一种消除不同液相色谱仪梯度延迟体积差异影响的方法

1.本发明涉及液相色谱技术领域，尤其涉及一种消除不同液相色谱仪梯度延迟体积差异影响的方法。


背景技术：

2.液相色谱法(尤其是hplc)是以填装有微小固体颗粒(如粒径5μm键合c18的硅胶颗粒)的色谱柱为固定相，液体溶剂(如水和甲醇或乙腈的混合溶液)作为流动相，通过输液泵驱动流动相携带样品在色谱柱中流动，使样品中的各组分在固定相和流动相之间进行反复地吸附和解吸附，最终实现分离的目的。
3.梯度洗脱是液相色谱的一种基本操作模式，在实践中有着非常广泛的应用。在梯度洗脱模式下，流动相的组成比例会随时间(t)的改变而发生变化，而这种变化，即流动相组成梯度，是在液相色谱仪输液系统中的混合器中产生。由于混合器以及混合器到进样口的连接管线(含进样环)具有一定的体积，这就导致混合器生成的梯度到达进样口会存在滞后，从而产生梯度延迟效应(李泓文,聂大林.液相色谱系统梯度延迟体积测算方法.仪器仪表用户,2019,26(10):61-64)。对于任何一台液相色谱仪，都不可避免地存在梯度延迟效应，而这会对溶质的保留时间和色谱峰宽产生影响(hao w,wang k,yue b,et al.journal of chromatography a,2020,1618:460858)。在实践中，不同厂家生产的hplc仪的梯度延迟体积不尽相同，这就导致在一台仪器上开发的梯度分析方法在转移到另一台仪器上时并不能被直接使用，需要对梯度条件进行调整以确保测定结果的一致性，特别是较难分离组分的分离度，这就给实际工作带来了诸多不便。
4.为了消除梯度延迟体积的影响，专利cn104931625b公开了一种梯度延迟体积的调节方法。该方法是在混合器和色谱柱入口之间设置一个体积调节装置，通过电子控制单元驱动装置中的活塞杆，改变活塞杆的位置，实现仪器梯度延迟体积的调节。同时，为了减少梯度延迟体积的改变对于系统压力和流速的影响，需要借助电子控制单元相应相反地控制输液泵，从而使压力和流速保持基本稳定。


技术实现要素：

5.针对现有算法的不足，本发明与专利cn104931625b相比不需要引入额外的硬件装置，通过现有液相色谱仪的软件或者仪器操作面板改变梯度曲线的参数，即可消除不同仪器因梯度延迟体积的不同造成的色谱分离结果的差异。
6.本发明所采用的技术方案是：一种消除不同液相色谱仪梯度延迟体积差异影响的方法包括以下步骤：
7.步骤一、测定不同液相色谱仪的梯度延迟体积；
8.步骤二、设定一个时间固定值tc，tc值大于或等于梯度延迟体积的最大值除以流动相的体积流速；
9.步骤三、设定梯度曲线的参数；其中，起始区段为与时间轴平行的线段，平行的线
段的长度为t
p,1
；根据不同化合物在液相色谱仪的梯度延迟体积进行调整，大小等于设定的时间固定值tc减去仪器的梯度延迟体积vd除以流速u，即t
p,1
＝t
c-vd/u；对应的流动相组成为起始流动相组成，梯度曲线其它区段的形状在不同液相色谱仪上保持一致。
10.进一步的，不同化合物包括不限于：尿嘧啶、3-羟基苯乙酮、倍他萘酚、苯甲醚、乙苯、丙苯、丁苯。
11.进一步的，液相色谱仪包括不限于：waters hplc仪、岛津hplc仪、安捷伦hplc仪。
12.进一步的，tc值取值范围为0.2-30min。
13.进一步的，tc值取值范围为0.8-10min。
14.本发明的有益效果：
15.1、无须引入额外的硬件装置以补偿不同液相色谱仪梯度延迟体积的差异，这将有助于降低梯度分析方法开发的成本；同时，也避免了因梯度延迟体积的改变而需要维持仪器系统压力的稳定，降低了对电子控制装置的要求，减少了故障发生的概率；
