Claudin18.2表达稳转细胞株、制备方法及应用与流程

claudin18.2表达稳转细胞株、制备方法及应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体说是一种claudin18.2表达稳转细胞株、制备方法及应用。


背景技术：

2.claudin18蛋白是细胞紧密连接的重要因素，通过非钙的细胞粘附活性，建立细胞旁屏障控制细胞之间分子的流动发挥主要作用。claudin18蛋白具有四次跨膜结构域且n末端和c末端均位于细胞质中。人类cldn18基因有两个剪接变体，分别编码两种蛋白质亚型，即cldn18剪接变体1 (cldn18.1)和cldn18剪接变体2(cldn18.2)。cldn18.1在正常和癌性肺组织中特异表达，cldn18.2在正常胃组织以及胃癌、胰腺癌、食管癌和肺癌组织中均有表达。cldn18.2已被报道可以作为治疗性抗体的靶点。目前尚未有靶向cldn18.2的药物上市，处于临床研发阶段的靶向claudin18.2的药物包括zolbetuximab，lm-302，amg-910，lm-102，等十多个品种，其中有单抗，也有双特异抗体。靶向claudin18.2的药物研发前景广阔，竞争激烈，靶向claudin18.2药物的生物学分析方法（包括结合活性检测方法，抗体定量分析方法，细胞学活性分析方法，中和抗体检测方法等）是靶向claudin18.2药物临床前，临床研发，产品放行等重要的工具，有着极大的市场应用场景。
3.靶向claudin18.2抗体类药物的生物学分析方法的关键依赖于可靠的claudin18.2重组蛋白，抗claudin18.2抗体类药物特异性抗体或者表达claudin18.2的细胞株。抗体类药物定量分析方法通常采用抗药物特异性抗体包被在酶标板材上，通过加入待测样品物反应，通过酶联免疫级联反应实验得到的信号值代入claudin18.2药物标准曲线中来求出药物的浓度。靶向claudin18.2抗体类药物的细胞学活性分析方法多采用表达claudin18.2的肿瘤细胞系如nugc-4，或者通过基因工程技术高峰度表达claudin18.2的cho-k1细胞进行细胞学活性分析（参考文献1），通常是claudin18.2表达细胞在药物作用下，加入效应细胞如pbmc，通过claudin18.2表达细胞的杀伤来表征细胞学活性（参考文献2）。样品的中和抗体分析方法为药物和血清样品孵育后加入claudin18.2表达细胞，加入效应细胞如pbmc后通过claudin18.2表达细胞的杀伤来表征血清样品的中和效果。
4.由于claudin18.2为四次跨膜蛋白，n末端和c末端均位于细胞质中，通过重组蛋白技术表达出来的claudin18.2多为多肽片段而非完整的蛋白结构，利用重组蛋白 cla ud in1 8 .2进行 claudin18 .2抗体的结合活性检测会有失真的风险蛋白的活性或者稳定性很难保证，不能够满足抗体药物定量分析的需求。抗体类药物定量分析方法需要制备抗药物特异性抗体，周期长达6-9个月，时间周期较长，且每个claudin18.2抗体类药物均需要定制抗该药物的独特性抗体，抗体类定量分析方法不够通用。靶向claudin18.2抗体类药物的细胞学活性分析需要使用人来源的pbmc（外周血单核细胞），由于人来源的pbmc价格昂贵，成本较高，且人来源的pbmc存在个体差异和不可持续性，在产品放行阶段需要频繁更换pbmc批次，采用该细胞学活性分析方法往往方法学性能波动较大，长期稳定性较差。中和抗体分析方法建立在细胞学活性分析的基础之上，同样存在成本较高，依赖不可持续的人来
源pbmc，方法学性能波动较大，方法学性能长期稳定性较差等问题。
5.cn114480504 a于2022年5月13日公开了一种claudin18.2报告基因 cho-k1稳转细胞株构建，用含claudin18.2基因的慢病毒转染cho-k1细胞，通过加入真核抗生素筛选和单克隆挑选，经过表达丰度检测，挑选得到合适的高表达claudin18 .2稳转细胞株单克隆；用含cmv-luciferase基因的慢病毒感染所述 claudin18 .2稳转细胞株单克隆，通过加入真核抗生素筛选和单克隆挑选，经过功能学评价得到合适的claudin18.2报告基因稳转细胞株。并利用该报告基因稳转细胞株进行cdc杀伤以及adcc杀伤的检测方法作等。得到的claudin18.2报告基因cho-k1稳转细胞株用于cdc，adcc细胞杀伤测定的方法具有灵敏度高，不易受到外界干扰，尤其是不受死亡的pbmc的影响，所用方法的稳定性好。但是仍然没有解决pbmc的依赖性。


技术实现要素：

6.为解决claudin18.2抗体类药物定量分析方法试剂制备周期长，方法不够通用。claudin18.2抗体类药物细胞学活性分析方法和中和抗体分析方法，检测的关键试剂pbmc来源受限，试剂成本较高，方法学性能波动较大长期稳定性较差的技术问题，同时claudin18.2表达的天然细胞系nugc4作为靶细胞方法学不够灵敏。
