一种与甜玉米的果糖量和产量紧密连锁的KASP分子标记及其应用

一种与甜玉米的果糖量和产量紧密连锁的kasp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种与甜玉米的果糖量和产量相关的kasp标记及其应用。


背景技术：

2.甜玉米是一种营养丰富果蔬兼用型的作物。在众多的甜玉米评价指标中，产量是最重要的经济指标之一，直接决定了甜玉米的经济价值。subaedah s t(2021)等人提出甜玉米中蔗糖是甜玉米甜味的主要体现者，而其他糖类如果糖、葡萄糖、麦芽糖、松二糖等也在甜玉米的风味形成中起到一定的作用。而且，糖类不仅影响玉米的风味，还可以作为糖信号分子影响玉米的生长发育甚至最终的产量。现阶段甜玉米育种中过于甜玉米甜味的评价方式主要是通过人工品尝打分评级的方式。对于每种糖类的含量和功能的研究较少。杨泉女（2018）等人认为甜玉米中糖类的定量主要有近红外光谱法，间苯二酚法，液相色谱法等方法等方法。但各种方法都有缺点，光谱法实验操作相对简单，但误差较大。化学方法操作复杂，有一定的危险行。液相色谱法定量较准确但成本较高。虽然糖类和甜玉米产量、品质相关，但还没有相应的生物或者遗传标记去检测和预测甜玉米的产量。
3.产量是甜玉米生产中重要的经济指标，同时也是一个复杂的农艺性状，受到遗传、气候、栽培等因素的影响。在特定的环境下，通过遗传改良是提高甜玉米产量的重要途经。但直接对产量性状进行遗传定位和机制解析具有很大的挑战性。yang n（2019）等人通过将产量性状分解成粒部性状如粒宽、粒长、粒厚、粒数等单一性状进行遗传定位和基因功能解析，从而找到控制产量因子的遗传变异，对产量性状进行遗传改良。另外，wen w（2015）等人发现可以通过特定的标志物（农艺性状、代谢物性状等）对产量和农艺性状进行预测。以上研究为通过遗传手段预测农作物的产量提供了理论基础。
4.目前通过遗传标记对甜玉米中果糖含量的预测基本处于空白状态。不同的甜玉米种质间，果糖含量有着丰富的遗传变异，随着全基因组测序价格的降低，使得利用群体遗传学的分析方法（关联分析，连锁分析等）获得有效的果糖相关的遗传标记成为可能。近年来，分子标记在甜玉米育种中也得到了广泛的发展，如papd（随机扩增多态性dna）标记、ssr（简单重复序列）标记，indel（插入缺失）标记等。papd标记不够稳定，ssr标记密度低，在选育过程中往往受到重组、选择等因素的影响；indel标记密度较低；而snp标记基本均匀覆盖整个基因组，密度够高；可以鉴定到与功能变异足够近的snp标记，而避免了标记因重组等原因失效；对于snp的检测kasp具有操作简单，成本低、周期短的特点，非常适合作为分子标记分型的技术手段。因此，基于全基因组关联分析和kasp技术研究开发高产低果糖含量的分子标记具有重大的意义。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供基因zm00001d042066在甜
玉米的果糖量和产量鉴定中的应用。基因zm00001d042066为甜玉米果糖调控的关键功能性基因，该基因的表达量与果糖含量和植株的侧根数量具有显著的相关关系，同时由于产量和果糖含量呈负相关关系，故也可以用于甜玉米产量的鉴定，准确度高。
6.本发明的目的之二在于提供一种基因zm00001d042066的表达抑制剂在降低甜玉米果糖含量中的应用。通过控制基因zm00001d042066的表达，可以有效调控甜玉米的果糖含量以及产量。
7.本发明的目的之三在于提供一种与甜玉米的果糖量和产量紧密连锁的kasp分子标记，该kasp分子标记与甜玉米的果糖量和产量紧密连锁，可有效预测果糖量和产量的情况，可提高育种的选择精度，应用于甜玉米高产低果糖含量性状的遗传改良中具有重要应用价值，适于大规模推广应用。
8.本发明的目的之四在于提供一种kasp分子标记引物组，可以灵活经济性的完成snp位点的检测，高效地鉴定甜玉米高产低果糖含量的等位基因，从而精确地将高产低果糖甜玉米和其他类型甜玉米区分，为促进甜玉米高产优质育种发挥重要作用。
9.本发明的目的之五在于提供一种检测高甜玉米的果糖含量和产量的试剂盒，可有效检测kasp分子标记，鉴定出高产低果糖含量的甜玉米。
10.本发明的目的之六在于提供一种高产低果糖含量甜玉米的筛选方法，可有效预测育种的果糖量和产量的情况，准确度高。
11.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：基因zm00001d042066在甜玉米的果糖量和产量鉴定中的应用，所述基因zm00001d042066位于甜玉米基因组3号染色体的149.5mb位置处。
12.进一步地，当所述基因zm00001d042066提高表达时，鉴定为甜玉米的果糖含量增加；当所述基因zm00001d042066降低表达时，鉴定为甜玉米的果糖含量降低。
