一种改善覆盆子风味的方法及其应用

1.本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种改善覆盆子风味的方法及其应用。


背景技术：

2.覆盆子(rubus idaeus l.)，也叫树莓，味甘，性温，果实中含有大量的多酚类物质、有机酸、氨基酸、维生素、微量元素以及超氧化物歧化酶等抗氧化活性成分，有补肾固精、助阳缩尿功能，用于治疗肾虚遗精、阳萎、遗尿和尿频等病症。由于其富含超氧化物歧化酶(sod)成分，所以覆盆子的抗衰老、抗癌和抗辐射能力很强。此外，覆盆子中含有大量具有生物活性作用的多酚类物质，如鞣花酸、花青素等，具有抗氧化，祛黄褐斑的作用。因此，覆盆子是高营养且具备药理作用的“药食同源”的水果，具有重要的开发潜力。
3.目前，对覆盆子产品的开发主要集中在药用以及功能成分(如多酚、多糖和鞣花酸等)提取方面，面对的消费人群的范围比较小。而乳酸菌发酵制备的覆盆子饮料口感风味良好，比较适合爱美人士、中老年人饮用，对人体具有一定的保健养生功效，符合人们对健康生活的追求。但是针对覆盆子发酵饮料方面的研究和产品开发鲜有报道，特别是在开发针对覆盆子原料的适制性乳酸菌发酵菌株(生长良好、产酸能力强、促进覆盆子游离多酚的释放以及提高抗氧化等)方面国内还未有报道。因此，开发出一种富含多酚和益生菌，具有抗氧化功能的覆盆子发酵饮料，更适合现代人的对健康食品的需求。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种覆盆子发酵方法，既改善了覆盆子的风味，又提高了其益生功能，更适合现代人的对食品风味以及健康食品的需求。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
6.本发明第一方面提供了一种改善覆盆子风味的方法，包括以下步骤：
7.s1、往覆盆子干果中加水，并添加果胶酶，40-50℃酶解2-4h；
8.s2、酶解后加糖调节料液的初始糖度至8％-12％，并调节料液的初始ph值为4.3-4.7；
9.s3、对成分调整后的料液进行巴氏灭菌后，再加入由戊糖乳杆菌p-1与植物乳杆菌r-1制成的种子液，于37℃条件下恒温发酵45-55h。
10.本发明利用戊糖乳杆菌p-1和植物乳杆菌r-1进行组合协同发酵覆盆子，相比单菌发酵和未发酵样品，其感官评价中香气成分评分最高，能够显著提高芳樟醇、2-庚酮和β-苯乙醇特征醇类风味物质的含量，也可提高2-庚酮、水杨酸甲酯、乙酸壬酯、α-松油烯等其他特征香气成分含量(oav》1)，同时可以降低1-辛烯-3醇(土腥味)、庚酸(腐臭味)、壬酸(酸败味)、葵酸(难闻气味)等不良风味的含量(oav》1)，进而改善了覆盆子的风味。
11.经研究发现，加入经模拟消化后的覆盆子乳酸菌发酵样品在体外发酵48h后，多种有益菌属的丰度上升40％以上，包括双歧杆菌属(bifidobacterium)、乳杆菌属(lactobacillus)等，多种有害肠道菌属丰度降低50％以上，包括克雷伯氏菌属
(klebsiella)、lachnoclostridium属、多尔氏菌属(dorea)和柯林斯菌属(collinsella)等。同时加入经模拟消化后的覆盆子乳酸菌发酵样品体外发酵48h后，短链脂肪酸含量显著提高(p《0.05)。且携带活菌的覆盆子乳酸菌发酵饮料相较于灭活后的覆盆子乳酸菌发酵饮料，短链脂肪酸含量提高7.90％。可见，本发明发酵覆盆子的方法，提高了有益菌，降低了有害菌，且促进了短链脂肪酸的形成，使其更好的发挥调节人体肠道菌群多样性、向肠道上皮细胞提供营养、减少炎症的产生、抑制肠道中的致病菌等功能，更适合现代人的对食品风味以及健康食品的需求。
12.作为本发明的一个优选实施方式，步骤s3中，种子液的制备方法为：先用mrs培养基分别对戊糖乳杆菌p-1与植物乳杆菌r-1进行活化，并收集菌体用生理盐水重悬至od
600nm
值0.6-0.7，然后将两种菌悬液等体积混匀。
13.作为本发明的一个优选实施方式，步骤s3中，按体积计，种子液的接种量为料液的5-7％。
14.作为本发明的一个优选实施方式，步骤s1中，覆盆子干果在使用前先粉碎过35-45目筛。
15.作为本发明的一个优选实施方式，步骤s1中，覆盆子干果与水的料液比为1g：15-25ml。