7.为解决上述问题，本说明书公开披露了经优选的claudin18.2表达raji稳转细胞株作为claudin18.2抗体类药物活性分析方法和claudin18.2抗体类药物定量分析方法的关键试剂，并使用claudin18.2表达raji稳转细胞株开发出了，claudin18.2抗体类药物的活性分析方法、定量分析方法、中和抗体检测方法。
8.在本发明中，使用claudin18.2基因慢病毒转染raji细胞，通过加入真核抗生素筛选和单克隆挑选得到合适的claudin18.2 raji稳转细胞株，经功能学筛选优选出claudin18.2 raji稳转细胞株单克隆，使用claudin18.2 raji稳转细胞株建立了通用型claudin18.2抗体类药物定量分析方法，claudin18.2抗体类药细胞学活性分析方法和claudin18.2抗体类药细胞学中和抗体分析方法。
9.本发明的第一目的，是提供一种claudin18.2表达稳转细胞株，该稳转细胞株分类命名为：claudin18.2稳转细胞株rc2，保藏日期为2022 年9 月27 日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2022257。
10.本发明的第二目的，是提供上述稳转细胞株的制备方法，使用claudin 18.2慢病毒转染raji细胞。
11.本发明首次使用claudin 18.2慢病毒转染raji细胞，由于病毒感染细胞效率本身较低，claudin 18.2慢病毒转染raji细胞的转染率不超过10%。
12.作为优选，在claudin 18.2慢病毒转染raji细胞的过程中，加入polybrene，加入量为8-10ug/ml。加入适量的polybrene，可以提高raji细胞的慢病毒转染率。
13.发明人首先使用了目前常用的转染助剂polybrene，在转染过程中加入，转染率提到到了约25%至约30%。接近预期效果。
14.作为优选，在claudin 18.2慢病毒转染raji细胞的过程中，加入polybrene和表皮细胞生长因子（egf），polybrene加入量为8-10ug/ml，egf的加入量为2-4ug/ml。在需要更高转染率的情况下，30%的转染率仍然不足。于是，本方案对转染助剂进行了优化，使用
polybrene与egf的组合，具有更加预料不到的转染率，相比单独使用polybrene，raji细胞的慢病毒转染率可以提到3-5倍。
15.本发明的转染细胞采用raji细胞，相比其它可以用于转染的细胞，例如申请人前期所采用的cho-k1细胞等，采用raji细胞所得到的稳转细胞株，最大优势在于，不仅能够适用于不同通用型claudin18.2抗体类药物的活性分析、定量分析以及中和抗体检测分析，还可以不依赖pbmc进行claudin18.2抗体类药物活性分析方法以及claudin18.2抗体类药物定量分析。
16.本发明的第三目的，提供上述稳转细胞株的应用。
17.具体可实现地，包括如下方面的应用：一种claudin18.2表达稳转细胞株用于在claudin18.2抗体的生物学活性的检测。
18.一种claudin18.2表达稳转细胞株用于在claudin18.2双特异抗体的生物学活性的检测。
19.一种claudin18.2表达稳转细胞株用于在claudin18.2抗体和claudin18.2双特异抗体的浓度定量检测。
20.一种claudin18.2表达稳转细胞株用于在claudin18.2抗体类药物的中和抗体的检测。
附图说明
21.图1为claudin18.2 表达稳转细胞株单克隆rc2的流式表征图；图2为claudin18.2表达稳转细胞株rc2用于claudin18.2抗体药物活性分析的剂量响应曲线；图3为claudin18.2表达稳转细胞株rc2用于claudin18.2双特异抗体药物的活性分析的剂量响应曲线；图4为claudin18.2表达稳转细胞株rc2用于claudin18.2抗体药物和双特异抗体细胞学药物浓度定量分析；图5为claudin18.2表达稳转细胞株rc2用于claudin18.2抗体药物和双特异抗体细胞学药物浓度定量分析；图6为claudin18.2表达 稳转细胞株rc2用于claudin18.2抗体类药物检测的稳定性检测；图7为claudin18.2 表达稳转细胞株用于claudin18.2抗体类药物细胞学中和抗体检测。
具体实施方式
22.下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。本发明采用的仪器皆为常规市售品，皆可于市场购得。
23.实施例1claudin18.2 表达稳转细胞株制备claudin 18.2慢病毒（金唯智定制）以moi为100在24孔板中感染1e5个/孔的raji细胞（atcc，货号ccl-86），8ug/ml polybrene, 总体积为500 μl，1640细胞培养基培养；第