13.进一步地，甜玉米的果糖量和产量鉴定方法，包括以下步骤：s1，分析待测样本中所述基因zm00001d042066的等位基因型，所述等位基因型包括hg1单倍型、hg2单倍型和hg3单倍型；s2，根据所述基因zm00001d042066的hg2单倍型的表达量，鉴定甜玉米的果糖量和产量。
14.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：一种基因zm00001d042066的表达抑制剂在降低甜玉米果糖含量中的应用。
15.本发明的目的之三采用如下技术方案实现：一种与甜玉米的果糖量和产量紧密连锁的kasp分子标记，包括以下snp位点的至少一种：1）甜玉米基因组3号染色体的149522680位置的snp位点，多态性为c/a；2）甜玉米基因组3号染色体的149524563位置的snp位点，多态性为a/c；3）甜玉米基因组3号染色体的149525378位置的snp位点，多态性为t/c；4）甜玉米基因组3号染色体的149526365位置的snp位点，多态性为a/g；5）甜玉米基因组3号染色体的149526884位置的snp位点，多态性为g/a；6）甜玉米基因组3号染色体的149526939位置的snp位点，多态性为t/g；7）甜玉米基因组3号染色体的149526953位置的snp位点，多态性为c/g；
8）甜玉米基因组3号染色体的149527531位置的snp位点，多态性为c/g；9）甜玉米基因组3号染色体的149527659位置的snp位点，多态性为c/t；10）甜玉米基因组3号染色体的149527664位置的snp位点，多态性为c/t；11）甜玉米基因组3号染色体的149527769位置的snp位点，多态性为c/t；12）甜玉米基因组3号染色体的149527813位置的snp位点，多态性为g/t；13）甜玉米基因组3号染色体的149529596位置的snp位点，多态性为g/a；14）甜玉米基因组3号染色体的149529878位置的snp位点，多态性为a/t；15）甜玉米基因组3号染色体的149530290位置的snp位点，多态性为a/g；16）甜玉米基因组3号染色体的149530322位置的snp位点，多态性为t/c；17）甜玉米基因组3号染色体的149530635位置的snp位点，多态性为g/a；18）甜玉米基因组3号染色体的149531279位置的snp位点，多态性为g/a；19）甜玉米基因组3号染色体的149531432位置的snp位点，多态性为a/g；20）甜玉米基因组3号染色体的149531501位置的snp位点，多态性为a/g。
16.进一步地，所述kasp分子标记为位于甜玉米基因组3号染色体的149529878位置的snp位点，其高产低果糖含量的等位基因为tt型基因。
17.本发明的目的之四采用如下技术方案实现：一种kasp分子标记引物组，用于检测所述的一种与甜玉米的果糖量和产量紧密连锁的kasp分子标记，包括如seq id no：1 所示的第一引物、如seq id no：2所示的第二引物和如seq id no：3所示的第三引物。
18.进一步地，所述第一引物标记有hex荧光基团，所述第二引物标记有fam荧光基团。
19.本发明的目的之五采用如下技术方案实现：一种检测高甜玉米的果糖含量和产量的试剂盒，包括所述的kasp分子标记引物组。
20.本发明的目的之六采用如下技术方案实现：一种高产低果糖含量甜玉米的筛选方法，包括以下步骤：a1，获取甜玉米样本中基因组3号染色体的149.5mb位置的zm00001d042066基因片段；a2，采用上述的试剂盒对所述基因片段进行kasp扩增，筛选出甜玉米基因组3号染色体的149529878位置的等位基因为tt型基因的样本，得到高产低果糖含量的玉米种质。
21.相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明的基因zm00001d042066在甜玉米的果糖量和产量鉴定中的应用。基因zm00001d042066为甜玉米果糖调控的关键功能性基因，该基因的表达量与果糖含量和植株的侧根数量具有显著的相关关系，同时由于产量和果糖含量呈负相关关系，故也可以用于甜玉米产量的鉴定，准确度高。
22.本发明的一种基因zm00001d042066的表达抑制剂在降低甜玉米果糖含量中的应用。通过控制基因zm00001d042066的表达，可以有效调控甜玉米的果糖含量以及产量。
23.本发明的一种与甜玉米的果糖量和产量紧密连锁的kasp分子标记，该kasp分子标记与甜玉米的果糖量和产量紧密连锁，且适用于常见的高通量检测手段检测，通过荧光定量pcr仪即可对甜玉米快速基因分型，可有效预测果糖量和产量的情况，可提高育种的选择
