一种大肠杆菌高效转化培养方法与流程

1.本发明涉及dna重组技术领域，具体涉及一种大肠杆菌高效转化培养方法。


背景技术：

2.转化技术是分子生物学、遗传学以及微生物学等学科的研究基础，许多的生物研究领域都需要用到转化实验，如基因克隆、外源基因表达、基因定位等研究，通常转化成功后再进行各个方向的实验研究。目前质粒转化作为重组dna技术/基因工程技术的一项基础，也是最为重要的一步，已成为生物研究领域中不可缺少的一项技术。质粒是一种环状dna双连分子，单独游离于宿主细胞以外的遗传物质，虽然不是宿主细胞生长繁殖所必须的，但是可以在宿主细胞中进行稳定的复制、克隆和表达，并且随着细胞培养代数的增加而将遗传物质传递给后代细胞，使得宿主细胞获得质粒所拥有的基因特性。转化就是将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞中进行稳定的复制、扩增和表达，以获得大量携带目的基因片段的大肠杆菌的一种方法。
3.目前，载体构建完成后的转化，常采用如下步骤：先将制备好的感受态细胞从-80℃冰箱取出在冰上冻融，加入构建好的重组质粒dna置于冰上冷冻，然后42℃热休克后又放回冰上冷冻恢复,加入培养基后置于37℃、180rpm的条件下培养1h左右，再涂布在抗性平板上置于37℃培养箱倒置培养。
4.然而，现有转化流程所得重组质粒转化成功率较低，如阳性菌落较少甚至没有；或者即使有阳性菌落，其假阳性菌落也较多，只能获得非常低的转化阳性率。使得好不容易构建好的重组质粒却没能够转化导入感受态细胞，导致大量浪费。尤其对于外源基因蛋白表达实验，前期实验工作量非常大，若转化成功率低或假阳性率高，则会导致前期实验需要反复进行，从而增加了实验成本，也浪费了大量时间成本，且最终实验失败率仍然较高，严重阻碍以此为基础的后续研究的发展。


技术实现要素：

5.本发明意在提供一种大肠杆菌高效转化培养方法，以需要解决现有转化后转化成功率低且假阳性率较高的技术问题。
6.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种大肠杆菌高效转化培养方法，将重组质粒与大肠杆菌感受态细胞液混合形成混合溶液，热休克处理混合溶液后立即放回冰上冷处理，接着向混合溶液中加入液体培养基置于10～20℃摇床培养，获得菌液；将菌液涂布到含抗生素的固体培养基上，10～20℃培养箱中倒置培养，获得大肠杆菌转化产物。
7.本方案的原理是：
8.本发明在实验过程中，大肠杆菌感受态细胞与重组质粒混合后先置于冰上，是为了让大肠杆菌的菌细胞在低温、ca
2+
低渗透溶液环境中膨胀成球形，使得混合物中的质粒dna形成抗dnase的羟基-钙磷酸复合物粘附在细胞表面，然后热休克处理使得吸附在细胞表面的质粒dna复合物进入细胞，进一步冷处理是为了让膨胀成球形的菌体表面收缩恢复，
将粘附在菌体表面的质粒dna复合物吸入细胞，并降低转入细胞的重组质粒被转出的概率，提升转化成功率。
9.本方案的优点是：
10.相比于现有感受态细胞转化后均在大肠杆菌的最适培养温度(37℃)条件下进行培养时转化效率较低而言，本方案重组质粒转化进入感受态细胞后，采用低于大肠杆菌的最适生长温度(具体为10～20℃)培养转化后的感受态细胞，有效缓合重组质粒转入感受态细胞对菌体的冲击，提升感受态细胞对转入的重组质粒的适应能力，从而有效提升转化成功率。
11.发明人在研究初期，也一直沿用传统37℃培养转化后的感受态细胞，然而其效果都不太理想，且还易受感受态细胞的转化效率影响，而目前感受态细胞主要由钙离子处理获得，其转化效率低于2
×