三天进行1640细胞培养基培养细胞换液去除慢病毒，加压200ug/ml hygromycin；第七天将转染后的raji细胞稀释至20ml 1640细胞培养基200ug/ml hygromycin，然后铺板在96孔板，200ul/well。第十七天，显微镜下观察96孔板，将有raji生长的微孔的细胞汇集起来，转入24孔板1640细胞培养基200ug/mlhygromycin继续培养。第21天，将24孔板中的raji细胞转入6孔板中，1640细胞培养基200ug/ml hygromycin继续培养。第23天，将6孔板中的raji细胞重悬，用1640细胞培养基200ug/ml hygromycin稀释到10个/ml，200ul/孔进行96孔铺板。第39天取显微镜下观察为单克隆的细胞转入24孔板中。挑选claudin18.2表达率较高的单克隆经6孔板，t25、t75培养得到优选的claudin18.2表达稳转细胞株rc2，raji细胞的慢病毒转染效率为25.46％。
24.实施例2claudin 18.2慢病毒（金唯智定制）以moi为100在24孔板中感染1e5个/孔的raji细胞（atcc，货号ccl-86），8ug/ml polybrene，2ug/ml的egf，总体积为500 μl，1640细胞培养基培养；第三天进行1640细胞培养基培养细胞换液去除慢病毒，加压200ug/ml hygromycin；第七天将转染后的raji细胞稀释至20ml1640细胞培养基200ug/ml hygromycin，然后铺板在96孔板，200ul/well。第十七天，显微镜下观察96孔板，将有raji生长的微孔的细胞汇集起来，转入24孔板1640细胞培养基200ug/ml hygromycin继续培养。第21天，将24孔板中的raji细胞转入6孔板中，1640细胞培养基200ug/mlhygromycin继续培养。第23天，将6孔板中的raji细胞重悬，用1640细胞培养基200ug/ml hygromycin稀释到10个/ml，200ul/孔进行96孔铺板。第39天取显微镜下观察为单克隆的细胞转入24孔板中。挑选claudin 18.2表达率较高的单克隆经6孔板，t25、t75培养得到优选的claudin18.2表达稳转细胞株rc2，raji细胞的慢病毒转染效率为82.12％。
25.在进行转染效率的研究中，发明人还对其它几种可能的转染助剂进行了实验，选择了il2（白细胞介素-2）、il12（白细胞介素-12）、tgf-β（转化生长因子-β）进行单独或组合使用，对应的转染效率统计如下表1。
26.表1：不同转染助剂对应的raji细胞的慢病毒转染效率
anti-cld18.2
‑ꢀ
antibody（百英生物，货号b459701），终浓度5 μg/ml，混匀的过程中尽量减少气泡的产生，4℃孵育30min，取出加入适量pbs离心1000rpm 5min，弃上清，重复此操作2次，剩余100 μl的样品，加入5 μl goat pab tohu igg(pe)，终浓度5 μg/ml，4℃孵育30min，取出加入适量pbs离心1000rpm 5min，弃上清，重复此操作2次，400μl pbs重悬细胞，使用流式细胞仪检测。设置ssc-a、ssc-h门框选单个细胞，使用未添加anti-18.2-362 antibody，仅添加终浓度为5 μg/ml的goatpab to hu igg(pe) 抗体的rc2细胞作为阴性对照，并框出claudin18.2阳性门p2，随后利用设置好的门域进行rc2克隆claudin18.2阳性率表征，结果如图1。
29.实验结果表明流式细胞术检测rc2单克隆有较高的claudin18.2蛋白的表达。
30.实施例5claudin18.2表达稳转细胞株用于claudin18.2抗体药物活性分析方法对数生长的rc2、nugc-4（人胃癌细胞,自表达claudin18.2）及cd16a nf-at jurkat（精翰生物, 货号cd16acf004）细胞，分别离心收集，并用1640灭活培养基（fbs 56℃热灭活30min）重悬至2e6/ml，分别将rc2和nugc-4以25μl/孔加至96孔板，然后加入25μl的cd16a nf-atjurkat至相同的96孔板，随后加入anti-18.2-362antibody抗体，抗体使用1640灭活培养基配制到初始浓度300ng/ml，然后用1640灭活培养基连续3倍稀释至0.14ng/ ml，50 μl /孔添加至培养板中，5% co237℃培养箱孵育5h，孵育完成后，加入100 μl bright-lumi ii luciferase 试剂，室温1000rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测，结果见图2。