16.2、所能调节的体积范围没有限制，硬件装置受到自身体积的限制，所能调节的体积范围有限；例如，专利cn104931625b公开的体积调节装置所能调节的体积范围为0-1ml，尤其是0-500μl，最好是0-120μl，然而对于一些分离情形，例如制备液相色谱，梯度延迟体积的差异可达几十甚至上百毫升，这就使得通过硬件补偿消除不同仪器梯度延迟体积的差异具有相当的难度，本发明通过设定一个时间固定值tc消除梯度延迟体积差异的影响，可不受仪器硬件的限制，操作简单，具有很强的实用性。
附图说明
17.图1是本发明的技术原理示意图；
18.图2是实施例4中所设定的梯度曲线和色谱图比较：(a)在waters hplc仪上设定的梯度曲线；(b)在岛津hplc仪上设定的梯度曲线；(c)在waters hplc仪上得到的色谱图；(d)在岛津hplc仪上得到的色谱图；
19.图3是实施例5中所设定的梯度曲线和色谱图比较：(a)在waters hplc仪上设定的梯度曲线；(b)在安捷伦hplc仪上设定的梯度曲线；(c)在waters hplc仪上得到的色谱图；(d)在安捷伦hplc仪上得到的色谱图；
20.图4是实施例6中所设定的梯度曲线和色谱图比较：(a)在waters hplc仪上设定的梯度曲线；(b)在安捷伦hplc仪上设定的梯度曲线；(c)在waters hplc仪上得到的色谱图；(d)在安捷伦hplc仪上得到的色谱图；
21.图5是实施例7中所设定的梯度曲线和色谱图比较：(a)在waters hplc仪上设定的梯度曲线；(b)在岛津hplc仪上设定的梯度曲线；(c)在waters hplc仪上得到的色谱图；(d)在岛津hplc仪上得到的色谱图；
22.图6是实施例8中所设定的梯度曲线和色谱图比较：(a)在安捷伦hplc仪上设定的梯度曲线；(b)在岛津hplc仪上设定的梯度曲线；(c)在安捷伦hplc仪上得到的色谱图；(d)在岛津hplc仪上得到的色谱图；
23.图4至图6中色谱峰所对应的化合物：1、尿嘧啶；2、3-羟基苯乙酮；3、倍他萘酚；4、苯甲醚；5、乙苯；6、丙苯；7、丁苯。
具体实施方式
24.下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，此图为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。
25.如图1所示，一种消除不同液相色谱仪梯度延迟体积差异影响的方法包括以下步骤：
26.在梯度洗脱中，溶质的保留时间(tr)的计算公式：
[0027][0028]
其中，td为梯度延迟时间，即梯度延迟体积除以流动相的体积流速；为溶质在初始流动相组成中的保留因子；t0为色谱柱的死时间，φ(t)为梯度曲线的数学表达式，其为时间t的函数，设计如图1所示的梯度曲线。
[0029]
其中，φ1(t)所对应的区段为与时间轴平行的线段，其长度标记为t
p,1
，所对应的流动相组成等于其它区段用函数φ2(t)表示，公式为：
[0030][0031]
其中，φ()为任意数学表达式，起始值例如，对于实践中常见的单线性流动相组成梯度，公式为：
[0032][0033]
则有：
[0034][0035]
对于图1所示的梯度曲线，根据(1)式可得：
[0036][0037]
式(5)通过简单的数学变换可得：
[0038][0039]
对于式(6)，由(2)式可得φ2(t+t
p,1
)＝φ(t)；如果令tc＝td+t
p,1
，则(6)式可写为：
[0040][0041]
由(7)式可见，如果令tc为固定值且函数φ(t)的数学形式不变，则保留时间tr的值保持不变。
[0042]
梯度洗脱中的色谱峰宽(w)的计算公式为：
[0043][0044]