107cfu/μg，在此情况下，发明人沿用传统37℃培养转化后的感受态细胞时，重组质粒转化成功率和阳性率均较低(如本方案对比例1所示)。发明人也曾尝试通过优化感受态细胞制备过程及转化过程中的各处理步骤的参数，然而其效果并不理想，且在较长一段时间内，发明人限于固化的传统思维，并未能提升转化阳性率。
12.在一次偶然的机会，发明人突发奇想，降低转化后感受态细胞的培养温度是否能延续热休克后的低温处理效果，从而提升转化成功率呢？
13.随后，发明人通过长期实验发现，低温培养转化后的感受态细胞可以提升转化成功率，但是培养温度过低也无法提升转化成功率，也并非所有阶段段进行低温培养均能提升转化效率，需得是将冷处理后感受态细胞与液体培养基在10～20℃条件下才能有效提升转化成功率。具体的，若冷处理后的液体培养阶段采用37℃摇床培养、而后续固体培养基倒置培养时再低温培养，其转化成功率也不会有太大的提升。申请人分析原因在于，热休克会使得感受态细胞膨胀成球形，便于重组质粒转入感受态细胞；虽然此后的冷处理能使得感受态细胞的细胞膜通透性降低，然而其仍然处于流动性较好的状态，若此时直接37℃摇床培养，大肠杆菌在菌体快速生长的情况下易被胀破，从而导致转化失败。而若是此时采用过低的温度培养感受态细胞(如冷处理的0℃)，大肠杆菌生长缓慢，转入感受态细胞内的重组质粒有可能转出感受态细胞，导致转化成功率降低。由此，发明人最终确定在10～20℃条件下培养转化后的感受态细胞，既不会因生长过快导致菌体被胀破、也不会因生长过慢导致转入感受态细胞的重组质粒被转出，还能有效缓合重组质粒转入感受态细胞对菌体的冲击，从而有效提升转化成功率。
14.优选的，一种大肠杆菌高效转化培养方法，包括如下步骤：
15.s1、构建重组质粒；
16.s2、制备感受态细胞液；
17.s3、转化：将s1构建的重组质粒吸取至置于冰上的大肠杆菌感受态细胞液中，然后放入42℃水浴锅中热休克45～90s，随后立即放回冰上2～3min，接着加入液体培养基置于10～20℃的摇床培养3～5h，获得菌液；吸取菌液涂布到含抗生素的lb固体培养基上，10～20℃培养箱中倒置培养10～14h，获得大肠杆菌转化产物。
18.有益效果：本发明在实验过程中，大肠杆菌感受态细胞与重组质粒混合后先置于冰上，是为了让大肠杆菌的菌细胞在低温、ca
2+
低渗透溶液环境中膨胀成球形，使得混合物中的质粒dna形成抗dnase的羟基-钙磷酸复合物粘附在细胞表面，然后经42℃短时间热冲
击处理使得吸附在细胞表面的质粒dna复合物进入细胞，进一步冰浴冷却2min，是为了让膨胀成球形的菌体表面收缩恢复，将粘附在菌体表面的质粒dna复合物吸入细胞，并使得进入细胞的重组质粒不再出去。接着在ep管中加入液体培养基置于10～20℃、180rpm摇床中培养3～5h，获得菌液；吸取菌液涂布于lb抗性平板上，继续10～20℃条件下倒置培养过夜，进行阳性筛选，本方案在较低温度下培养，更有利于提升转化成功率，使得平板上菌落数明显增加，菌落pcr检测阳性率高；采用双酶切验证发现，本方案也降低了转化的假阳性率，有效提升转化效果。本发明方法降低了转化培养温度后，能更好的提高转化效率，并降低假阳性率，利于推广使用。
19.优选的，在s3中重组质粒与大肠杆菌感受态细胞液的体积比为1:5～10。
20.有益效果：采用上述方案能有效提升重组质粒转化利用率。发明人经过长期实验发现，若吸取的重组质粒过少，则会明显降低转化成功率；而吸取的重组质粒过多，也会因为转化饱和而不再提升转化阳性率，因此，采用上述重组质粒与大肠杆菌感受态细胞的用量体积比，能有效提升转化阳性率，还能避免重组质粒的浪费。
21.优选的，所述大肠杆菌感受态细胞的浓度为5
×
106～2