31.实验结果表明rc2细胞和cd16a nfat jurkat细胞在claudin18.2抗体anti-18.2-362 antibody的介导下相互作用，激活了cd16a nfat jurkat效应细胞表达luciferase，从而表征检测anti-18.2-362antibody抗体的adcc效应细胞活性功能。如图2所示，相对于天然表达claudin18.2的nugc4细胞，claudin18.2 raji稳转细胞株rc2能够产生明显的剂量响应曲线，有4倍以上的检测窗口，方法学灵敏。
32.实施例6claudin18.2 表达稳转细胞株rc2用于claudin18.2双特异抗体药物的活性分析方法对数生长的rc2和 nfat jurkat clone 1-8（精翰生物，货号cd3cf005）细胞，分别离心收集，并用1640灭活培养基重悬至2e6/ml，rc2以25μl/孔加至96孔板，然后加入25μl的nfat jurkat clone 1-8至相同的96孔板，随后加入claudin18.2-cd3抗体，抗体使用1640灭活培养基配制到初始浓度20ng/ml，然后用1640灭活培养基连续3倍稀释至0.001ng/ ml，50 μl /孔添加至培养板中，5% co237℃培养箱孵育5h，孵育完成后，加入100 μlbright-lumi ii luciferase 试剂，室温1000rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测，结果见图3。
33.实验结果表明rc2细胞和nfat jurkat clone 1-8细胞在claudin18.2双特异抗体claudin18.2-cd3抗体的介导下相互作用，激活了nfat jurkat效应细胞表达luciferase，从而表征检测claudin18.2-cd3双特异抗体的t细胞杀伤效应细胞活性功能。如图3所示， claudin18.2 raji稳转细胞株rc2能够产生明显的剂量响应曲线，有10倍以上的检测窗口，方法学灵敏。
34.实施例7claudin18.2 表达稳转细胞株用于claudin18.2抗体药物和双特异抗体细胞学药物浓度定量分析方法对数生长的rc2及cd16a nf-at jurkat（精翰生物, 货号cd16acf004）细胞，分别离心收集，并用1640灭活培养基（fbs 56℃热灭活30min）重悬至2e6/ml，分别将rc2加至96孔板，然后加入25μl的cd16a nf-at jurkat至相同的96孔板，随后加入anti-18.2-362 antibody抗体，抗体使用1640灭活培养基配制到初始浓度16.67ng/ml，然后用1640灭活培养基连续3倍稀释至0.07ng/ ml，50 μl /孔添加至培养板中，5% co237℃培养箱孵育5h，孵育完成后，加入100μl bright-lumi ii luciferase 试剂，室温1000rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测。检测结果如图4所示。
35.对数生长的rc2和 nfat jurkat clone 1-8（精翰生物，货号cd3cf005）细胞，分别离心收集，并用1640灭活培养基重悬至2e6/ml，rc2以25μl/孔加至96孔板，然后加入25μl的nfat jurkat clone 1-8 至相同的96孔板，随后加入claudin18.2-cd3抗体，抗体使用1640灭活培养基配制到初始浓度3333.33pg/ml，然后用1640灭活培养基连续3倍稀释至4.572 pg/ ml，50 μl /孔添加至培养板中，5% co237℃培养箱孵育5h，孵育完成后，加入100μl bright-lumi ii luciferase 试剂，室温1000rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测。检测结果如图5所示。
36.如上述实验结果所示，claudin18.2 稳转细胞株rc-2可作为关键的细胞用于claudin18.2抗体和claudin18.2双抗的浓度定量分析，同时对于claudin18.2抗体检测和claudin18.2双抗的浓度定量分析方法学的灵敏度分别达到了0.21ng/ml，方法学灵敏0.12ng/ml，具备广泛的通用性。
37.实施例8claudin18.2 表达稳转细胞株用于claudin18.2抗体类药物检测方法稳定性。
38.对数生长的rc2和 cd16a nfat jurkat（本公司构建）细胞，分别离心收集，并用1640灭活培养基重悬至2e6/ml，rc2以25μl/孔加至96孔板，然后加入25μl的cd16a nfat jurkat至相同的96孔板，随后加入anti-18.2-362antibody抗体，抗体使用1640灭活培养基配制到初始浓度300ng/ml，然后用1640灭活培养基连续3倍稀释至0.14ng/ ml，25 μl /孔添加至培养板中，然后按照分组分别加入25μl的1640灭活培养基，含20% pool serum（终浓度5%）的1640灭活培养基，含40% pool serum（终浓度10%）的1640灭活培养基和含80% pool serum（终浓度20%）的1640灭活培养基，混合均匀放入5% co237℃培养箱孵育5h，孵育完成后，加入100 μl bright-lumi ii luciferase 试剂，室温1000rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测，结果见图6。
