一种新型乳果糖及其制备方法和应用

1.本发明属于寡糖技术领域，具体涉及一种新型乳果糖(1-乳果糖)及其制备方法和应用。


背景技术：

2.寡糖是由2-10个单糖分子缩合并以糖苷键相连。它具有多种多样不同的生物活性，在创新药物，保健食品等领域具有广阔的应用前景。如功能性寡糖可作为一种促双歧杆菌生长因子，提高人体免疫力，抑制肠道有害菌生长，促进肠蠕动及蛋白吸收。功能性寡糖还有其他如供能、预防蛀牙及促进矿物质吸收等十分重要的功能。作为药物使用的寡糖类药物主要包括乳糖、乳果糖、蔗糖、麦芽糖、磺达肝葵钠等。
3.乳果糖可作为缓泻剂治疗便秘，可用于慢性或习惯性便秘，调节结肠的生理节律。磺达肝葵钠则是化学合成的小分子肝素类似物，主要用于进行下肢重大骨科手术等患者，预防静脉血栓栓塞事件的发生。
4.研究发现寡糖的活性跟糖单元的组成类型及糖苷键的链接方式有关。如乳果糖是由半乳糖和果糖组成，与乳糖是同分异构体，但是却具有独特的调节肠道菌群等活性，作为一种寡糖类药物被广泛应用。所以，获得具有独特结构和糖苷键链接方式的新型寡糖具有重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明提供一种新型乳果糖(1-乳果糖)及其制备和应用，从而弥补现有技术的不足。
6.本发明首先提供一种新型乳果糖(1-乳果糖)，其结构式为如下的任一种：
[0007][0008]
本发明所提供的新型乳果糖的制备方法，是使用邻-硝基酚-β-d-半乳糖苷onpg和果糖作为原料，用psagal蛋白酶进行催化制备的；
[0009]
更进一步的，所述的psagal蛋白酶的一种氨基酸序列为seq id no:2，其一种编码基因的核苷酸序列为seq id no:1；
[0010]
所述的制备方法，是在缓冲溶液中加入邻-硝基酚-β-d-半乳糖苷、果糖和蛋白酶进行催化反应，然后离心除去沉淀；上清液进行萃取，萃取溶液冻干获得产物；
[0011]
所述邻-硝基酚-β-d-半乳糖苷、果糖和蛋白酶的一种用量比如下：10-20mm邻-硝基酚-β-d-半乳糖苷onpg，60-500mm果糖和0.1u/mlpsagal蛋白酶。
[0012]
本发明还提供的新型异乳果糖的一种用途，是在抗氧化或防止细胞氧化损伤中的应用；
[0013]
本发明还提供所述的新型乳果糖在制备抗氧化或防止细胞氧化损伤的制品中的应用。
[0014]
本发明还提供一种抗氧化的制品，其中包含有药理有效浓度的上述新型乳果糖。
[0015]
所述的制品，为液体制剂、固体粉末等剂型的药品。
[0016]
本发明利用酶法制备的1-乳果糖纯度高，有利于后续的分离纯化；同时具有独特的抗氧化活性，在抗氧化创新药物、保健食品领域开发潜力巨大。
附图说明
[0017]
图1：转糖基样品1-乳果糖的tlc检测图，
[0018]
图2：转糖基产物1-乳果糖和乳果糖的hplc检测图，
[0019]
图3：转糖基产物1-乳果糖的质谱检测图，
[0020]
图4：果糖乙酰化后为开环结构图；
[0021]
图5：转糖基产物1-乳果糖的三种结构图；
[0022]
图6：不同浓度的1-乳果糖对h2o2诱导氧化损伤的aml-12细胞活力的影响及ec
50
曲线图(
**
p＜0.01，
*
p＜0.05，跟h2o2组对照)；
[0023]
图7：相同浓度的1-乳果糖、乳果糖、果糖、半乳糖对h2o2诱导氧化损伤的aml-12细胞活力的影响图(
**
p＜0.01，
*
p＜0.05，跟h2o2组对照)；
[0024]
图8:mda、gsh、sod含量检测图，其中
#
p《0.05，
##
p＜0.01，跟h2o2组对照；
*
p《0.05，
**
p＜0.01,跟h2o2组对照；
&
p《0.05，跟h2o2组对照；ns无显著性差异。
具体实施方式
[0025]
本发明使用氨基酸序列为糖苷转移酶(psagal，氨基酸序列为seq id no:1)，经过转糖基反应，以邻-硝基酚-β-d-半乳糖苷onpg和果糖为底物，获得了转糖基产物，经过结构鉴定分析，其是通过1-1糖苷键链接的乳果糖，命名为新型乳果糖(1-乳果糖)。研究发现，1-乳果糖具有跟已报到的乳果糖不一样的抗氧化活性，在创新药物开发领域具有广阔的开发应用前景。