×
107。
22.有益效果：采用上述方案能有效提升转化阳性率。申请人研究发现，若感受态细胞浓度过低，则会因转化饱和而降低整体的转化阳性率。
23.优选的，在s3中，所述液体培养基为soc液体培养基，所述液体培养基的用量为大肠杆菌感受态细胞液的8～10倍。
24.有益效果：采用上述方案能有效培养转化后的大肠杆菌细胞，从而提升转化阳性率。
25.优选的，在s3中，所述摇床培养和培养箱培养时的温度为18℃。
26.有益效果：采用上述方案能有效转化后的大肠杆菌存活概率，从而提升转化阳性率。
27.优选的，在s2中，制备感受态细胞液具体包括如下步骤：活化及液体培养菌株至菌液od600为0.4-0.6；将菌液分装于冰冻的离心管中，于4℃冰浴5min后4500rpm离心10min；倒掉上清液，把细菌沉淀重新悬浮于提前冷藏好的缓冲液中，冰浴10min；于4℃、4500rpm离心10min；倒掉上清液，将细菌沉淀重新悬浮于提前冷藏好的缓冲液中，于4℃、4500rpm离心10min；倒掉上清液，加入提前冷藏好的缓冲液重悬沉淀，获得大肠杆菌感受态细胞液。
28.有益效果：采用上述方案能有效制备浓度较高的大肠杆菌感受态细胞，满足重组质粒的转化需求。
29.优选的，所述缓冲液为0.1mol/l的氯化钙溶液，氯化钙溶液经121℃高温高压蒸汽灭菌法灭菌20min。
30.有益效果：采用上述浓度的钙离子处理大肠杆菌菌体，钙离子使得大肠杆菌菌体细胞膜膨胀，增大细胞的通透性，便于外源基因或载体进入感受态细胞，提高转化阳性率。
附图说明
31.图1为本发明实施例1在18℃培养条件下转化培养图片。
32.图2为本发明实施例2在10℃培养条件下转化培养图片。
33.图3为本发明对比例1在37℃培养条件下转化培养图片。
34.图4为本发明实施例1在18℃培养条件下转化培养平板的菌落pcr图片。
35.图5为本发明实施例2在10℃培养条件下转化培养平板的菌落pcr图片。
36.图6为本发明对比例1在37℃培养条件下转化培养平板的菌落pcr图片。
37.图7为本发明实施例1在18℃培养条件下转化后质粒提取双酶切图。
38.图8为本发明实施例2在10℃培养条件下转化后质粒提取双酶切图。
39.图9为本发明对比例1在37℃培养条件下转化后质粒提取双酶切图。
40.图10为本发明实施例3制备所得感受态细胞转化所得平板菌落图。
41.图11为本发明实施例4制备所得感受态细胞转化所得平板菌落图。
42.图12为本发明实施例5制备所得感受态细胞转化所得平板菌落图。
43.图13为本发明对比例2制备所得感受态细胞转化所得平板菌落图。
44.图14为本发明对比例3制备所得感受态细胞转化所得平板菌落图。
具体实施方式
45.下面通过具体实施方式进一步详细说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
46.实施例
47.本方案提供一种大肠杆菌高效转化培养方法，具体包括如下步骤：
48.s1、构建重组质粒，将目的基因与pet28a质粒连接，形成重组质粒；
49.s2、制备感受态细胞液：活化及液体培养菌株至菌液od600为0.4-0.6；将菌液分装于冰冻的离心管中，于4℃冰浴5min后4500rpm离心10min；倒掉上清液，把细菌沉淀重新悬浮于提前冷藏好的缓冲液中，冰浴10min；4℃、4500rpm离心10min；倒掉上清液，将细菌沉淀重新悬浮于提前冷藏好的缓冲液中，于4℃、4500rpm离心10min；倒掉上清液，加入提前冷藏好的缓冲液重悬沉淀，获得大肠杆菌感受态细胞液；本方案制备所得大肠杆菌感受态细胞的转化效率为5
×
106～2
×
