骤，根据本发
明的方法将总是返回对应于最接近的鉴定序列的结果。然而，如果序列不够相似，最好不要返回任何结果，因此可以使用预定阈值来表征待鉴定序列与输出最接近序列之间的相似性。
[0037]
阈值需要仔细选择，并将取决于要鉴定的传染原。事实上，在一些情况下，即使是相当远的序列也足以鉴定传染原，而为了可靠地鉴定其他传染原，可能需要高度相似性。例如，快速变异的病毒不会被分配与真菌相同的阈值。
[0038]
在一些实施方案中，计算正确鉴定的序列的数量及其与人序列的相对量(比率)，将其与环境(阴性)对照的那些进行比较，并用来测量用于解释的样品中存在的传染原的量或其rna表达，根据传染病发病机制的经验，能够根据其比例，报告传染原的存在与引起传染病的原因相符。
[0039]
在一些实施方案中，阳性对照的解释可进一步用于验证整个过程。
[0040]
在一些实施方案中，提供包含所有对照结果和许多有效性指标的特定报告。根据本发明的方法可以进一步包括在于生成分析报告的步骤，优选地是目标格式的分析报告。目标格式优选是可以在大多数设备上读取的格式，例如txt、html或pdf文档。
[0041]
通常，从样品到最终报告的整个过程符合iso en nf 15189规范(医学实验室诊断)。
[0042]
根据本发明的方法对于基于其基因组dna和基因组/表达的rna鉴定细菌、病毒、真菌和寄生虫非常有用；它在完全基于其基因组(rna病毒)和/或表达的rna序列(包括基因组为dna的病原体)鉴定所有这些病原体时特别有效。
[0043]
该方法对鉴定真菌特别有意义，因为已知的鉴定方法对真菌的成功率不如对其他传染原的成功率。
[0044]
因此，步骤a所提供的核酸序列样品可以有利地是含有真菌rna序列的样品。
[0045]
大多数真菌共享其基因组的一个重要部分。因此，大多数真菌共有的这部分基因组信息不多。因此，建议使用rna序列而不是dna序列来鉴定真菌。
[0046]
有些基因对给定的真菌具有高度特异性，因此构成了鉴定真菌基因。示例性的鉴定真菌基因包括：i)核糖体rna基因大亚基(26/28s的d1-d2结构域)；ii)完整的内部转录间隔区(its1/2)；iii)部分β-微管蛋白ii(tub2)；iv)γ-肌动蛋白(act)；v)翻译延伸因子1-α(tef1α)和翻译延伸因子3(tef3)；vi)rna聚合酶ii的第二大亚基(部分rpb2，第5-6节)；vii)t-rna对接所必需的小核糖体蛋白；viii)60sl10(l1)rp；ix)dna拓扑异构酶i(topi)；x)磷酸甘油酸激酶(pgk)；xi)蛋白质lns2(如stielowjb等人；persoonia2015所述)。
[0047]
在本说明书中，各种目标基因中的每一个的名称是指相应基因的国际公认名称，如国际公认的基因序列和蛋白质序列数据库中所见，包括来自hugo基因命名委员会的数据库，该数据库是尤其可在以下因特网地址获得：www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/index.html。通过这些国际公认的序列数据库，本领域技术人员可以检索对应于本文描述的每个目标标记的核酸和氨基酸序列。
[0048]
根据本发明，步骤d)的多个已知序列包含至少一个如上所定义的目标鉴定真菌基因。
[0049]
通常，本发明的方法由计算机程序执行，该计算机程序包括若干个模块，如实施例2中所述。简言之，计算机程序可包括使用hg19数据库用于消除质量差的序列(phred得分《
20)、非信息性均聚序列(non-informative homopolymeric sequences)以及的人序列的第一模块。第二模块可以使用清理后的数据库进行传染原的鉴定。在该鉴定步骤之后，来自每个样品(患者/动物样品、环境对照和空白样品)的每个传染原序列都被标记上鉴定标签。使用在环境对照中发现的常见序列对来自患者样品的序列进行清理。然后在细菌、病毒和寄生虫的物种水平以及真菌的属水平上测定每种剩余微生物的比率(微生物序列数/人或动物序列)。所有超过一定量的鉴定都被解释为阳性。特别是对于真菌，可以使用专用模块检查物种水平鉴定的可靠性。所述模块基于根据从属于相同鉴定属的序列鉴定的物种分布计算的辛普森指数。当分布指数高时，表明序列都属于一个物种，支持了信息可靠的观点。物种在这种情况下被鉴定。当指数低时，计算真菌物种鉴定的热图。这包括仅使用属于已知通过所选真菌基因(即鉴定真菌基因)的数据库鉴定的基因的真菌序列。在此步骤结束时，如果存在至少3个来自同一物种的不同鉴定基因，则“物种”信息得到验证。否则，只返回属。
[0050]
因此，本发明的另一个目的是一种计算机程序产品，其包括配置成当由处理器或电子控制单元执行时执行根据本发明的方法的代码。
[0051]
在一些实施方案中，本发明的计算机程序是在使用众所周知的计算机处理器、存储单元、存储设备、计算机软件和其他组件的计算机上实现的。通常，计算机包含处理器，该处理器通过执行定义这种操作的计算机程序指令来控制计算机的整体操作。计算机程序指令可以存储在存储设备(例如，磁盘)中并且在需要执行计算机程序指令时加载到存储器中。计算机还包括使用户能够与计算机交互的其他输入/输出设备(例如，显示器、键盘、鼠标、扬声器、按钮等)。本领域的技术人员将认识到，实际计算机的实现也可以包含其他组件。
[0052]