39.结果显示，rc2细胞在用于claudin18.2抗体类药物检测试验中具有相对较好的血清耐受性，含10%血清及以下的血清基质中，剂量曲线较为接近，适用于血清样基质环境下，claudin18.2抗体类药物的药物浓度定量分析和claudin18.2抗体类药物中和抗体检测应用。
40.实施例9claudin18.2 表达稳转细胞株用于claudin18.2抗体类药物细胞学中和抗体检测方法。
41.对数生长的rc2和 cd16a nfat jurkat（本公司构建）细胞，分别离心收集，并用1640灭活培养基重悬至2e6/ml，rc2以25μl/孔加至96孔板，然后加入25μl的cd16a nfat jurkat至相同的96孔板，使用1640灭活完全培养基配制anti-18.2-362 antibody至11ng/ml（体系终浓度为4.95ng/ml），然后将个体血清或pool血清按照布板图15 μl加至稀释板，分别加入135μl稀释的anti-18.2-362 antibody，混合均匀作为模拟样品，然后按照布板图分别加入50μl模拟样品至已加入细胞的96孔板，混合均匀放入5% co237℃培养箱孵育5h，孵育完成后，加入100μl bright-lumi ii luciferase 试剂，室温1000rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测，结果见图7。
42.rc2细胞在claudin18.2抗体类药物细胞学中和抗体检测中具有良好的应用前景，以pool serum作为对照样品时，个体样品进行初步的阈值测定，方法的阈值约为0.730。
43.总结：本发明充分公开披露了一种claudin18.2表达稳转细胞株，该细胞株的母细胞为raji，克隆号为rc2。在实施例1-3中公开了rc2的制备方法，在实施例4中对比天然表达claudin18.2 nugc4的细胞株，claudin18.2表达稳转细胞株rc2有显著的细胞活性方法学效果，采用rc2有更加灵敏的方法学效果，克服了nugc4在方法学中不够灵敏的缺点。实施例6表明rc2能够用于claudin18.2抗体，claudin18.2双特异抗体的药物浓度定量检测，具备claudin18.2抗体类药物进行浓度测定的通用性，克服了一个药物需要制备抗药特异性抗体用于浓度测定的局限性。实施例7、实施例8则表明rc2能够用于claudin18.2抗体类药物的中和抗体检测。综上，claudin18.2表达稳转细胞株rc2是一种新型的，且功能广泛的用于claudin18.2抗体类药物生物分析的关键细胞试剂，该试剂和构成方法学的其他试剂如nfat jurkat的细胞均为肿瘤细胞系，可进行扩增培养，克服了活性检测方法和中和抗体检测方法使用不可持续的且存在个体差异的pbmc的缺点。

技术特征：
1.一种claudin18.2表达稳转细胞株，其特征在于，该稳转细胞株分类命名为：claudin18.2稳转细胞株rc2，保藏日期为2022 年9 月27 日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2022257；该细胞株是使用claudin 18.2慢病毒转染raji细胞获得，转染过程中使用polybrene与egf组合作为转染助剂。2.如权利要求1所述的一种claudin18.2表达稳转细胞株的应用，其特征在于，在不依赖pbmc的条件下，用于claudin18.2抗体的生物学活性的检测。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，具体说是一种Claudin18.2表达稳转细胞株、制备方法及应用。该稳转细胞株分类命名为：Claudin18.2稳转细胞株RC2，保藏日期为2022年9月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2022257。本发明的稳转细胞株，最大优势在于，不仅能够适用于不同通用型Claudin18.2抗体类药物的活性分析、定量分析以及中和抗体检测分析，还可以不依赖PBMC进行Claudin18.2抗体类药物活性分析方法以及Claudin18.2抗体类药物定量分析。定量分析。定量分析。


技术研发人员：黄启宽 朱国振 余跃云 任亚哲 肖敏
受保护的技术使用者：上海精翰生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/8/6