107cfu/μg。需要存储的再添加15％甘油分装放置在-80℃冰箱超低温储存。
50.其中，缓冲液为0.1mol/l的氯化钙溶液，氯化钙溶液经121℃高温高压蒸汽灭菌法灭菌20min。
51.s3、转化：将s1构建的重组质粒吸取10μl至50～10μl置于冰上的大肠杆菌感受态细胞液中(其中重组质粒与大肠杆菌感受态细胞液的体积比为1:5～10)，保持在冰上保温20～30min；然后放入42℃水浴锅中热休克45～90s，随后立即放回冰上2～3min，接着加入500～800μl的soc液体培养基置于10～20℃、180rpm摇床培养3～5h，获得菌液；吸取100μl菌液涂布到含抗生素的lb固体培养基上，10～20℃培养箱中倒置培养过夜，获得大肠杆菌转化产物。
52.本方案实施例1-2、对比例1主要针对s3转化阶段的参数进行设置，具体如下。
53.实施例1
54.本实施例的转化包括如下内容：吸取10μl重组质粒加入到100μl大肠杆菌感受态细胞液中置于冰上30min，然后放入42℃水浴锅中热休克90s，随后立即放回冰上3min，接着加入800μl soc液体培养基置于18℃、180rpm摇床上培养4h，最后吸取100μl菌液涂布到含
抗生素的lb固体培养基上，18℃培养箱中倒置过夜培养，即完成大肠杆菌转化，菌落生长情况如图1所示。
55.实施例2
56.本实施例的转化包括如下内容：吸取10μl重组质粒加入到50μl大肠杆菌感受态细胞液中置于冰上20min，然后放入42℃水浴锅中热休克45s，随后立即放回冰上2min，接着加入800μl soc液体培养基置于10℃、180rpm摇床上培养4h，最后吸取100μl菌液涂布到含抗生素的lb固体培养基上，10℃培养箱中倒置过夜培养，即完成大肠杆菌转化，菌落生长情况如图2所示。
57.对比例1
58.本对比例的转化包括如下内容：吸取10μl重组质粒加入到100μl大肠杆菌感受态细胞液中置于冰上30min，然后放入42℃水浴锅中热休克90s，随后立即放回冰上3min，接着加入800μl soc液体培养基置于37℃、180rpm摇床上培养4h，最后吸取100μl菌液涂布到含抗生素的lb固体培养基上，37℃培养箱中倒置过夜培养，即完成大肠杆菌转化，菌落生长情况如图3所示。
59.实验例1：检测阳性率及转化效率
60.【实验方法】从实施例1-2、对比例1的抗性平板中随机挑选15个单菌落并标记进行菌落pcr检测，采用1％琼脂糖进行凝胶电泳检测确定阳性率及转化效率。实施例1中转化产物的pcr电泳结果如图4所示，实施例2中转化产物的pcr电泳结果如图5所示，对比例1中转化产物的pcr电泳结果如图6所示。
61.通过实施例1、实施例2和对比例1的实验数据对比可得：
62.由图1～3可知，实施例1在18℃条件下转化培养后，平板上的菌落数量远多于对比例1在37℃条件下转化培养后的菌落数和实施例2在10℃条件下转化培养的菌落数。具体的，如图1所示，实施例1在18℃条件下转化培养的平板中大肠杆菌长势良好，菌落边缘均匀且分布较为密集均匀；如图2所示，实施例2在10℃条件下转化培养的平板中大肠杆菌长势适中，除去实验拼版本身的瑕疵，平板上的菌落分布较为密集均匀；如图3所示，对比例1在37℃条件下转化培养的平板中大肠杆菌长势较差，菌落数稀少，且菌落整体呈长条形，且边缘不整齐。由此可见，本方案采用低温对转化后的大肠杆菌进行培养，便于大肠杆菌感受态细胞进一步恢复生长，从而有效提升其长势，使得更多转化后的大肠杆菌生长形成菌落，便于提升其转化阳性率。