精度，应用于甜玉米高产低果糖含量性状的遗传改良中具有重要应用价值，适于大规模推广应用。
24.本发明的一种kasp分子标记引物组，可以灵活经济性的完成snp位点的检测，高效地鉴定甜玉米高产低果糖含量的等位基因，从而精确地将高产低果糖甜玉米和其他类型甜玉米区分，为促进甜玉米高产优质育种发挥重要作用。
25.本发明的一种检测高甜玉米的果糖含量和产量的试剂盒，可有效检测kasp分子标记，鉴定出高产低果糖含量的甜玉米。
26.本发明的一种高产低果糖含量甜玉米的筛选方法，可有效预测育种的果糖量和产量的情况，准确度高。
附图说明
27.图1是本发明实施例1中果糖含量性状基因关联分析曼哈顿图及候选基因；其中，x轴代表染色体的物理位置，y 轴代表相应snp p值的log10的负对数（上）；候选基因区域颜色代表基因在甜玉米群体中的平均表达量（下），阈值线为p=1.0
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。
28.图2 是本发明实施例1的基因zm00001d042066单倍型分析图；其中，图2中的a为通过pca分析将甜玉米群体分为三个单倍型组的示意图；图2中的b为不同单倍型组中果糖含量差异的琴形图；图2中的c为不同单倍型组中甜玉米穗重差异的琴形图。
29.图3 是本发明实施例1的基因zm00001d042066基因编辑结果图；其中，wt为野生系, m1\m2为敲除系。
30.图4中a为本发明实施例1的基因zm00001d042066编辑系中果糖含量的差异对比图；图4中b为本发明实施例1的基因zm00001d042066编辑系中产量的差异对比图。
31.图5 是本发明实施例2中利用kasp标记对a/t位点进行基因分型结果图。
32.图6是本发明实施例2中 a/t等位基因中果糖含量和产量的差异对比图。
具体实施方式
33.下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
34.下列实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件或制造厂商所建议的实验条件，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。
35.为补充现有技术中遗传标记对甜玉米中果糖含量预测的空白状态，本发明提出了利用关联分析和kasp技术开发基因zm00001d042066内分子标记鉴定高产低果糖甜玉米的方法。通过色谱质谱联用的方法测定了多份甜玉米自交系果糖含量表型数据，结合全基因组的高密度snp标记，对果糖表型进行全基因组基关联分析，鉴定得到了果糖含量功能基因zm00001d042066，并鉴定得到了20个与果糖含量和产量相关的snp位点作为kasp分子标记，通过本分子标记的应用为甜玉米高产性状的遗传改良提供一种高效的鉴定手段；同时本发明利用kasp技术方法对其中一个snp设计引物实现对高产低果糖甜玉米的鉴定。
36.实施例1基因zm00001d042066的筛选和分析
1、材料和方法1.1 甜玉米材料本实施例收集来源于世界上甜玉米主要种植区（包括中国、美国、泰国、日本、阿根廷等）收集到的份具有广泛代表性的自交系材料中挑选出295份材料组成甜玉米自交系群体。在2019年，我们采用完全随机的区组田间设计对本甜玉米群体进行种植，用于收集表型数据，并设置了2个生物学重复，种植密度为：行长2.5米，株距0.25米，行距0.7米。每株都做自交处理，在授粉后20天进行产量测量及籽粒取样（约20g）。样品迅速放入液氮速冻，然后存储在-80℃冰箱保存，直至进行糖类含量测定。
37.1.2糖类含量测定糖类代谢物提取：在进行糖类代谢物提取之前，我们收获具有2个生物学重复的甜玉米种质的幼粒(授粉后20天)并储存在-80℃环境中。使用研磨机（mm400；retsch）在30 hz频率下将在液氮中预冷的甜玉米粒研磨30秒。参照wang h（2019）等人描述的方法进行糖类代谢物的提取。将提取物在4℃下，以14000 rpm离心10分钟。将两个固定体积的200μl极性相（下相）分别转移到预先标记的1.5 ml微量离心管中。然后将样品在不加热的情况下用真空浓缩器（speedvac;thermofisher）浓缩器干燥。分别使用 gc-ms分析每个样品中两份干燥的200μl极性相等分试样以检测代谢物。
38.1.3糖类代谢物测定（气相色谱-质谱联用法）：对于糖类代谢物分析，使用n-甲基-n-（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺对干燥处理进行衍生化，并使用gc-ms（7890a-5975c，安捷伦，美国）进一步分析。从每个样品中取出1