16.作为本发明的一个优选实施方式，步骤s1中，果胶酶的添加质量为覆盆子干果的0.3％-0.5％。
17.作为本发明的一个优选实施方式，步骤s2中，用白砂糖调节料液的初始糖度，用食品级小苏打或食品级柠檬酸调节料液的初始ph值。
18.作为本发明的一个优选实施方式，步骤s3中，所述灭菌为巴氏灭菌，即65℃恒温加热30-45min。
19.作为本发明的一个优选实施方式，步骤s3中，发酵后还包括过滤步骤，即采用灭菌单层纱布进行过滤。
20.本发明第二方面提供了一种功能食品，采用第一方面所述的一种改善覆盆子风味的方法制备得到。
21.作为本发明的一个优选实施方式，所述功能食品包括功能饮料。具体为覆盆子乳酸菌发酵饮料。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
23.本发明公开了一种改善覆盆子风味的方法，利用戊糖乳杆菌p-1与植物乳杆菌r-1进行协同发酵，显著提高了芳樟醇、2-庚酮和β-苯乙醇特征醇类风味物质的含量，同时可以降低1-辛烯-3醇(土腥味)、庚酸(腐臭味)、壬酸(酸败味)、葵酸(难闻气味)等不良风味的含量，进而改善了覆盆子的风味。同时，经过混菌发酵，显著提高了有益菌，降低了有害菌，并促进了短链脂肪酸的形成，使其更好的发挥调节人体肠道菌群多样性、向肠道上皮细胞提供营养、减少炎症的产生、抑制肠道中的致病菌等功能，使覆盆子功能食品更适合现代人的对食品风味以及健康食品的需求。
附图说明
24.图1为覆盆子发酵饮料的加工工艺流程图；
25.图2为覆盆子发酵饮料中挥发性风味物质oav值分析；
26.图3为细菌群落在门水平上的相对丰度；注：bg为空白对照组；ufg为未发酵的覆盆子汁组；fig为灭活覆盆子乳酸菌发酵饮料组；fg为覆盆子乳酸菌发酵饮料组。
27.图4为细菌群落在属水平上的相对丰度；注：bg为空白对照组；ufg为未发酵的覆盆子汁组；fig为灭活覆盆子乳酸菌发酵饮料组；fg为覆盆子乳酸菌发酵饮料组。
28.图5为体外发酵过程中不同组别的ph值变化；
29.图6为体外发酵过程中不同组别的短链脂肪含量变化；注：bg为空白对照组；ufg为未发酵的覆盆子汁组；fig为灭活覆盆子乳酸菌发酵饮料组；fg为覆盆子乳酸菌发酵饮料组。
具体实施方式
30.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
31.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
32.下列实施例涉及的戊糖乳杆菌p-1与植物乳杆菌r-1的保藏信息如下：
33.(1)戊糖乳杆菌p-1：保藏时间：2021年9月18日；保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；保藏编号：gdmcc no：61941；保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；分类命名：lactobacillus pentosus。
34.(2)植物乳杆菌r-1：保藏时间：2023年04月14日；保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；保藏编号：gdmcc no：63347；保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；分类命名：lactiplantibacillus plantarum。
35.实施例1混菌发酵制备覆盆子饮料的方法
36.如图1所示，包括以下步骤：
37.(1)粉碎过筛：覆盆子干果除去杂质后，用高速粉碎机进行粉碎后过40目筛。
38.(2)酶解：称取一定量的覆盆子干粉，按1∶20(g：ml)的料液比加入饮用水，并添加0.4％(与覆盆子的质量比)的果胶酶，于40℃水浴锅中酶解3h。
39.(3)成分调整：于酶解后的料液中加入浓度为50g/l的白砂糖溶液，调节料液的初始糖度至10％，然后加入一定量的食品级小苏打或食品级柠檬酸调节发酵液的初始ph值为4.5。
40.(4)巴氏灭菌：将成分调整后的料液在65℃的水浴锅中恒温加热30min，灭酶灭菌后冷却备用。
41.(5)乳酸菌活化：分别取实验室保存的乳酸菌菌株(戊糖乳杆菌p-1与植物乳杆菌r-1)的甘油管，在mrs固体培养基上进行划线，于37℃下培养24h，挑取单菌落转接至5ml mrs液体培养基中，37℃培养24h，活化两代。