在一些实施方案中，本发明的计算机程序使用以客户端-服务器关系运行的计算机来实现。通常，在这样的系统中，客户端计算机远离服务器计算机并通过网络进行交互。客户端-服务器关系可以由在各自的客户端和服务器计算机上运行的计算机程序来定义和控制。在一些实施方案中，结果可以显示在系统上用于显示，例如用led或lcd。因此，在一些实施方案中，该算法可以在包括后端组件(例如数据服务器)或包括中间件组件，例如应用程序服务器，或包括前端组件的计算系统中实现，例如具有图形用户界面的客户端计算机或用户可通过其与实现交互的web浏览器，或一个或多个此类后端、中间件或前端组件的任何组合。系统的组件可以通过数字数据通信的任何形式或媒介互连，例如通信网络。通信网络的示例包括局域网(“lan”)和广域网(“wan”)，例如因特网。计算系统可以包括客户端和服务器。客户端和服务器通常彼此远离并且通常通过通信网络进行交互。客户端和服务器的关系是由于计算机程序在各自的计算机上运行并且彼此具有客户端-服务器关系而产生的。
[0053]
在一些实施方案中，本发明的计算机程序在基于网络的云计算系统中实现。在这种基于网络的云计算系统中，连接到网络的服务器或另一处理器经由网络与一个或多个客户端计算机通信。例如，客户端计算机(例如移动设备，例如电话、平板电脑或膝上型计算机)可以经由驻留在客户端计算机上并在其上运行的网络浏览器应用程序与服务器通信。客户端计算机可以在服务器上存储数据并通过网络访问数据。客户端计算机可以通过网络向服务器发送数据请求或在线服务请求。服务器可以执行请求的服务并向客户端计算机提供数据。服务器还可以传输适合于使客户端计算机执行指定功能的数据，例如执行计算、在
屏幕上显示指定数据等。例如，医生可以将参数(即输入数据)登记在，然后通过远程通信链路，例如通过internet的广域网(wan)将数据传输到具有数据分析模块的服务器，该模块将实施算法并最终将输出(例如得分)返回给移动设备。在一些实施方案中，输出结果可以并入临床决策支持(cds)系统中。这些输出结果可以集成到电子病历(emr)系统中。
[0054]
本发明的另一个目的是用于检测、鉴定传染原的试剂盒，其包括：
[0055]
样品提供器，其被配置为提供核酸序列样品，
[0056]
用于实施根据本发明的方法的装置，以及
[0057]
用于显示基于最接近的已知序列的结果的装置。
[0058]
本发明的方法、试剂盒和计算机程序特别适用于准确检测和鉴定可能难以鉴定的传染原，因为许多样品包括菌群或背景定植生物。因此，本发明的方法、试剂盒和计算机程序可适用于对传染原进行分类、量化和/或表征。特别是，该方法可确保快速、高效和有用地鉴定传染原，因此在传染诊断和公共卫生监测的临床实践中具有许多优势。例如，本发明的方法可以用于患者疑似患有传染病并且临床医生可以从患者身上采集一份或多份样品以确定是什么传染原导致所述传染的情况。临床医生可能确实想知道患者是否有病毒传染、细菌传染、真菌传染、寄生虫传染等，以便他/她在不同水平上查看结果，并在何时方便提供潜在的治疗选择。特别是，一旦鉴定了传染原，其他可用的临床和实验室数据可能有助于确定检测到的传染原在宿主生物体(例如人或动物患者)中是否具有致病性(即引起疾病)。在临床样品中检测到潜在传染原的存在并不一定意味着它正在引起疾病；例如，潜在的病原体可能是殖民者(colonizer)，也可能是旁观者，并且与宿主生物体的疾病无关。如果根据临床和其他标准，鉴定的传染原被认为具有致病性，则检测可用于指导临床干预，包括：(1)抗菌药物治疗(例如开具或施用靶向抗菌药物)，(2)停用抗微生物药物(例如，在没有明确诊断的情况下停用根据经验施用的药物)，(3)疫苗接种，如果疫苗可用并且在传染后有效(例如狂犬病)，以及(4)医疗程序(例如瓣膜置换术，在真菌性心内膜炎的情况下，单独的抗真菌治疗是无效的)。未能检测到传染原在临床上也可能有助于排除传染的存在作为疾病的原因，这可以指导临床医生治疗非传染性病因(例如，静脉注射免疫球蛋白和皮质类固醇适用于治疗自身免疫性疾病等)。本发明的方法、试剂盒和计算机程序还可以用于血库测试、食品和水质测试、环境测试、动物测试、动物健康，或者可以通过快速有效地鉴定传染原的存在而得到帮助的任何其他领域。
[0059]
本发明将通过以下附图和实施例进一步说明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明
[0060]
图1：实施例1的研究流程图；
[0061]
图2：(a)在来自34名坏死性软组织传染(nsti)患者的坏死样品中，通过培养、靶向宏基因组学(tm)和鸟枪法宏基因组学(sm)检测到的阴性、单一微生物和多种微生物样品的比例。(b)通过培养、tm和sm在34名nsti患者中鉴定出的微生物数量。gp，革兰氏阳性；gnb，革兰氏阴性杆菌。(c)基于三种方法的综合结果，每种方法检测肠杆菌(包括大肠杆菌)、非发酵(nf)gnb、革兰氏阳性球菌(gpc)、厌氧菌和所有微生物的灵敏度。(d)venn图显示了根据三种方法的结果组合，每种方法提供了最佳病原体鉴定的样品数量。
[0062]
图3:(a)细菌与人序列的定量鸟枪法宏基因组(sm)比率与通过培养估计的半定量细菌载量(+、++、+++、++++)的比较。(b)从健康和坏死区域收集的样品中的sm比率计算的细菌载量比较。
具体实施方式
[0063]
实施例1
[0064]
实施例1的结果已发表在br j dermatol.2020jul；183(1):105-113，通过引用并入。
[0065]
权述
[0066]
背景
[0067]
坏死性软组织传染(nsti)会危及生命，需要广谱抗生素。它们的病原学诊断可能因培养表现不佳和术前使用抗生素而受到限制。
[0068]
目的
[0069]
我们旨在(i)比较16s靶向宏基因组学(tm)和具有培养物的无偏半定量基于泛微生物dna和rna的鸟枪法宏基因组学(sm)，(ii)鉴定最能从宏基因组学方法中获益的患者，以及(iii)通过基于sm的方法检测周围非坏死“健康”组织中的微生物病原体。
[0070]
方法
[0071]
进行了一项前瞻性观察研究，以评估标准培养、tm和sm对来自34名nsti患者组织的分析性能。比较了用这三种方法获得的病原体鉴定结果。
[0072]
结果
[0073]