[0026]
本发明所提供的新型异乳果糖的制备方法，是使用邻-硝基酚-β-d-半乳糖苷onpg和果糖作为原料，使用psagal蛋白酶进行催化制备的；
[0027]
更进一步的，所述的psagal蛋白酶的一种氨基酸序列为seq id no:2，其一种编码基因的核苷酸序列为seq id no:1；但本领域技术人员还可以在序列为seq id no:2的氨基酸基础上，通过常规的取代、缺失、添加一个或数个氨基，获得与psagal蛋白酶相同或类似效果的衍生酶，其编码基因也可以根据宿主来进行优化。
[0028]
所述的制备方法，是在缓冲溶液中加入邻-硝基酚-β-d-半乳糖苷、果糖和蛋白酶进行催化反应，然后离心除去沉淀；上清液进行萃取，萃取溶液冻干获得产物；
[0029]
所述邻-硝基酚-β-d-半乳糖苷、果糖和蛋白酶的一种用量比如下：10-20mm邻-硝基酚-β-d-半乳糖苷onpg，60-500mm果糖和0.1u/ml psagal蛋白酶。
[0030]
本发明还提供的新型乳果糖(1-乳果糖)的一种用途，是在抗氧化或防止细胞氧化损伤中的应用；
[0031]
本发明还提供了1-乳果糖在制备抗氧化或防止细胞氧化损伤的制品中的应用。
[0032]
本发明还提供一种抗氧化的制品，其中包含有药理有效浓度的上述1-乳果糖，所述的制品，为液体、固体等剂型。
[0033]
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
[0034]
实施例1：重组表达糖苷转移酶(psagal)
[0035]
使用primestar hs dna聚合酶(takara)扩增菌株pseudoalteromona sp.ou03基因组中的糖苷转移酶(psagal)的dna片段。使用的引物的序列信息如下：
[0036]
psagal-f：5
′‑
ggaattcgcttctcatactaatgaaaa-3
′
、
[0037]
psagal-r：5
′‑
cctcgagttaatttagtaaaagcttaa-3
′
。
[0038]
获得的片段的核苷酸序列为seq id no:1，其编码的糖苷转移酶(psagal)的氨基酸序列为seq id no:2。
[0039]
pcr条件如下所示：94℃预变性3min；94℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸3min，此程序运行30个循环；然后，72℃再延伸10min。纯化后的pcr产物使用限制性内切酶ecori和xhoi在37℃双酶切20h，将克隆的psagal基因插入到pet32a载体中。重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)表达菌株，在37℃下培养至od600达到0.7～0.8，然后加入0.2mm iptg诱导蛋白表达，并于16℃，180rpm培养20h，离心收取菌体。将菌体以tris-hcl缓冲液(20mm tris-hcl，500mm nacl10mm咪唑，ph7.5)重悬，超声破碎，然后离心(12000g，30min，4℃)去除沉淀。上清液经镍柱亲和层析纯化，使用洗脱液(20mm tris-hcl，500mm nacl 200mm咪唑，ph7.5)洗脱，获得相应的糖苷转移酶(psagal)的纯酶。
[0040]
实施例2：1-乳果糖的制备
[0041]
1-乳果糖的制备方法，一种是在20mm磷酸盐缓冲液(ph，7.5，pb缓冲体系)中开展，其中包括20mm的邻-硝基酚-β-d-半乳糖苷onpg，400mm果糖和0.1u/ml的重组表达的psagal酶。
[0042]
以上体系于25℃反应4h，100℃加热10min以终止反应，然后10000g/min，离心10min除去沉淀。
[0043]
使用三氯甲烷与上清液按照体积比1：1进行混合后萃取，萃取过程重复3次，以便除去反应液中的onpg和残余蛋白。将萃取后的溶液冻干，用于后续进一步纯化。