42.(6)接种发酵：活化后的菌液于4℃、8 000r/min的条件下离心5min，弃上清液，沉淀用无菌生理盐水进行洗涤，在相同离心条件下再次离心，重复2次，用无菌生理盐水重悬乳酸菌并调节od
600nm
值0.65左右。分别吸取等体积的戊糖乳杆菌p-1与植物乳杆菌r-1的菌
悬液混匀，即为发酵用的种子液，随后按6％的接种量接种到步骤(5)的料液中，于37℃条件下恒温发酵52h。
43.(7)过滤、贮藏：采用灭菌后单层纱布进行过滤，过滤后的成品于4℃冰箱中贮藏，即得到覆盆子发酵饮料成品。
44.对比例1未发酵覆盆子饮料的制备方法
45.制备方法同实施例1的步骤(1)-(4)，并且在步骤(3)中省去调节ph的操作。
46.对比例2单菌发酵制备覆盆子饮料的方法
47.制备方法同实施例1，发酵时只采用戊糖乳杆菌p-1进行单菌发酵，或只采用植物乳杆菌r-1进行单菌发酵。
48.对比例3灭活覆盆子乳酸菌发酵饮料的制备方法
49.制备方法同实施例1，制得覆盆子乳酸菌饮料成品后，进行灭活处理，即65℃的水浴锅中恒温加热30min。
50.实验例1覆盆子乳酸菌发酵饮料的制备效果验证
51.1、实验方法
52.1.1、感官评价标准
53.分别从色泽、香气、口味、组织状态、总体接受性5个方面对覆盆子乳酸菌饮料进行感官评价，满分为100分，选取10名经过感官培训的人员对覆盆子乳酸菌饮料进行感官评价并打分，结果取平均值。覆盆子乳酸菌饮料感官评价标准见表1。
54.表1覆盆子乳酸菌饮料感官评价标准
[0055][0056]
1.2、挥发性风味物质的测定
[0057]
采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术(headspace solidphase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer,hs-spme-gc-ms)对挥发性风味物质进行测定：
[0058]
(1)样品前处理：取5ml液体样品，加入一定量的内标物，在固相微萃取(spme)仪器上60℃平衡10min，插入老化后的萃取针头顶空萃取40min。随后将其插入气相色谱仪，于250℃下解吸5min。
[0059]
(2)色谱条件：采用hp-innowax毛细管色谱柱(60m
×
0.25mm
×
0.25μm)，40℃柱温下保持6min，以3℃/min升温到100℃，最后以5℃/min升温至230℃，保持15min；载气为氦气(he)；流量1ml/min；不分流。
[0060]
(3)质谱条件：电子电离源为(electron ionization,ei)源，离子源温度为230℃；四级杆温度为150℃；电子能量为70ev；发射电流为35μa，质量扫描范围为30～500amu。
[0061]
(4)定性分析：挥发性风味物质的定性利用美国国家标准技术研究所(national institute of standards and technology,nist)普库对其进行解谱。
[0062]
(5)定量分析：以2-辛醇为内标物，采用内标法计算各挥发性风味物质的含量，其数学式如下：
[0063][0064]
式中：c为各挥发性风味物质的含量，mg/l；c0为内标物的质量浓度，mg/l；a为各挥发性物质的峰峰面积；a0为内标物的峰面积。
[0065]
1.3、覆盆子混菌发酵饮料的模拟消化及体外发酵
[0066]
1.3.1、体外模拟消化
[0067]
体外消化实验分为口腔、胃和肠3个阶段：
[0068]
(1)模拟消化液的配置：
[0069]
模拟唾液：准确称取0.0111g的cacl2，用超纯水溶解并定容到100ml，cacl2的终浓度为1mm,再加入0.13g的α-淀粉酶，溶解后用0.22μm的滤膜进行过滤除菌，即为模拟唾液。
[0070]
模拟胃液：准确称取400mg胃蛋白酶，用0.1m hcl溶液溶解后，继续用0.1m hcl溶液定容至100ml，用0.22μm的滤膜过滤除菌，即为模拟胃液。
[0071]
模拟肠液：准确称取2.4g胰蛋白酶和1.2g胆盐，用0.1m nahco3溶液定容至100ml，用0.22μm的滤膜过滤除菌，即为模拟肠液。
[0072]
(2)模拟口腔消化过程
[0073]