从34例患者中收集到34个坏死组织和10个健康组织。tm的性能不如其他方法(p《0.05)，而sm的表现优于标准培养，尽管结果没有统计学意义(p＝0.08)。sm对所有细菌的检测比tm更敏感(p＝0.02)，并且对厌氧菌的检测比标准培养更敏感(p《0.01)。培养物中细菌的半定量丰度与sm中细菌与人的序列比之间存在很强的相关性(r＝0.71，spearman相关系数)。在健康组织中发现少量细菌dna，表明宏观“健康”组织和坏死组织之间存在细菌连续体。
[0074]
结论
[0075]
sm显示出比tm检测范围更广的病原体，以及比标准培养鉴定严格厌氧菌的明显更好的能力。患有nsti的糖尿病患者似乎从sm中获益最多。最后，我们的结果表明宏观上“健康”的非坏死区域和坏死组织之间存在细菌连续体。
[0076]
标准细菌学程序
[0077]
根据既定指南[1]，所有活检均使用标准化细菌学程序进行测试。将活检在含有3ml等渗溶液和钢珠的无菌一次性试管中以50-60hz研磨210秒(ultra-tube drive，staufen，germany)将部分研磨材料(约10-100mg)转移到tempus血液rna管(thermo fisher scientific，waltham，ma，usa)中并冷冻在-80℃下用于宏基因组学研究。剩余部分用于接种以下培养基：polyvitex(5天，5％co2)、粘菌素萘啶酸血板、胰蛋白酶-大豆琼脂和drigalski板(48小时，好氧)、血琼脂板(5天，厌氧)和巯基乙酸盐液体肉汤(5天)，如欧洲临床微生物学和传染病学会(escmid)所推荐[1]。
[0078]
使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(maldi-tof，beckman-coulter，
sacramento，ca，usa)鉴定细菌菌落，并根据内部图表(+：1至10个单位)进行半定量计数形成菌落(ufc)，++：11至100ufc，+++：101至1000ufc，以及++++：＞1001ufc)。按照escmid的建议管理阳性血培养。[1]抗菌药敏试验采用纸片扩散法进行，并根据法国微生物学会抗菌谱委员会2014年的建议进行解释[2]。
[0079]
宏基因组学程序
[0080]
提取和对照
[0081]
在执行靶向宏基因组学(tm)或鸟枪法宏基因组学(sm)之前，对所有活组织检查应用了无偏dna-rna提取程序。简而言之，通过珠匀化预提取，结合化学细胞破碎，然后使用qiasymphony(qiagen，hilden，germany)进行提取。
[0082]
在每个m或sm运行中测试阴性对照。阳性对照用于评估宏基因组学技术检测细菌、病毒和真菌的性能。10ml阳性对照批次是通过混合以下微生物产生的：(i)细菌，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性好氧菌和厌氧菌；(ii)病毒，包括有包膜和无包膜的rna和dna病毒；(iii)真菌，包括丝状和非丝状病原体。产生500μl的等分试样，在-80℃下冷冻，并用作阳性对照。
[0083]
靶向宏基因组学
[0084]
tm包括对四个扩增子文库的研究：细菌16srrna基因的域v1-v2(16s-v1v2)[3]和v3-v4(16s-v3v4)[4]以及两个核糖体真菌内部转录间隔区(its)its1和its2区域[5]。每个扩增子都是按照制造商(illumina,san diego,ca,usa)提供的“16s宏基因组测序文库制备方案”从5μl提取物制备的。对于每个文库，使用tapestation(agilent,santa clara,ca,usa)上的d1000 screentape评估质量，并使用mithras lb 940(berthold technologies,bad wildbad,germany)上的quant-itdsdna检测试剂盒(thermofischer,waltham,ma,usa)评估数量。在miseq设备(illumina,san diego,ca,usa)上进行双端测序(v3、2x300bp)之前，将所有文库都以4nm标准化、合并和变性。根据制造商的说明[6]对目标细菌和真菌区域进行测序，并使用我们的内部软件[5]将序列与专用数据库中的序列进行比较。简而言之，在合并双末端序列后，读长《50bp和phred质量得分《20的序列被去除。通过比较有义和反义读长提供的鉴定来检测嵌合序列。如果鉴定结果不一致，则认为序列是嵌合的并被去除。其余序列针对16srdna[7]的refseq数据库(2017年11月第85版)和基于清理后的ncbi数据库(2017年11月)[8]的内部真菌数据库进行了对比。使用长度》300bp、e值《10-150
和同一性》97％的序列鉴定细菌，并使用长度》300bp、e值《10-180
和同一性》99％的序列鉴定真菌。仅考虑代表至少1％的序列总数和最少100个贡献序列的鉴定。
[0085]
鸟枪宏基因组学
[0086]
根据制造商的方案
16
，使用0.2ng/μl的5μl提取物和nextera xt dna(illumina,san diego,ca,usa)制备sm dna文库。rna文库是平行制备的，如已经报道
17
，使用10μl 10ng/μl的提取物和human ribozero truseq stranded总rna文库制备试剂盒(illumina,san diego,ca,usa)。使用与tm相同的协议评估每个库的质量和数量。标记dna和rna文库以确保分别分析dna和rna。然后在nextseq500 illumina设备(illumina,san diego,ca,usa)上使用high output kit v2,2x150bp将dna和rna标准化至相同浓度(1.8pm)[9].