其中，为溶质流出色谱柱时所对应的流动相组成，即l为色谱柱长，h为理论塔板高度，k为保留因子，k和h中的下标为其所对应的流动相组成；对于图1所
示的梯度曲线，采用与上述(5)-(7)式类似的处理方法，可由(8)式得到：
[0045][0046]
由(9)式可见，如果令tc为固定值且函数φ(t)的数学形式不变，色谱峰宽w的值也保持不变。
[0047]
步骤一、测定不同液相色谱仪的梯度延迟体积；
[0048]
步骤二、设定一个时间固定值tc；
[0049]
进一步的，时间固定值tc值不低于梯度延迟体积的最大值除以流动相的体积流速。
[0050]
步骤三、设定梯度曲线的参数；其中，起始区段为与时间轴平行的线段，线段的长度为t
p,1
；根据所使用的液相色谱仪的梯度延迟体积进行调整，大小等于设定的时间固定值tc减去仪器的梯度延迟体积vd除以流速u，即t
p,1
＝t
c-vd/u；对应的流动相组成为起始流动相，梯度曲线其它区段的形状在不同液相色谱仪上保持一致。
[0051]
实施例1
[0052]
测定waters e2695液相色谱仪的梯度延迟体积；首先，将一个具有零死体积的二通管替换色谱柱接入色谱仪中的流路；在a贮液瓶中放置超纯水，b贮液瓶中放置甲醇，流速设为1ml/min，检测波长设为205nm；以100％a为初始流动相，在2min时迅速将b瓶溶剂的比例提高至40％，通过色谱工作站记录检测器的响应信号随时间的变化曲线，将该曲线对时间做一级微商，取其顶点所对应的时间减去2min即得梯度延迟时间，乘以流速即得梯度延迟体积；实验测得该waters液相色谱仪的梯度延迟体积为0.786ml。
[0053]
实施例2
[0054]
测定岛津lc-20a液相色谱仪的梯度延迟体积；采用与实施例1相同的实验方法测定突破曲线，将该曲线对时间做一级微商，取其顶点所对应的时间减去2min再乘以流速，得到该岛津液相色谱仪的梯度延迟体积为3.306ml。
[0055]
实施例3
[0056]
测定安捷伦1260液相色谱仪的梯度延迟体积；采用与实施例1相同的实验方法测定突破曲线，将该曲线对时间做一级微商，取其顶点所对应的时间减去2min再乘以流速，得到该岛津液相色谱仪的梯度延迟体积为1.120ml。
[0057]
实施例4
[0058]
在waters e2695液相色谱仪上分离尿嘧啶、3-羟基苯乙酮、倍他萘酚、苯甲醚、乙苯、丙苯、丁苯七种化合物；按照本发明的方法，设定时间固定值tc＝4.786min，减去仪器的梯度延迟体积0.786ml与流速(1ml/min)的商，得到梯度曲线起始区段的长度t
p,1
＝4.00min；所采用的梯度曲线见图2(a)；其它色谱条件：色谱柱，ace excel 5superc18(4.6
×
150mm,5μm)；流动相，水(溶剂a)和甲醇(溶剂b)；柱温，35℃；检测波长，254nm；进样量，5μl；在该梯度条件下得到的色谱图见图2(c)。
[0059]
在岛津lc-20a液相色谱仪上分离尿嘧啶、3-羟基苯乙酮、倍他萘酚、苯甲醚、乙苯、丙苯、丁苯七种化合物；按照本发明的方法，设定时间固定值tc＝4.786min，减去仪器的梯度延迟体积3.306ml)与流速1ml/min的商，得到梯度曲线起始区段的长度t
p,1
＝1.48min，采
用的梯度曲线见图2(b)；其它色谱条件同waters e2695液相色谱仪，在该梯度条件下得到的色谱图见图2(d)。
[0060]
实施例5
[0061]
在waters e2695液相色谱仪上分离尿嘧啶、3-羟基苯乙酮、倍他萘酚、苯甲醚、乙苯、丙苯、丁苯七种化合物；按照本发明的方法，设定时间固定值tc＝0.3min，减去仪器的梯度延迟体积0.786ml与流速4ml/min的商，得到梯度曲线起始区段的长度t