分别取40ml样品置于6个250ml的具塞锥形瓶中，分别编号为(1)～(6)。往编号为(1)～(5)的锥形瓶中加入25ml生理盐水和5ml模拟唾液，(6)号加入30ml生理盐水，在37℃、100rpm/min的条件下避光振荡5min。(5)号和(6)号锥形瓶冷冻后备用，之后进行总酚含量及抗氧化活性的测定，其中(5)号锥形瓶命名为口腔消化实验组，(6)锥形瓶命名为口腔消化对照组。
[0074]
(3)模拟胃消化过程
[0075]
经口腔模拟消化后，剩余的4个锥形瓶中均保留30ml口腔消化液，再分别加入20ml生理盐水，用1m hcl溶液将混合液的ph值调至3.0。(1)～(3)号锥形瓶中分别加入10ml模拟
胃液，(4)号锥形瓶中加入10ml 0.1m hcl溶液，在37℃、100rpm/min的条件下避光振荡2h。(3)号和(4)号锥形瓶冷冻后备用，之后进行总酚含量及抗氧化活性的测定，其中(3)号锥形瓶命名为胃消化实验组，(4)锥形瓶命名为胃消化对照组。
[0076]
(4)模拟肠消化过程
[0077]
(1)、(2)号锥形瓶中各保留30ml胃消化液。取2个一定长度的透析袋，用无菌生理盐水洗干净后，透析袋中分别加入2ml0.5m nahco3溶液和8ml无菌生理盐水，再将透析袋的两端系紧。分别放入2个锥形瓶中，在37℃、100rpm/min的条件下避光振荡90min。当消化液的ph为6.5～7.0时，在(1)号锥形瓶中加入20ml模拟肠液，在(2)号锥形瓶中加入20ml 0.1m nahco3溶液，在37℃、100rpm/min的条件下避光振荡2h。(1)号和(2)号锥形瓶冷冻后备用，之后进行总酚含量及抗氧化活性的测定，其中(1)号锥形瓶命名为肠消化实验组，(2)锥形瓶命名为肠消化对照组，(1)号锥形瓶中的透析袋内的液体命名为肠透析液，(2)号锥形瓶中的透析袋内的液体命名为肠透析对照液。
[0078]
1.3.2、模拟结肠发酵
[0079]
(1)消化样品的制备
[0080]
以生理盐水为空白组(blank group，bg)，以未发酵的覆盆子汁为对照组1(unfermented group，ufg)和灭活后的覆盆子乳酸菌发酵饮料为对照组2(fermentation inactivation group，fig)，以覆盆子乳酸菌发酵饮料为实验组(fermentation group，fg)，各组的消化样品参照1.3.1中的方法制备。
[0081]
(2)生长培养基的配置
[0082]
分别称取酵母提取物2g，蛋白胨2g，无水氯化钠0.1g，无水kh2po
4 0.04g，无水k2hpo40.04g，无水nahco
3 2g，cacl2·
6h2o 0.01g，mgso4·
7h2o 0.01g，盐酸半胱氨酸0.5g，胆汁盐0.5g，血红素0.02g，刃天青1mg，维生素k
1 10μl，吐温80 2ml，用去离子水定容至1l，并在121℃下灭菌20min。
[0083]
(3)肠道菌群的来源
[0084]
收集4名志愿者(年龄在20-25岁之间，男女各2名，正常饮食，没有胃肠道疾病以及最近3个月没有服用过抗生素类药物，自愿参与该实验)的新鲜粪便。每收集一名志愿者的粪便后，立即在超净工作台中称取20g粪便于厌氧盒中，每次收集完一名志愿者的粪便都需要更换厌氧包和厌氧指示剂，完成后放于4℃冰箱保存，直至收集完所有志愿者的粪便。实验前，称取50g粪便混合物于烧杯中，加入500ml pbs溶液，0.5mg刃天青，搅拌均匀后用灭菌后的多层滤布进行过滤，以除去粪便中存在的大颗粒物质，再将过滤后的液体转移至已灭菌的带盖棕色瓶中，制得粪便菌液，置于厌氧操作箱中，并在1h内使用。
[0085]
(3)模拟结肠发酵过程
[0086]
吸取6.5ml生长培养基于厌氧管中，再分别吸取2ml各组消化样品和1.5ml粪便菌液与生长培养基混匀，在37℃下培养，分别于0、6、12、24、48h后取样，取样后将厌氧管置于冰上，随后在4℃、10000rpm/min的条件下离心10min，收集发酵上清液放于-20℃冰箱中备用，之后用于短链脂肪酸含量、总酚含量以及抗氧化活性的测定；收集底部沉淀的菌体放于-80℃冰箱中保存备用，之后用于dna提取和16s rrna测序。
[0087]
1.3.3、短链脂肪酸含量的测定
[0088]
测定体外发酵液中的短链脂肪酸含量：吸取0.8ml体外发酵上清液，再加入