[0087]
测序后，使用我们内部的由多个模块组成的软件(iddn.fr.001.160012.000.s.c.2018.000.31230)分别分析非人rna和dna。由r1和r2文件组成的双端序列首
先使用r1的鉴定进行分析。如果用参考鉴定r1，则在参考中鉴定r1的位置周围1000bp的窗口中测试r2的鉴定。仅保留已鉴定的r1/r2对用于已鉴定微生物的最终计数。phred得分《20的序列被去除。使用hg19数据库去除了人序列的(完整数据集grch37/hg19，2009年2月)。非人序列的鉴定和基因组重建是使用各种数据库进行的，包括经过清理的ncbi nt和nr(genbank版本215，2016年10月)数据库，其包含所有已知的微生物，以及特定的内部细菌、真菌和病毒数据库。对于每个鉴定的物种，在将相应序列的数量标准化为序列总数之后，从样品的序列中减去阴性对照序列。如果有超过100个鉴定序列，则认为样品中存在相应的物种，并且样品呈阳性。使用细菌序列/人序列比对细菌进行相对定量。
[0088]
1.cornaglia g,courcol r,herrmann j.european manual of clinical microbiology.2010:215-22.
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[0100]
研究人群
[0101]
研究期间因临床疑似nsti而住院的所有成年患者都纳入(图1)。诊断的确认基于
手术发现，其中坏死成分涉及软组织隔室的任何或所有层，从真皮和皮下组织到深层筋膜和肌肉。66名疑似nsti患者中有34名的样品数量足以进行宏基因组学研究。这34名患者组成了研究组。将以下参数记录在标准化文件中：年龄、性别、合并症、重症监护病房入院、直接入院或从其他机构转院、入院后手术延迟、手术前使用的抗生素和临床结果(包括死亡)。根据标准培养方法的结果调整抗生素，这被认为是护理标准(见下文)。
[0102]
样品
[0103]
患者接受了所有坏死和非血管化组织的广泛清创术，包括皮肤、皮下脂肪、筋膜和肌肉。必要时进行深筋膜切开术。没有对截肢进行取样。在手术过程中，在无菌条件下从安全组织和坏死组织(“传染样品”)之间的界面收集深度活检，对于34名患者中的10名亚组，从非坏死组织(定义为周围肉眼可见的健康组织)收集传染焦点(“健康样品”)。将样品在室温下2小时内送到微生物学系(每周7天，每天24小时开放)。
[0104]
标准微生物学和宏基因组学程序
[0105]
所有活检均通过(i)标准化微生物程序，(ii)细菌16s核糖体基因的v1
–
v2(16s-v1v2)和v3
–
v4(16s-v3v4)结构域的tm和两个核糖体真菌内部转录间隔(its)区域its1和its2，以及(iii)无偏内部半定量基于泛微生物dna和rna的sm方法，metamic。我们的sm方法被认为是无偏，因为在提取步骤中没有使用dnase或捕获富集。所有已鉴定的微生物都被认为是传染过程的原因。
[0106]
统计分析
[0107]
比较了三种诊断方法确定nsti细菌病原学的能力。在没有金标准的情况下，通过将一种单一方法提供的结果与三种方法(培养、tm和sm)生成的信息总和所获得的结果进行比较来评估灵敏度。使用kappa系数评估三种方法之间的关系，其强度为0.01-0.20被认为是轻微的，0.21-0.40是一般的，0.41-0.60是中等的，0.61-0.80是显著的，并且0.81-1.00几乎是完美的。
[0108]
基于定量数据的t检验或mann-whitney检验，以及分类数据的v2检验或fisher精确检验进行未经调整的比较，以了解哪些患者特征与tm和/或sm的积极贡献相关。
[0109]
取决于正态分布，以及分类数据的比例(％)，将数据描述为连续数据的平均值
±
sd或中位数(四分位数间距)。双尾p值《0.05被认为是显著的。使用stata软件版本14
·
1(statacorplp，collegestation，tx，usa)进行统计分析。
[0110]
结果
[0111]
患者
[0112]
66名患者符合条件。纳入研究的34个可用样品数量足以进行宏基因组学研究(图1)。从患者收集了34个坏死样品和10个“健康”样品。74％的患者(34人中的25人)出现合并症，其中最常见的是糖尿病(38％，34人中的13人)、免疫抑制(29％，34人中的10人)和肥胖症(26％，9人中的34)。据报道，68％的患者(34人中有23人)曾接触过抗生素。根据当地指南，所有患者都至少接受了一次清创手术，并且97％(34例中的33例)接受了经验性广谱抗生素治疗。50％的患者(34人中的17人)被送入重症监护病房，并且6％(34人中的2人)在住院期间死亡。
[0113]
靶向和鸟枪法宏基因组学相对于标准培养的诊断价值评估
[0114]
标准培养结果
[0115]
通过经典培养方法，74％的患者(34名中的25名)的传染样品呈阳性(图2a)。在41％的病例(34例中的14例)中，培养物仅鉴定出一种细菌物种：金黄色葡萄球菌(5例)、化脓性链球菌(4例)、铜绿假单胞菌(3例)、嗜血奸菌流感奸菌(1例)和凝固酶阴性葡萄球菌(1例)(图2b)。32％的病例(34例中的11例)发现多种微生物培养：金黄色葡萄球菌(4例)、化脓性链球菌(3例)、肠杆菌(9例)、非发酵革兰氏阴性杆菌(nf-gnb)(3例)、肠球菌(4例)、其他(3例)以及白色念珠菌和热带念珠菌的混合菌(1例)(图2b)。未发现厌氧菌。