p,1
＝0.10min；所采用的梯度曲线见图3(a)；其它色谱条件：色谱柱，gold c18(4.6
×
150mm,20μm)；流动相，水(溶剂a)和甲醇(溶剂b)；柱温，25℃；检测波长，254nm；进样量，5μl；在该梯度条件下得到的色谱图见图3(c)。
[0062]
在安捷伦1260液相色谱仪上分离尿嘧啶、3-羟基苯乙酮、倍他萘酚、苯甲醚、乙苯、丙苯、丁苯七种化合物；按照本发明的方法，设定时间固定值tc＝0.3min，减去仪器的梯度延迟体积1.120ml与流速4ml/min的商，得到梯度曲线起始区段的长度t
p,1
＝0.02min，采用的梯度曲线见图3(b)；其它色谱条件同waters e2695液相色谱仪，在该梯度条件下得到的色谱图见图3(d)。
[0063]
实施例6
[0064]
在waters e2695液相色谱仪上分离尿嘧啶、3-羟基苯乙酮、倍他萘酚、苯甲醚、乙苯、丙苯、丁苯七种化合物；按照本发明的方法，设定时间固定值tc＝0.9min，减去仪器的梯度延迟体积0.786ml与流速(3ml/min)的商，得到梯度曲线起始区段的长度t
p,1
＝0.64min；所采用的梯度曲线见图4(a)；其它色谱条件：色谱柱，gold c18(4.6
×
150mm,20μm)；流动相，水(溶剂a)和甲醇(溶剂b)；柱温，25℃；检测波长，254nm；进样量，5μl；在该梯度条件下得到的色谱图见图4(c)。
[0065]
在安捷伦1260液相色谱仪上分离尿嘧啶、3-羟基苯乙酮、倍他萘酚、苯甲醚、乙苯、丙苯、丁苯七种化合物；按照本发明的方法，设定时间固定值tc＝0.9min，减去仪器的梯度延迟体积1.120ml与流速3ml/min的商，得到梯度曲线起始区段的长度t
p,1
＝0.53min，采用的梯度曲线见图4(b)；其它色谱条件同waters e2695液相色谱仪，在该梯度条件下得到的色谱图见图4(d)。
[0066]
实施例7
[0067]
在waters e2695液相色谱仪上分离尿嘧啶、3-羟基苯乙酮、倍他萘酚、苯甲醚、乙苯、丙苯、丁苯七种化合物；按照本发明的方法，设定时间固定值tc＝9.0min，减去仪器的梯度延迟体积0.786ml与流速(1ml/min)的商，得到梯度曲线起始区段的长度t
p,1
＝8.21min；所采用的梯度曲线见图5(a)；其它色谱条件：色谱柱，ace excel 5superc18(4.6
×
150mm,5μm)；流动相，水(溶剂a)和甲醇(溶剂b)；柱温，25℃；检测波长，254nm；进样量，5μl；在该梯度条件下得到的色谱图见图5(c)。
[0068]
在岛津lc-20a液相色谱仪上分离尿嘧啶、3-羟基苯乙酮、倍他萘酚、苯甲醚、乙苯、丙苯、丁苯七种化合物；按照本发明的方法，设定时间固定值tc＝9.0min，减去仪器的梯度延迟体积3.306ml与流速1ml/min的商，得到梯度曲线起始区段的长度t
p,1
＝5.69min，采用的梯度曲线见图5(b)；其它色谱条件同waters e2695液相色谱仪，在该梯度条件下得到的色谱图见图5(d)。
[0069]
实施例8
[0070]
在安捷伦1260液相色谱仪上分离尿嘧啶、3-羟基苯乙酮、倍他萘酚、苯甲醚、乙苯、丙苯、丁苯七种化合物；按照本发明的方法，设定时间固定值tc＝29.0min，减去仪器的梯度延迟体积1.120ml与流速(0.5ml/min)的商，得到梯度曲线起始区段的长度t
p,1
＝26.76min；所采用的梯度曲线见图6(a)；其它色谱条件：色谱柱，ace excel 5superc18(4.6
×