63.由图4～6可知，实施例1(18℃条件下转化培养)、实施例2(10℃条件下转化培养)和对比例1(37℃条件下转化培养)中不同温度培养所得大肠杆菌菌落中重组质粒的转化成功率差异较大，其中实施例1～2中低温培养所得菌落的转化阳性率明显高于对比例1中37℃培养所得菌落的转化阳性率。具体的，如图4所示，随机挑取实施例1(在18℃条件下转化培养)培养所得15个菌落，阳性率达93.33％；如图5所示，随机挑取实施例2(在10℃条件下转化培养)培养所得15个菌落，阳性率达86.7％。如图6所示，随机挑取对比例1(在37℃条件下转化培养)培养所得16个菌落，阳性率仅为23.53％。发明人分析其原因在于，本方案培养时间较短，使得更低温(如实施例2中10℃条件下转化培养)中转化后的大肠杆菌感受态细胞未能完全生长，致使其转化阳性率有所下降。而采用常规温度培养(如对比例1中10℃条件下转化培养)时，因大肠杆菌感受态细胞先后经历“热休克”和“冰恢复”，其细胞膜流动性
较强，而采用37℃培养时会导致细胞膜流动性再次上升，使得大肠杆菌感受态细胞中的重组质粒游离至菌体外，从而导致培养所得菌落数降低，即使成功培养获得菌落，其菌落形态也为不规则型，且菌落中可能是不含重组质粒(重组质粒游离在37℃培养时游离至菌体外)，进而降低其转化阳性率。
64.实验例2：检测假阳性率
65.【实验方法】对实施例1～2、对比例1中阳性的菌落进行扩培，提取质粒，然后双酶切及1％琼脂糖凝胶电泳进一步确认载体与目的基因是否连接成功。实施例1双酶切电泳结果如图7所示，实施例2双酶切电泳结果如图8所示，对比例1双酶切电泳结果如图9所示。
66.通过实施例1、实施例2和对比例1的实验数据对比可得：
67.由图7～9可知，实施例1、实施例2中假阳性率明显低于对比例1中菌落的假阳性率。具体的，如图7所示，实施例1中13个阳性菌落中有1个菌落出现假阳性，假阳性率仅为7.69％；如图8所示，实施例2中13个阳性菌落中有2个菌落出现假阳性，假阳性率仅为15.4％；如图9所示，对比例1中4个阳性菌落中有2个菌落出现假阳性，假阳性率高达50％。
68.实施例1、实施例2和对比例1的实验数据表明，在10℃和18℃条件下的转化培养效率更优于在37℃条件下培养的转化效率。18℃条件下培养后，平板上的菌落数会远多于10℃和37℃条件下培养的菌落数；10℃和18℃条件下培养后菌落pcr阳性率无明显差异，且远高于37℃条件下培养后的菌落pcr阳性率；经双酶切后，10℃和18℃条件下培养的阳性菌落出现假阳性的概率较低，远小于37℃条件下培养的阳性菌落出现的假阳性概率。
69.由此可知，在较低温环境下转化培养更有利于提高转化效率，从实施例1～2、对比例1的实验结果来看，10℃和18℃条件下的转化效率远高于在37℃条件下的转化效率；在10℃条件下转化培养相比于在18℃条件下转化培养，不仅平板上菌落数偏少，而且大大延长了培养时间，使得整体实验进程变长，不利于快速获取实验数据。而在18℃条件下的培养，既能获得大量菌落数，也能很好的提高转化效率，同时也能快速获得实验结果，因此选择18℃条件来进行转化培养更有利于实验的进程。
70.本发明的方法从一定程度上提高了转化效率，降低了的假阳性的出现概率，使转化成功率得到了大幅度的提升。
71.本方案还提供另外一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，包括创新溶液对大肠杆菌菌体的处理，其中创新溶液的制备步骤如下：将0.1mol/l的氯化钙溶液、0.1mol氯化锌溶液1mol、山梨醇按照3:1:1的体积比配制为混合溶液，将混合溶液置于121℃高温高压蒸汽灭菌法灭菌20min，随后将创新溶液置于-20℃冰箱在内冷冻2～4h，获得冷藏的创新溶液，备用。
72.实施例3