[0116]
宏基因组学方法的结果
[0117]
tm使用16sv1-v2(每个样品平均74890
±
34158个序列)对44％(34例中的15个)坏死组织和使用16sv3-v4(每个样品平均282681
±
85776个序列)对74％(34例中的25个)给出阳性结果(存在细菌和/或真菌)(图2a)。两个16s目标之间的细菌鉴定没有差异，并且由于v1-v2明显缺乏敏感性，因此仅使用v3-v4结果进行技术比较。sm使用dna和rna对79％(34例中的27个)坏死样品给出了阳性结果(每个样品平均35468679
±
11964012个rna序列，并且每个样品39218559
±
4969662个dna序列)。序列质量(q30)高于制造商推荐的质量(》90％)。阳性对照中的所有病原体均已充分鉴定(数据未显示)。序列可在国家生物技术信息中心数据库(prjna553328)中获得。
[0118]
tm报告了53％的病例(34例中的18例)的单一微生物传染：
[0119]
金黄色葡萄球菌(2例)、化脓性链球菌(7例)、停乳链球菌(1例)、大肠杆菌(1例)、nf-gnb(5例)、产气荚膜梭菌(1例)和其他(1例)。sm报告了38％的病例(34例中的13例)的单一微生物传染：金黄色葡萄球菌(3例)、化脓性链球菌(4例)、大肠杆菌(1例)、nf-gnb(3例)和其他(2例)(图2b)。tm在21％的病例(34例中的7例)中鉴定出多种细菌：金黄色葡萄球菌(3例)、化脓性链球菌(1例)、无乳链球菌(1例)、肠杆菌(2例)、nf-gnb(2例)和白色念珠菌(1例)(图2b)，而sm显示41％(34例中的14例)的多种微生物传染：金黄色葡萄球菌(3例)、化脓性链球菌(4例)、肠杆菌(7例)、nf-gnb(4例)、厌氧菌(7例)、白色念珠菌(1例)和其他(4例)。在34名患者中均未发现病毒dna或rna。
[0120]
坏死样品中三种微生物鉴定方法的比较
[0121]
74％(34例中的25例)样品通过培养，74％(34例中的25例)样品通过tm，79％(34例中的27例)样品通过sm获得了阳性结果，定义为存在至少一种微生物物种。
[0122]
总体而言，检测革兰氏阳性球菌、肠杆菌、nf-gnb和厌氧菌的灵敏度分别为：通过培养为81％、70％、70％和0％；通过tm为56％、30％、80％和50％；和通过sm为67％、70％、90％和100％。sm对所有细菌的检测比tm更敏感(p＝0.02)，并且对厌氧菌的检测比标准培养更敏感(p《0.01)。对于革兰氏阳性球菌的检测，标准培养比tm更敏感(p＝0.04)(图2c)。
[0123]
只有15％的样品(34例中的5例)在三种测试方法中得出阴性结果。这三种方法在21％的病例(34例中的7例)中鉴定了所有微生物，而在18％(34例中的6例)的其他病例中，所有微生物均通过培养和sm鉴定。在剩余16例中，5例通过培养获得完全鉴定，并且11例通过sm获得完全鉴定(图2d)。我们发现tm在提供nsti中传染原的完整鉴定上不如其他两种方法(p＝0.02)，而sm的正确鉴定数量高于培养获得的数量，尽管结果没有统计学意义(p＝0.08)。
[0124]
三种方法之间的关系
[0125]
总之，kappa系数在培养和tm之间为0.22(50％一致，p＝0.03)，在培养和sm之间为
0.41(61％一致，p《0.001)，并且在tm和sm之间为0.47(65％一致，p＜0.001)。培养物中的细菌半定量与sm中细菌与人的序列比之间存在很强的相关性(r＝0.71，p＜0.001；图3a)。
[0126]
鸟枪法宏基因组学比其他方法产生更完整的病原体鉴定的患者分析
[0127]
sm对11名患者的病原体鉴定结果比其他两种方法更完整。这些患者与其他23名患者的比较显示糖尿病是唯一显著的差异化因素(比值比5.0，95％置信区间1.1-23.2；p＝0.04)。我们还观察到75岁以上患者的比率更高，尽管结果没有统计学意义(比值比4.0，95％置信区间0.8-16.7；p＝0.08)。其他测试特征(包括性别、首次入住重症监护病房、肥胖、免疫抑制、入院前抗微生物治疗、既往类固醇摄入、既往外科手术、住院天数或nsti类型)均与使用sm的改进诊断相关。
[0128]
评估非坏死的“健康”组织
[0129]
10个健康样品中有6个(取自nsti患者的非坏死组织的样品)培养呈阴性。我们在两个病例中观察到单一微生物生长——金黄色葡萄球菌(1例)和铜绿假单胞菌(1例)——而在另外两个病例中出现多种微生物生长——大肠杆菌、屎肠球菌和金黄色葡萄球菌(1例)和斯氏普罗威登斯菌、柠檬酸杆菌弗氏杆菌和凝固酶阴性葡萄球菌(1例)。这四个病例中的三个在健康组织和坏死组织之间表现出完全一致。
[0130]
6个健康样品经tm检测呈阴性，4个呈阳性，结果为单一微生物：金黄色葡萄球菌(1例)、化脓性链球菌(1例)、斯氏假单胞菌(1例)和铜绿假单胞菌(1例)。这四个病例中的三个显示健康样品和传染样品之间完全一致。在不一致的病例中，病原体存在于健康组织而非坏死组织中。
[0131]