[0044]
为了进一步对转糖基产物进行鉴定，使用聚丙烯酰胺凝胶p2(bio-rad,usa)柱(2.7
×
100cm，超纯水；0.7ml/min，)进行纯化。首先，将萃取后的冻干产物溶于2ml水溶液，使用滤膜(0.22μm)过滤后上样，利用收集器收集流出溶液，每管5ml。通过tlc检测确定高纯度样品流出的位置，收集此处溶液冻干，并将冻干后的样品进行tlc检测。tlc薄板(silica gel60 f553，merck)点样1ul后干燥，在展开剂(正丁醇：甲酸：水＝4：6：1)中层析30min，采用苯胺-二苯胺法染色。转糖基样品的tlc检测如图1所述。结果显示经过凝胶过滤纯化后，可以获得高纯度的转糖基产物。
[0045]
实施例3：转糖基产物的纯度与结构鉴定
[0046]
1、为进一步验证纯化后样品的纯度，采用高效液相色谱(hplc)对转糖基产物进行纯度分析。
[0047]
hplc由赛默飞ultimate 3000色谱系统和sedere lt-elsd sedex 80检测器进行，使用shodex asahipak nh2p-504e分析柱在30℃开展15min。样品以70％(v/v)乙腈为流动相洗脱，流速为1.0ml/min。通过hplc检测可以发现，转糖基产物与乳果糖(gal-1，4-fru)的保留时间不同，这说明转糖基产物的两个单糖之间不是通过1-4糖苷键连接(图2)。
[0048]
2、为了确定纯化产物的分子量，进行了质谱鉴定
[0049]
质谱检测由赛默飞q exactive高分辨质谱仪完成，采用正离子/esi扫描，扫描波长为100-800(m/z)。质谱结果显示，在m/z值为365.1057时，转糖基产物的[m+na]+离子达到峰值，与gal-fru的分子量(342)相一致(图3)。因此，可确定转糖基产物是由一分子半乳糖和一分子果糖构成的。
[0050]
3、nmr测试
[0051]
为了确定转糖基产物的糖苷键类型，将转糖基产物进行了全乙酰化后，再进行精确进行结构解析
[0052]
取冻干后的产物粗品(1.0g)，加入干燥的吡啶(10ml)，搅拌溶清后，将反应液用冰
水浴冷却。向冷却后的反应液中慢慢滴加乙酸酐(具体数字数值根据记录后补)，滴加过程中，维持反应液温度在5℃以下。乙酸酐滴加完毕后，反应液慢慢升至室温，搅拌过夜。反应结束后，将过量的吡啶减压蒸馏去除，残留物溶于乙酸乙酯(100ml)，加水(20ml)洗涤，分去水层后，再加1m的盐酸(20ml)洗涤，最后再加饱和食盐水(20ml)洗涤，无水硫酸钠(5g)干燥后，过滤，减压浓缩，得粗品。将所得粗品经prep-hplc分离纯化，得到全乙酰化的产物。进行核磁和质谱分析。
[0053]
进行ms、1hnmr、
13
cnmr、hmbc、cosy、hsqc等谱图分析，由hmbc可以清晰看到，酮羰基碳(200ppm)与1
′
位(4.53,4.38ppm)和3
′
位(5.46ppm)氢有明显的相关信号；1位碳(100.6ppm)与1
′
位氢(4.53,4.38ppm)有相关信号，1位氢(4.52ppm)与1
′
位碳(71.4ppm)存在相关信号，由此推断产物为半乳糖与果糖1,1位连接的二糖，果糖乙酰化后为开环结构(见化合物1，图4)。果糖开环可能是在乙酰化时发生的，也可能自身即为开环结构。而果糖在不同条件下，可以以半缩酮形式形成呋喃糖(五元环)或吡喃糖(六元环)结构，或以开环形式存在，因此转糖基产物的结构式如图5所示(化合物2、3、4)。
[0054]
实施例4：1-乳果糖的抗氧化活性
[0055]
考虑到转糖基产物独特的糖苷键链接方式，对其在细胞水平的抗氧化活性进行研究发现，
[0056]
取生长状态良好的对数生长期正常人肝细胞aml-12细胞，利用0.25％胰蛋白酶+0.02％edta消化后，在800rpm条件下，离心3min，收集细胞。计数后调整细胞浓度，制成细胞悬液，按照15
×
104个/ml孔接种于96孔板中，每孔100μl完全培养基。培养24h后，除对照组其他组均加入300μm的h2o2工作液，按照100μl/孔，处理aml-12细胞6h，建立氧化损伤模型。