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l液体混合物，并在 270℃下以分流模式(50:1)注入gc-ms，氦载气（》99.999%纯度）流量设置为1 ml/min，并通过db分离-35ms ui（30 m
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0.25 mm，0.25
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m）毛细管柱。温度在90℃下等温4分钟，然后以每分钟8℃的速度升温至 205℃，然后保持恒定2分钟，最后以每分钟15℃的速率升温至310℃并保持恒定5分钟。传输线温度设置为300℃，离子源温度设置为230℃。分析的质量范围为85-700 m/z。
39.2、玉米样品dna的提取玉米样品dna的提取采用ctab法，将玉米幼苗叶片约50mg置于2ml离心管中，用液氮冷冻并加钢珠至于研磨仪中研磨，随后加入ctab提取缓冲液，放入65℃水浴锅中水浴30分钟；离心管取出水浴锅后，置于室温10分钟；加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)至离心管，密封后放入摇床摇20分钟；室温条件14 ,000rpm离心10分钟后，小心吸取上层清液约500微升至新的1 .5ml离心管中；加2/3体积的异丙醇后放置-20冰箱30分钟；室温14,000rpm离心10分钟，倒掉上清。用1ml的75％酒精洗dna沉淀1次，每次在室温条件下14,000rpm离心10分钟后，将乙醇液体倾倒；在室温中轻微晾干dna沉淀；加入0.3ml ddh2o溶解dna沉淀。
40.3、全基因组关联分析结合果糖表型数据和覆盖全基因组的snp数据，通过关联分析筛选一些可能和表型数据变异存在关系的基因作为候选基因。通过对候选基因的验证来证实该候选基因就是引起表型变化的基因。
41.具体为：结合295个甜玉米群体得到的980万高质量的snp标记，利用tassel3.0 软件提供的混合线性模型（mlm）对果糖含量和全基因组范围内的snp进行了关联分析。
kinship矩阵通过软件tassel3来计算，pca通过gcta软件进行计算。
42.结果显示，在甜玉米基因组3号染色体的149.5mb位置处鉴定到一个显著性的qtl位点（p≤1
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）。这个qtl位点共包含279个达到显著水平的snp，最显著的snp可以解释果糖变异的14.5%。
43.如图1所示，通过对这个qtl范围内基因的筛选，我们确定了基因zm00001d042066是这个qtl的功能基因。筛选的依据有以下2点：（1）显著性的snp位点位于基因区内。
44.（2）基因zm00001d042066的表达量和果糖含量具有显著性（r=0.30,p=1.17
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）的相关性。
45.4、甜玉米高产低果糖含量等位基因型分析如图2所示，通过进一步的单倍型分析，我们发现基因zm00001d042066主要具有三种单倍型（hg（haplotype group ）1单倍型、hg2单倍型和hg3单倍型），其中单倍型2（hg2）的果糖含量显著低于其他类型单倍型，同时单倍型2的产量也显著高于其他单倍型。
46.同时通过等位基因频率分析，单倍型2在整个群体中所占的比例较低（约12%），是一种稀有的等位基因型。说明在甜玉米育种过程中这个基因并没有被强烈的选择到，因此有利等位基因还没有富集到现有的育种材料中，具有很强的筛选与应用价值。
47.5、crispr/cas9 对候选基因进行功能鉴定为验证基因zm00001d042066的功能，利用基因编辑技术对这个基因的外显子区域进行了编辑，获得了这个基因的敲除系。在基因zm00001d042066的第一个和第二个外显子区域分别设计一条sgrna从而利用cas9编辑系统对此区域进行编辑，通过对敲除系和野生系进行产量和果糖含量测定。基因编辑实验根据liu（2020）等人报道操作方法实施，由未米生物科技有限公司操作完成。
48.如图3所示，通过crispr-cas9编辑技术获得基因zm00001d042066的敲除系。
49.如图4所示，对基因zm00001d042066敲除系的果糖含量和农艺性状进行鉴定，敲除系中植株的侧根数量和产量均下降，果糖含量仅有野性系的2.4%。这证明了基因zm00001d042066确实是果糖调控的关键基因，同时也对产量造成影响。zm00001d042066是通过果糖含量全基因组鉴定到的一个功能基因，这个基因可以改变果糖以及玉米产量的表现，基因zm00001d042066的表达抑制剂在降低甜玉米果糖含量中具有一定的应用潜力。