10个“健康”非坏死样品中只有3个经sm检测为阴性。五个样品是单一微生物——金黄色葡萄球菌(2例)、化脓性链球菌(1例)和铜绿假单胞菌(2例)——两个样品是多种微生物：斯氏假单胞菌、弗氏假单胞菌和摩根氏菌(1例)，以及大肠杆菌、屎肠球菌和金黄色葡萄球菌(1例)。这七例中有六例显示“健康”样品和坏死样品之间完全一致。对于在两个区域中测试的10名患者，健康组织中细菌与人序列的定量比明显小于坏死组织(p＝0.02，图3b)。
[0132]
结论
[0133]
我们的目的是评估原始的、无偏、半定量的、基于泛微生物dna和rna的sm方法对来自nsti患者的前瞻性收集的组织的性能。
[0134]
两种不同的宏基因组学方法，tm和无偏sm，与标准培养同时使用，以评估nsti患者。总体而言，sm在检测广泛的病原体方面明显优于tm，并且在鉴定严格厌氧菌方面明显优于培养。tm和sm鉴定严格厌氧菌明显优于标准培养，并且能够鉴定更多nf-gnb。
[0135]
总之，sm是一种新的基于ngs的方法，其非常适合通过检测皮肤组织中的各种微生物来鉴定病原体。虽然设置常规使用仍然很复杂，但sm的结果与基于经典培养的方法的结果相关，其中对多种微生物和厌氧菌传染具有更好的敏感性。使用基于sm的诊断的策略可能会改变传染病的现状，因为它使治疗医生能够根据患者的完整微生物学谱做出个性化的决定。
[0136]
实施例2：
[0137]
概述：
[0138]
移植受体的深部皮肤真菌病是经常由真菌侵入皮肤和皮下组织引起的传染，通常
在创伤性接种后发生。它们通常涉及源自土壤的稀有或新出现的机会性真菌病原体，导致物种鉴定困难。鸟枪法宏基因组学(smg)是一种用于泛病原体检测的综合方法，尤其是从临床样品中准确鉴定真菌。然而，到目前为止，由于遗传知识不完整以及基因组信息量对其鉴定的价值低，这些技术迄今为止对真菌传染的探索很少。我们在本研究中建议在一组出现皮下真菌传染的肾移植受者中验证smg方法。
[0139]
通过smg测试了13名患有真菌皮下感染的肾移植患者的活检，其特征在于常规真菌学技术(显微镜、培养、质谱、分子生物学)。我们实验室常规使用的iso 15189认可的泛病原体smg技术在特定泛病原体提取、dna/rna文库制备、随后使用nextseq500(illumina)测序并使用metamic软件分析后运行。开发了一种包括信息丰富的真菌基因的算法，以实现准确的物种鉴定。
[0140]
根据dna序列，只有7/13名患者可以诊断为阳性，而使用rna序列时，有13/13名患者在属水平上被正确鉴定。病原体包括皮肤病霉菌(n＝6)、丝霉菌(n＝3)、皮肤癣菌(n＝2)和毛霉菌(n＝2)。在这13名患者中，有9名患者的真菌在物种水平上得到了高可信度的鉴定。与dna载量相比，rna载量的高于中值1.93-log可以测量真菌载量，这解释了两种标记之间的灵敏度差异。
[0141]
总之，使用无偏rna测序的宏基因组学提高了smg方法鉴定真菌病原体的效率，即使是从皮肤活检中，这是一种困难的基质，因为它所含的真菌遗传物质与人类遗传物质相比较少。我们能够证明，在极端条件下，smg能够进行可靠的真菌鉴定，确认其泛致病谱。此外，这种通过iso 15189认证的方法被证明非常适合涉及罕见病原体的复杂传染病例。
[0142]
方法:
[0143]
提取
[0144]
如前所述[rodriguez et al；bjd 2019；deschamps et al；bjd 2019]，在含有400μl等渗无菌溶液和钢珠的无菌一次性管中以50-60hz研磨活检组织(10-50mg)210秒(ultra-tubedrive,staufen,germany)并转移到2ml sarsted管中。使用珠磨结合化学细胞破碎溶液和蛋白酶k进行预提取步骤，然后使用qiasymphony(qiagen，hilden，germany)进行提取。在每次靶向或鸟枪宏基因组学运行中测试了环境对照(等渗无菌溶液)和阳性对照(zymobiomics
tm
微生物群落标准，ozyme)。此外，在单独的运行中使用5个空白样品(等渗无菌溶液)来计算专门针对真菌的空白检测(bod)和检测限(lod)。
[0145]
靶向宏基因组学
[0146]
靶向宏基因组学包括对两个核糖体真菌内部转录间隔区(its)区域its1和its2的两个扩增子文库的研究(sitterl
é
等，2017前)。每个扩增子都是按照制造商(illumina,san diego,ca,usa)提供的“16s宏基因组测序文库制备方案”从5μl提取物制备的。对于每个文库，质量和数量分别通过tapestation(agilent，santaclara，ca，usa)在d1000 screentape上和quant-it dsdna assay kit(thermofischer，waltham，ma，usa)在mithras lb 940(berthold technologies,bad wildbad,germany)上进行评估。在miseq设备(illumina,san diego,ca,usa)上进行双端测序(v3、2x300bp)之前，将所有文库均以4nm标准化、合并和变性。根据制造商的说明[2]对目标细菌和真菌区域进行测序，并通过我们的内部软件(sitterl
é
等人，2017年)与专用数据库进行比较。简而言之，在合并双端序列