[0057]
为了研究转糖基产物1-乳果糖对aml-12细胞氧化损伤的影响，选取不同浓度进行实验，每组设置5个平行实验，结果如表1所示。
[0058]
表1：转糖基产物1-乳果糖对aml-12细胞氧化损伤的结果表
[0059][0060]
结果表明，加入0、50、100、150、200、300μg/ml的1-乳果糖工作液，采用还原型谷胱甘肽(gsh)作为阳性对照药物，给药浓度为307.33μg/ml，作用于细胞24h，然后用mtt法检测细胞活力，检测aml-12细胞活力，评价1-乳果糖的抗氧化能力。
[0061]
结果表明转糖基产物1-乳果糖具有明显的抗氧化活性，而且随着浓度的升高，抗氧化能力随着升高，当给药浓度为200μg/ml，与阳性对照组抗氧化效果相似。结果证明1-乳果糖具有抗氧化活性，ec
50
为201.9μg/ml(图6)。
[0062]
取生长状态良好的对数生长期正常人肝细胞aml-12细胞，利用0.25％胰蛋白酶+
0.02％edta消化后，在800rpm条件下，离心3min，收集细胞。计数后调整细胞浓度，制成细胞悬液，按照15
×
104个/ml孔接种于96孔板中，每孔100μl完全培养基。培养24h后，除对照组其他组均加入300μm的h2o2工作液，按照100μl/孔，处理aml-12细胞6h，建立氧化损伤模型。
[0063]
为了比较本发明的1-乳果糖与乳果糖、果糖、半乳糖的抗氧化活性，设计了七个实验组，分别是空白组、对照组、h2o2组、1-乳果糖组、lactulose(乳果糖)组、fru(果糖)组、gal(半乳糖)组。
[0064]
在对照组和h2o2组加入100μl/孔的完全培养基，其余的1-乳果糖组、lactulose组、fru组、gal组分别加入200μg/ml的1-乳果糖、lactulose、fru、gal工作液各100μl，在培养箱中继续培养24h。之后每孔加入20μl mtt溶液继续培养2-4h，然后吸尽孔内液体，每孔加入150μl dmso溶液。然后，在平板振荡器上避光振荡1min，使用酶标仪检测在波长490nm处的各孔吸光值。
[0065]
图7结果显示300μm/l h2o2处理细胞6h，给药相同浓度(200μg/ml)的1-乳果糖、乳果糖、果糖以及半乳糖处理后，接着培养细胞24h，进行mtt检测。发现1-乳果糖组可以明显起到保护aml-12细胞氧化损伤的作用。而乳果糖、果糖以及半乳糖对氧化损伤后的细胞没有保护作用。说明独特链接方式造成了其独特的活性，
[0066]
实施例5：转糖基产物1-乳果糖的抗氧化活性的细胞水平检测
[0067]
为进一步探讨异乳果糖抗氧化活性的机制，分别在细胞水平检测了脂质氧化(mda)、总sod活性、总谷胱甘肽三个指标。丙二醛(malondialdehyde,mda)是一种生物体脂质氧化的天然产物，通过检测mda的水平即可检测脂质氧化的水平；谷胱甘肽(glutathione)是一种由3个氨基酸残基组成的小肽，是绝大多数活细胞中巯基的主要来源，对于维持蛋白质中巯基适当的氧化还原状态有重要作用，并且是动物细胞中关键的抗氧化剂；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,sod)能催化超氧化物阴离子发生歧化作用，生成过氧化氢和氧气，是生物体内一种重要的抗氧化酶。因此通过检测sod含量观察药物的抗氧化能力。
[0068]
将8ml的aml-12细胞悬液以1
×
106个/ml的密度接种到100mm培养皿里。在超净台中静置10min，然后放在培养箱内。培养24h后，将培养皿内的细胞用pbs润洗2-3次。除对照组其余实验组加入6ml浓度为30μm的h2o2工作液诱导6h。吸尽液体，分为对照组(6ml完全培养基)、h2o2组(6ml完全培养基)、gsh组(600μl gsh工作液+5400μl完全培养基)、1-乳果糖组(200μg/ml)，把不同工作液加入到各个培养皿中，在超净台内静置10min，然后放到培养箱内24h。培养结束后，将培养皿取出。将各培养皿里的培养基收集到15ml的ep管，然后用pbs将每个皿清洗2-3次，收集pbs洗涤液到上述的ep管内，然后每个培养皿内加入胰蛋白酶-edta消化液进行消化细胞，用ep管内回收的液体来终止消化，回收所有液体以及细胞到上述ep管内。将ep管在4℃，2000g，10min条件下离心，离心结束后吸净上清。用pbs重悬细胞，在4℃，2000g，10min条件下离心。