73.本实施例感受态细胞的制备方法，还可以由如下步骤制备：
74.s1、活化菌株：取大肠杆菌受试菌株分区划线接种在lb平板上，在37℃条件下倒置培养12～16小时，获得分散菌落的平板；挑取单一菌落接种在5ml的lb液体培养基中，在37℃、250rpm的摇床中培养获得菌液，取2ml菌液转种于新鲜lb液体培养液中继续摇床培养至菌液od600值为0.4～0.6。
75.s2、制备感受态细胞：将s1所得菌液分装于冰冻的离心管中冰浴5min后，在4℃、4500rpm的条件下离心10min；倒掉上清液，把下层细菌沉淀以冷藏的创新溶液重新悬浮，冰
浴10min后在4℃、4500rpm条件下离心10min；倒掉上清液，将细菌沉淀重新悬浮于冷藏的创新溶液中，冰浴10min后在4℃、4500rpm条件下离心10min；倒掉上清液，加入100μl冷藏的创新溶液重悬沉淀，获得感受态细胞液；
76.s3、感受态细胞的保存，向感受态细胞液中加8～15％的甘油(本实施例具体添加15％甘油)，先置于-20℃冰箱冷冻保存4～5h，再置于-80℃冰箱冷冻保存。
77.其中，本方案所用受试菌株为大肠杆菌bl21(de3)菌株，由申请人自保存。
78.制备lb液体培养基包括如下步骤：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl 10g/l，蒸馏水定容1000ml，调节ph至7.2，121℃高温高压蒸汽灭菌法灭菌20min，常温备用。
79.实施例4
80.本实施例基本与实施例1相同，区别在于：受试菌株为大肠杆菌jm109菌株，由申请人自保存；保存感受态添加8％甘油。
81.实施例5
82.本实施例基本与实施例1相同，区别在于：受试菌株为大肠杆菌top10菌株，由申请人自保存；保存感受态添加11％甘油。
83.对比例2
84.本实施例基本与实施例3相同，区别在于：创新溶液仅包含0.2mol/l的氯化钙溶液。
85.对比例3
86.本实施例基本与实施例3相同，区别在于：创新溶液缺少山梨醇，创新溶液仅包含0.1mol/l的氯化钙溶液和0.1mol/l氯化锌溶液。
87.实验例3：感受态细胞转化效率的测定
88.【材料】载体pet28a购自赛默飞世尔科技公司。
89.【实验方法】吸取1μl pet28a质粒dna加入100μl实施例1～3、对比例1～2制备所得感受态细胞中；轻轻的混合过后，冰浴10min；42℃水浴锅，热休克90sec，然后迅速地将其放置在冰上冷却5min；再加入900μl lb液体培养基，37℃振荡培养45min(转速180rpm)，让宿主菌复苏并且表达抗性蛋白。取100μl培养所得菌液，稀释1000倍后取100μl涂布在相应的lb固体培养基(为lb液体培养基加琼脂制备而成)。于37℃倒置培养12～16h，等长出菌落后，进行菌落记数，计算转化效率，重复3次，计算平均值。实施例3～实施例5、对比例2～3所得感受态细胞的转化效率结果详见表1和图10～14。
90.表1实施例3～5、对比例2～3所得感受态细胞的转化效率
91.实施例转化效率/cfu/ug实施例31.25
×
109实施例41.08
×
109实施例51.03
×
109对比例28.2
×
106对比例32.2
×
10892.实验数据表明，本方案以不同受试菌种制备感受态细胞，其所得感受态细胞的转化效率均达到109级，有效适应长片段甚至是基因库的转化需求。具体的，实施例3～5中感受态细胞的转化效率稳定提升至1.03～1.25
×
109。
93.另外，本方案组合使用二价离子(钙离子和锌离子)制备感受态细胞，有效提升细胞膜的通透率，从而提升制备所得大肠杆菌感受态细胞的转化效率。具体的，对比例2中至采用氯化钙溶液作为创新溶液时，制备所得感受态细胞的转化效率仅为8.2