后，去除小于50bp的读长和phred质量得分小于20的序列。通过比较有义和反义读长提供的鉴定来检测嵌合序列。当鉴定不一致时，序列被认为是嵌合的并被去除。剩余的序列基于清理后的ncbi数据库(2017年11月)(pruitt kd；nar，2007)使用内部真菌数据库进行比对。用于正确鉴定的参数是长度大于300bp、e值《10-180
和同一性》99％的序列。仅考虑代表至少1％的序列总数和最小数量的序列》100个贡献序列的鉴定。
[0147]
鸟枪宏基因组学实验
[0148]
根据制造商的方案，使用5μl 0.2ng/μl的提取物通过nextera xt dna(illumina,san diego,ca,usa)制备dna鸟枪法宏基因组学文库。如前所述[17]，使用10μl 10ng/μl的提取物和rna human ribozero truseq stranded总rna文库制备试剂盒(illumina,san diego,ca,usa)平行制备rna文库。对于每个文库，质量和数量的评估遵循与靶向宏基因组学相同的方案。标记dna和rna文库以确保分别分析dna和rna。然后在nextseq500 illumina设备(illumina，sandiego，ca，usa)上通过high output kit v2，2x150bp合并，变性和对端测序之前，将dna和rna标准化为相同浓度(1.8pm)[4]。
[0149]
鸟枪法宏基因组数据分析
[0150]
测序后，将生成的rna和dna序列分别用我们内部的由多个模块组成的metamic软件进行分析。第一个模块使用hg19数据库(完整数据集grch37/hg19，2009年2月)消除了质量差的序列(phred得分《20)、无信息的均聚序列和人序列。第二个模块使用ncbi nt和nr(genbank版本230，2019年2月)清理数据库进行微生物鉴定。在这个鉴定步骤之后，来自每个样品(患者样品、环境对照样品和空白样品)的每个微生物序列都被标记上了鉴定标签。
[0151]
五个空白样品用于评估来自假阳性微生物序列的平均空白、空白限[lob＝平均空白+1.65*标准偏差空白]和检测比限[lod＝平均空白+3.3*标准偏差空白]和lod用作患者样品的阳性截止值。[little,"method validation essentials,limit of blank,limit of detection,and limit of quantitation,"biopharm international 28(4)2015]。
[0152]
使用在环境对照中发现的常见序列对来自患者样品的序列进行清理。然后在细菌、病毒和寄生虫的物种水平以及真菌的属水平上测定每种剩余微生物的比率(微生物序列数/人序列数)。所有超过lod的鉴定都被解释为阳性。
[0153]
使用专用模块检查了物种水平鉴定的可靠性。后者基于从属于特定属的序列的物种鉴定分布计算的辛普森指数。当分布指数高时，序列都属于一个物种，支持信息可靠的事实。当指数低时，计算真菌物种鉴定的热图。热图在于仅使用属于已知通过选定真菌基因数据库(its、lsu
……
)鉴定的基因的真菌序列。在此步骤结束时，如果来自同一物种的至少3个不同的鉴定基因呈阳性，则“物种”信息得到验证。否则，只返回属。
[0154]
结果:
[0155]
根据建议，患者活检样品由smg测序，其中每个样品的中位数为40,276,258[范围：24,919,804-72,8725,50]个dna序列和25,049,534[范围：13,479,338-476,727,578]个rna序列，q30质量评分》75％。
[0156]
基于空白样品的真菌lob和lod比率确定为1.00e-6。lod被用作患者样品阳性的下限。还计算并报告了dna和rna真菌比率(真菌序列数/人序列数)。使用lod截止值，13/13名患者使用rna信息呈真菌传染阳性，而使用dna信息只有6/13名患者呈阳性。另外四个患者样品含有来自检测到的真菌的dna序列，但它们低于lob，即不高于背景噪音。dna和比率的
比较显示1.93log的差异，表明rna量比dna量高大约100倍。因此，优选使用rna来检测真菌的存在或不存在。
[0157]
患者3、4、6、8、10和11的真菌最终鉴定得到了高辛普森指数的支持，并且结果在没有任何额外分析的情况下发送。相比之下，患者1、2、5、7、9、12通过热图方法进行了测试。使用这个额外的工具，患者1、2和12没有达到至少3个基因的阳性阈值，因此被认为是链格孢菌阳性，而患者5、7和9在物种水平上被鉴定，发现分别传染了链格孢属链格孢属蔷薇属和赛多孢属。
[0158]
真菌鉴定方法比较
[0159]
使用的不同技术之间几乎没有差异。its对尖子茎藻产生了不同的结果，在其有性状态下鉴定波氏拟南芥，而smg在属水平上产生了所有鉴定。实际上，卷毛毛霉被认为是变异根毛霉的同义词[mucormycosis caused by unusual mucormycetes,non-rhizopus,-mucor,and-lichtheimia species；marisa z.r.gomes；clin microbiol rev.2011apr；24(2):411
–
445]，以及淡紫拟青霉被认为是淡紫紫霉菌的同义词。尽管如此，除了在同一分析中鉴定出的病毒和细菌外，smg能够在4名患者中以高置信度鉴定物种水平的真菌，其他技术仅鉴定出属水平。
[0160]
讨论:
[0161]