[0069]
检测mda：加入细胞裂解液(每100万细胞加入0.1ml细胞裂解液)；检测sod：加入sod样品制备液(每100万细胞加入0.1ml样品制备液)；检测gsh：则需加入细胞沉淀体积3倍量的蛋白去除试剂s溶液裂解细胞。之后在液氮与70℃水浴锅中反复冻融三次。然后在4℃，10000g，15min条件下离心，取上清进行检测。
[0070]
根据实验结果显示，当细胞经过h2o2处理后，细胞内mda的含量显著升高，细胞内
gsh、sod的含量降低，sod是是生物体内一种重要的抗氧化酶，gsh是动物细胞中关键的抗氧化剂，当gsh、sod含量减少，这说明细胞发生了明显的氧化损伤。而经过1-乳果糖以及谷胱甘肽给药处理后，细胞内mda的含量显著降低，gsh、sod的含量显著升高，这证明了1-乳果糖与谷胱甘肽都具有良好的抗氧化能力，且1-乳果糖的效果优于谷胱甘肽。
[0071]
综上，区别于已有的乳果糖，本发明所制备1-乳果糖在细胞水平表现出优异的抗氧化能力，说明其作为抗氧化药物等领域具有广阔的开发前景。

技术特征：
1.一种新型乳果糖，其特征在于，所述的乳果糖的结构式为如下的任一种：2.权利要求1所述的新型乳果糖的制备方法，其特征在于，所述的方法是使用邻-硝基酚-β-d-半乳糖苷和果糖作为原料，用psagal蛋白酶进行催化制备的。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的psagal蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:2。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的psagal蛋白酶的编码基因的核苷酸序列为seq id no:1。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的方法是在缓冲溶液中加入邻-硝基酚-β-d-半乳糖苷、果糖和蛋白酶进行催化反应，然后离心除去沉淀；上清液进行萃取，萃取溶液冻干获得产物。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的缓冲溶液中加入10-20mm邻-硝基酚-β-d-半乳糖苷onpg，60-500mm果糖和0.1u/ml psagal蛋白酶。7.权利要求1所述的新型乳果糖在抗氧化或防止细胞氧化损伤中的应用。8.权利要求1所述的新型乳果糖在制备抗氧化或防止细胞氧化损伤的制品中的应用。9.一种抗氧化的制品，其特征在于，所述的制品中包含有药理有效浓度的权利要求1所述的新型乳果糖。10.如权利要求9所述的制品，其特征在于，所述的制品为液体制剂或固体粉末剂型。

技术总结
本发明提供一种新型乳果糖，其制备方法是使用邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷ONPG和果糖作为原料，用PsaGal蛋白酶进行催化制备的。所述的PsaGal蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。本发明还提供的新型异乳果糖的一种用途，是在抗氧化或防止细胞氧化损伤中的应用。本发明利用酶法制备的新型乳果糖纯度高，有利于后续的分离纯化；同时具有独特的抗氧化活性，在抗氧化创新药物、保健食品领域开发潜力巨大。保健食品领域开发潜力巨大。保健食品领域开发潜力巨大。


技术研发人员：律倩倩 张馨 刘伟治 耿鑫 李明
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/8/6