×
106而言，实施例3-5、对比例3中组合应用钙离子和锌离子，锌离子促进钙离子和细胞膜的结合，能有效提升制备所得感受态细胞的转化效率。然而相比于对比例3中因缺少山梨醇的缓冲作用，制备所得感受态细胞易死亡而失效，导致其转化效率明显降低(对比例3中感受态细胞的转化效率仅为2.2
×
108，实施例3～5中感受态细胞的转化效率稳定提升至1.03～1.25
×
109)，从而有效提升以感受态细胞完成也难怪的后续克隆实验的成功率。本方案制备所得感受太细胞的转化效率较高，尤其适用于片段长度较大(如大于30kb)的外源dna的转化，发明人研究发现，本方案制备所得感受态细胞还能够满足文库的构建等复杂实验对转化效率的要求，是一项极为实用的新技术，具有非常高的应用价值。
94.另外，发明人通过长期实验发现，氯化钙浓度的增高到一定阈值转化效率便不会继续提高，此配比氯化钙的浓度(氯化钙、氯化锌与山梨醇的体积比为3:1:1)能使细胞膜充分膨胀，细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，使细胞的通透性变大，便于外源基因或载体进入感受态细胞，但是当氯化钙浓度超过此阈值时(钙离子过多)不仅不会提高转化效率反而会起到抑制的作用，降低制备所得感受态细胞的转化效率。当氯化锌溶液浓度降低或用量减少(锌离子浓度过低)，则会降低其对氯化钙的催化辅助作用，导致转化效率降低，但是当锌离子浓度过高时会导致胞体裂解从而影响后续转化的效率。而山梨醇主要是起到缓冲的作用以及在后续保存时有明显的稳定和延长保存期限的作用，能够有效降低细胞冰点，减少冰晶的形成，降低低温对细胞的损害；过高的山梨醇用量或山梨醇浓度过高不会对转化过程起到帮助，但是山梨醇浓度过低则会导致缓冲作用下降继而影响后续的转化，以及明显缩短感受态细胞的保存时间。实验例4：不同保存时间后的感受态细胞的转化效率
95.将实施例3～5、对比例2～3所得感受态细胞分别保存3个月、6个月、1年、2年后，再取出用于感受态细胞转化效率的测定，每组感受态细胞的转化效率均为3次平均值，结果详见表2。
96.表2实施例3～5、对比例2～3所得感受态细胞不同保存时间后的转化效率
[0097][0098]
实验数据表明，本方案采用8～15％甘油均能有效对感受态细胞进行保存，且甘油和创新溶液中的山梨醇组合后，能进一步提升感受态细胞的保存效果、延长保护时间。具体的，本方案实施例3～5中均采用甘油和山梨醇组合缓冲阳离子对感受态细胞的持续活化效果，使得其在保存1年后的转化效率变化不大，而在保存2年后依然具有较高的转化效率(保
存2年后转化效率具体为2.1～2.9
×
107cfu/ug)，依然适用于片段较短(如≤5kb)的外源dna的转化需求。
[0099]
而对比例2中单独采用钙离子处理所得感受态细胞，在采用甘油保存1年后，其转化效率降低明显(低至8.4
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104cfu/ug)，基本无法满足转化需求。而对比例3中，其只添加甘油作为缓冲保存溶剂，其无法缓冲两种阳离子在保存期间对感受态细胞的持续活化作用，使得保存1年后，对比例3感受态细胞的转化效率由2.2
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108cfu/ug降至2.5
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106cfu/ug，使用其进行转化实验时，转化阳性率非常低，无法满足转化需求。