150mm,5μm)；流动相，水(溶剂a)和甲醇(溶剂b)；柱温，25℃；检测波长，254nm；进样量，5μl；在该梯度条件下得到的色谱图见图6(c)。
[0071]
在岛津lc-20a液相色谱仪上分离尿嘧啶、3-羟基苯乙酮、倍他萘酚、苯甲醚、乙苯、丙苯、丁苯七种化合物；按照本发明的方法，设定时间固定值tc＝29.0min，减去仪器的梯度延迟体积3.306ml)与流速0.5ml/min的商，得到梯度曲线起始区段的长度t
p,1
＝22.39min，采用的梯度曲线见图6(b)；其它色谱条件同安捷伦1260液相色谱仪，在该梯度条件下得到的色谱图见图6(d)。
[0072]
在实施例1和实施例2中，岛津和waters液相色谱仪的梯度延迟体积的差异为2.52ml。在实施例2和实施例3中，岛津和安捷伦液相色谱仪梯度延迟体积的差异为2.19ml。这两个差值均超出了cn104931625b中体积调节装置所能调节的体积范围(最大值为1ml)。
[0073]
在实施例4至实施例8中，采用本发明的方法对这两台不同液相色谱仪梯度延迟体积差异的影响进行消除。从图2至图6可以看到，七个化合物在waters、岛津、安捷伦液相色谱仪上的保留时间和色谱峰宽基本吻合，表明本发明方法具有可行性，可以消除不同液相色谱仪梯度延迟体积差异对色谱分离结果的影响。
[0074]
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

技术特征：
1.一种消除不同液相色谱仪梯度延迟体积差异影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、测定不同液相色谱仪的梯度延迟体积；步骤二、设定一个时间固定值；步骤三、设定梯度曲线的参数；其中，起始区段为与时间轴平行的线段，根据不同化合物在液相色谱仪的梯度延迟体积进行调整，计算平行的线段的长度。2.根据权利要求1所述的消除不同液相色谱仪梯度延迟体积差异影响的方法，其特征在于，平行的线段的长度的计算公式为：t
p,1
＝t
c-v
d
/u其中，t
c
为时间固定值，v
d
为仪器的梯度延迟体积，u为流速。3.根据权利要求2所述的消除不同液相色谱仪梯度延迟体积差异影响的方法，其特征在于，时间固定值不低于梯度延迟体积的最大值除以流动相的体积流速。4.根据权利要求1所述的消除不同液相色谱仪梯度延迟体积差异影响的方法，其特征在于，不同化合物包括但不限于：尿嘧啶、3-羟基苯乙酮、倍他萘酚、苯甲醚、乙苯、丙苯、丁苯。5.根据权利要求1所述的消除不同液相色谱仪梯度延迟体积差异影响的方法，其特征在于，液相色谱仪包括但不限于：waters hplc仪、岛津hplc仪、安捷伦hplc仪。6.根据权利要求2所述的消除不同液相色谱仪梯度延迟体积差异影响的方法，其特征在于，时间固定值的范围为0.2-30min。7.根据权利要求6所述的消除不同液相色谱仪梯度延迟体积差异影响的方法，其特征在于，时间固定值的范围为0.8-10min。

技术总结
本发明涉及液相色谱技术领域，尤其涉及一种消除不同液相色谱仪梯度延迟体积差异影响的方法，包括测定不同液相色谱仪的梯度延迟体积；设定一个时间固定值；设定梯度曲线的参数；其中，起始区段为与时间轴平行的线段，根据不同液相色谱仪的梯度延迟体积进行调整，计算平行的线段的长度。本发明不需要引入额外的硬件装置，通过现有液相色谱仪的软件或者仪器操作面板改变梯度曲线的参数，即可消除不同仪器因梯度延迟体积的不同造成的色谱分离结果的差异。异。异。


技术研发人员：阚育洵 郝卫强 徐瑾 陈瑶 邓玉营
受保护的技术使用者：常州工程职业技术学院
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/8/6