50.实施例2kasp分子标记开发和引物设计1、kasp分子标记开发通过实施例1的基因编辑人为制造出的强突变体验证了基因zm00001d042066在果糖含量和产量方面的功能，同时给我们的启示是自然群体中的弱突变类型可能具有重要的利用价值。本实施例利用基因zm00001d042066上279个snp的pca分析，将基因zm00001d042066分成3个单倍型组。
51.结合甜玉米群体中穗重和果糖含量数据，可以看出单倍型2是一个有利等位基因类型，具有果糖含量低，产量高的特点。如表1所示，我们从中鉴定得到了20个单倍型组2特有的snp等位基因类型，其中4个位于基因zm00001d042066的编码区，都属于同义突变。
52.表1 可用于高产低果糖甜玉米筛选的snp位点
53.从表1可以看出，本发明筛选出了20个单倍型组2特有的snp等位基因类型，有利等位基因型在这个单倍型材料中频率为100%，而在其他单倍型材料种为0%，因此通过对单倍型组2中特有snp进行分型就可以将单倍型组2与其他类型材料分开；通过对snp进行基因分型，可有效鉴定高产低果糖含量甜玉米。
54.2、kasp标记引物设计我们对上述snp位点其中一个位于基因组第149529878位置的snp（a/t）设计了一对kasp标记引物。
55.引物设计在ncbi提供的网页工具primer
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blast完成。由lgc公司 (laboratory of the government chemist，hoddeston，uk)进行引物合成和稀释。
56.引物信息如下：kasp引物序列f1: cagattgagagcccacccaa（seq id no：1）kasp引物序列f2:cagattgagagcccacccat （seq id no：2）kasp通用引物序列：gcctgtaggttgggagaagg（seq id no：3）用设计的引物进行pcr扩增，pcr扩增的反应体系如表2所示（96孔板，10μl 反应体系）：
表2
57.kasp扩增反应程序见表3所示：表3
58.kasp扩增反应结果如图5所示，kasp引物的snp t在高产低果糖甜玉米材料中激发hex荧光，snp a在非高产低果糖甜玉米材料中激发fam荧光，通过荧光定量pcr检测可将等位基因tt和等位基因aa进行区分；本发明开发的kasp引物灵活经济性的完成snp的检测，可以将高产低果糖甜玉米和其他类型甜玉米很好的分开。
59.如图6所示，结合甜玉米群体中穗重和果糖含量数据，等位基因tt类型材料果糖含量较等位基因aa低46%，产量较等位基因aa高9.7%。本标记在甜玉米鉴定的应用将为促进甜玉米高产优质育种发挥重要作用。
60.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

技术特征：
no：2所示的第二引物和如seq id no：3所示的第三引物。8.根据权利要求7所述的kasp分子标记引物组，其特征在于：所述第一引物标记有hex荧光基团，所述第二引物标记有fam荧光基团。9.一种检测高甜玉米的果糖含量和产量的试剂盒，其特征在于：包括权利要求7或8所述的kasp分子标记引物组。10.一种高产低果糖含量甜玉米的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：a1，获取甜玉米样本中基因组3号染色体的149.5mb位置的zm00001d042066基因片段；a2，采用权利要求9所述的试剂盒对所述基因片段进行kasp扩增，筛选出甜玉米基因组3号染色体的149529878位置的等位基因为tt型基因的样本，得到高产低果糖含量的玉米种质。

技术总结
一种与甜玉米的果糖量和产量紧密连锁的KASP分子标记及其应用，涉及基因工程技术领域；基因Zm00001d042066在甜玉米的果糖量和产量鉴定中的应用，位于甜玉米基因组3号染色体的149.5Mb位置处。该基因为甜玉米果糖调控的关键功能性基因，该基因的表达量与果糖含量和植株的侧根数量具有显著的相关关系，用于甜玉米果糖量和产量的鉴定，准确度高。KASP分子标记与甜玉米的果糖量和产量紧密连锁，可通过荧光定量PCR仪即可对甜玉米快速基因分型，可有效预测果糖量和产量的情况，可提高育种的选择精度，应用于甜玉米高产低果糖含量性状的遗传改良中具有重要应用价值，适于大规模推广应用。用。用。


技术研发人员：李坤 朱文广 李高科 于永涛 胡建广
受保护的技术使用者：广东省农业科学院作物研究所
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/8/6