[0100]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.一种大肠杆菌高效转化培养方法，其特征在于：将重组质粒与大肠杆菌感受态细胞液混合形成混合溶液；热休克处理混合溶液后立即放回冰上冷处理；接着向混合溶液中加入液体培养基置于10～20℃摇床培养，获得菌液；将菌液涂布到含抗生素的固体培养基上，10～20℃培养箱中倒置培养，获得大肠杆菌转化产物。2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌高效转化培养方法，其特征在于：所述混合溶液的形成为将重组质粒吸取至置于冰上的大肠杆菌感受态细胞液中；所述热休克处理为将混合溶液放入42℃水浴锅中处理45～90s，所述冷处理为将热处理后的混合溶液立即放回冰上处理2～3min；所述菌液的获得为向冷处理后的混合溶液中加入液体培养基后置于10～20℃的摇床培养3～5h，获得菌液；最后吸取菌液涂布到含抗生素的lb固体培养基上，10～20℃培养箱中倒置培养10～14h，获得大肠杆菌转化产物。3.根据权利要求2所述的一种大肠杆菌高效转化培养方法，其特征在于：所述重组质粒与大肠杆菌感受态细胞液的体积比为1:5～10。4.根据权利要求3所述的一种大肠杆菌高效转化培养方法，其特征在于：所述大肠杆菌感受态细胞的转化效率为5
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106～2
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107cfu/μg。5.根据权利要求4所述的一种大肠杆菌高效转化培养方法，其特征在于：所述液体培养基为soc液体培养基，所述液体培养基的用量为大肠杆菌感受态细胞液的8～10倍。6.根据权利要求5所述的一种大肠杆菌高效转化培养方法，其特征在于：所述摇床培养和培养箱培养时的温度为18℃。7.根据权利要求6所述的一种大肠杆菌高效转化培养方法，其特征在于：所述感受态细胞液由如下步骤制备：活化及液体培养菌株至菌液od600为0.4-0.6；将菌液分装于冰冻的离心管中，于4℃冰浴5min后4500rpm离心10min；倒掉上清液，把细菌沉淀重新悬浮于提前冷藏好的缓冲液中，冰浴10min；于4℃、4500rpm离心10min；倒掉上清液，将细菌沉淀重新悬浮于提前冷藏好的缓冲液中，于4℃、4500rpm离心10min；倒掉上清液，加入提前冷藏好的缓冲液重悬沉淀，获得大肠杆菌感受态细胞液。8.根据权利要求7所述的一种大肠杆菌高效转化培养方法，其特征在于：所述缓冲液为0.1mol/l的氯化钙溶液，氯化钙溶液经121℃高温高压蒸汽灭菌法灭菌20min。

技术总结
本发明涉及DNA重组技术领域，公开了一种大肠杆菌高效转化培养方法，将重组质粒与大肠杆菌感受态细胞液混合形成混合溶液，热休克处理混合溶液后立即放回冰上冷处理，接着向混合溶液中加入液体培养基置于10～20℃摇床培养，获得菌液；将菌液涂布到含抗生素的固体培养基上，10～20℃培养箱中倒置培养，获得大肠杆菌转化产物。本方案在10～20℃的温度条件下培养转化后的感受态细胞，更有利于提升转化成功率，使得平板上菌落数明显增加，菌落PCR检测阳性率高；采用双酶切验证发现，本方案也降低了转化的假阳性率，有效提升转化效果。有效提升转化效果。


技术研发人员：潘小双 秦民泽 丁峰 唐宗兴
受保护的技术使用者：重庆极泽生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/6