鸟枪法宏基因组学是一种有希望的技术，迄今为止其在真菌传染的诊断方面评价不佳，尤其是在皮肤活检中非典型真菌的情况下。我们在这里报告了泛致病性smg技术与通过培养和分子生物学使用its进行真菌诊断的常规技术的评估。
[0162]
我们的smg技术可以评估背景噪声以设置可靠的检测限值。这种计算方法加上使用rna序列而不是dna序列，可以最大限度地提高该技术的灵敏度，最终获得13/13的样品被正确鉴定为阳性的得分。真菌rna在过去一直被忽视，但它的使用有2个优势，第一个与比真菌dna高100倍的这种核酸的量有关；第二个是分析的特异性，如在我们的研究中不存在鉴定错误所表明(尽管需要对更多患者进行测试以证实这一点)。
[0163]
与其他技术相比，该技术具有不可否认的优势，因为它可以通过选择目标贡献基因来确保正确鉴定真菌。在目前的研究中，优势并不明显，因为所有的真菌也可以被its鉴定，但部分基于这些先前的结果选择它们。然而，众所周知，its区域并不总是能够在物种水平上提供鉴定，而且，该区域扩增的灵敏度密切依赖于样品中存在的真菌核酸拷贝数。这两个重要的限制对smg的结果没有影响，因为任何基因都可以起作用，并且its拷贝的数量没有影响，因为全基因组和元转录组已测序。该软件评估信息可靠性的能力也是一个重要优势，因为与没有足够的物种辨别能力的技术不同，smg结果不能被过度解释。对于本研究中描述的真菌，物种信息对治疗管理没有影响，因为同一属的所有成员的治疗都是相同的。
[0164]
当患者发生传染时，通常很难预测这种传染是由真菌引起的。这意味着找到病因所需的微生物调查数量非常大，并且需要大量样品。然而，在需要活检的深度传染的情况下，如在我们的研究中，活检的可用体积要求做出选择以进行常规方法。smg的优点是需要合理的样品量，无需先验即可进行所有必要的探索。以前的研究已经证明该技术能够检测和鉴定细菌和病毒，包括新的未知病原体。本研究完成了这些发现并证明了smg的泛病原体检测能力。
[0165]
结论:
[0166]
总之，smg已证明其能够检测和表征复杂基质中的非典型真菌传染以及其他微生物，其灵敏度与临床微生物学中常规使用的其他技术相同。当材料数量很少并且疑似传染难以通过常规技术检测和记录时，这种没有先验的方法特别有用。
[0167]
参考资料：
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技术特征：
1.鉴定传染原的方法，包括以下步骤：a.提供核酸序列样品；b.从核酸序列样品中分离出高质量核酸序列；c.从高质量核酸序列中分离出至少一种非动物高质量核酸序列；d.从多个已知序列中鉴定最接近的已知序列，其中最接近的已知序列与多个已知序列中的至少一个非动物高质量核酸序列共享最大量的信息，其中多个已知序列包含传染原的序列，优选至少一个目标真菌鉴定基因，其中所述鉴定指示传染原。2.根据权利要求1所述的鉴定传染原的方法，其中步骤a包括在于提取核酸序列的子步骤，并且其中监控所述子步骤以生成信息，所述信息包括提取进度和样品来源中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的鉴定传染原的方法，其中步骤a中提供的核酸序列样品是rna序列样品。4.根据权利要求1至3中任一项所述的鉴定传染原的方法，其中在步骤b中分离的高质量核酸序列是质量高于预定阈值的序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的鉴定传染原的方法，其中步骤d中的多个已知序列是数据库。6.根据权利要求5所述的鉴定传染原的方法，其中所述数据库包括ncbi数据库，优选为丰富的ncbi数据库。7.根据权利要求1至6中任一项所述的鉴定传染原的方法，还包括在于检查最接近的已知序列和至少一个非人高质量核酸序列之间的共享信息量是否高于预定阈值的步骤。8.根据权利要求1至7中任一项所述的鉴定传染原的方法，还包括在于生成分析报告，优选为目标格式的分析报告的步骤。9.根据权利要求1至8中任一项所述的鉴定传染原的方法，其中步骤a中提供的核酸序列样品是细菌、真菌、寄生虫或病毒rna序列的样品。10.根据权利要求1至9中任一项所述的鉴定传染原的方法，还包括在于从去除了任何目标核酸序列的样品中分离出高质量核酸序列的步骤。11.用于鉴定传染原的试剂盒，包括：样品提供器，其被配置为提供核酸序列样品，用于实施根据权利要求1至10中任一项所述的方法的装置，以及用于显示基于最接近的已知序列的结果的装置。12.一种计算机程序产品，包括代码，在由处理器或电子控制单元执行时，所述代码被配置为进行根据权利要求1至10中任一项所述的方法。

技术总结
本发明提供了一种检测、鉴定、分类、量化和/或表征传染原的方法。本发明涉及一种用于检测、鉴定、分类、量化和/或遗传表征传染原的方法，包括以下步骤：提供核酸序列样品；从核酸序列样品中分离出高质量核酸序列；从高质量核酸序列中分离出至少一种非人高质量核酸序列；从多个已知序列中鉴定最接近的已知序列，其中最接近的已知序列与多个已知序列中的至少一个非人高质量核酸序列共享最大量的相似性，并且其中多个已知序列包含传染原的序列。且其中多个已知序列包含传染原的序列。且其中多个已知序列包含传染原的序列。


技术研发人员：C
受保护的技术使用者：巴黎第十二大学 巴黎公共救济院
技术研发日：2020.11.26
技术公布日：2023/8/6