0.16ml50％h2so4溶液和0.04ml2-乙基丁酸溶液，混合均匀后，在4℃的条件下酸化30min。向离心管中加入0.8ml乙酸乙酯溶液，振荡1min，在8000rpm/min的条件下离心5min，吸取上层清液，再用0.22μm的有机滤膜进行过滤，可放置于-80℃冰箱中保存，并在1天内完成分析。
[0089]
气相条件：色谱柱为wax(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)，进样量为0.1μl，载气：氮气，恒流模式。分流比为30∶1；进样口温度为250℃；柱温箱温度为162℃恒温；fid检测器的温度为250℃。升温条件为：初始温度为105℃，保持3min；以10℃/min的速率升温至170℃；再以70℃/min的速率升温至240℃，保持2min。分别配置浓度为20mmol/l的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和2-乙基丁酸标准品，分别吸取1ml各标准品进行混合制备浓度为20mmol/l的混合标品，再用乙酸乙酯将混合标品的浓度稀释到浓度为20mmol/l、10mmol/l、5mmol/l、2.5mmol/l、1.25mmol/l、625μmol/l和312.5μmol/l的系列梯度，根据各化合物的保留时间，进行标准曲线的绘制，从而对样品中的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的含量进行定量。
[0090]
样品中的乳酸含量采用南京建成生物科技有限公司的乳酸试剂盒(a019-2-1)进行测定。
[0091]
1.3.4、肠道微生物多样性分析
[0092]
测定肠道微生物多样性：取-80℃冰箱中的沉淀进行解冻，解冻后按照omega粪便微生物dna提取试剂盒说明书提取粪便中的dna。以微生物核糖体rna等能够反映菌群组成和多样性的目标序列为靶点，选取扩增区域为rrna基因的v3和v4可变区，引物为：341f：5
’‑
cctaygggrbgcascag-3’；806r：5
’‑
ggactacnngggtatctaat-3’。将纯化后的扩增子连接测序接头，构建测序文库(具体操作参见“刘楚.山竹果皮中原花青素经体外消化后抗氧化性及对肠道菌群影响的研究[d].浙江工商大学,2020.”)，在illumina miseq测序仪上进行测序。
[0093]
2、结果分析
[0094]
2.1、混菌发酵改善覆盆子饮料感官评价和风味分析
[0095]
表2发酵前后覆盆子乳酸菌饮料挥发性风味物质及含量
[0096]
[0097]
[0098]
[0099][0100]
注：“na”表示未检出。
[0101]
覆盆子乳酸菌饮料中的风味物质是影响感官品质的一个重要因素。由表2可知，覆盆子在发酵前后共检测出57种挥发性香气成分，其中，15种醇类物质，12种酮类物质，9种醛类物质，7种酸类物质，8种酯类物质，3种萜烯类物质以及3种其他类物质，除了柏木脑、己醛和香叶基丙酮外，其余香气成分均为发酵前后共有的成分。oav是指气味化合物浓度与其对应介质中气味阈值的比值，oav越大，说明该香气化合物对风味的贡献越大，在发酵过程中oav》1的风味物质共有21种，1》oav》0.2的风味物质有13种。复合菌株发酵结束时oav＞1的物质有20种，其中醇类7种、酯类3种、醛类2种、酸类1种、萜烯类2种、酮类4种、酚类1种，oav值排前四的风味物质为：1-辛烯-3-醇、芳樟醇、2-庚酮和β-苯乙醇(图2)。
[0102]
覆盆子发酵原液在经过混菌发酵后，醇类物质的总含量变化显著，其含量增加了137％，且发酵后的醇类物质占总挥发性物质含量的64％。检测出来的主要醇类物质是β-苯乙醇，发酵后其含量提高3.03倍，达到3.73mg/l，同时其含量显著高于p-1发酵组的2.82mg/l和r-1发酵组的3.35mg/l，oav分析结果显示排前四的风味物质为1-辛烯-3-醇、芳樟醇、2-庚酮和β-苯乙醇(图2)，β-苯乙醇具有玫瑰的香气，赋予了覆盆子乳酸菌饮料独特的香甜气味。同时，混菌发酵样品中芳樟醇含量达到0.59mg/l，高于p-1，r-1和未发酵样品中的含量。芳樟醇具有浓青带甜的木青气息，似玫瑰木香气，香料分类法里属于“头香香料”。
[0103]
此外，相比未发酵和单菌发酵样品，混菌发酵样中其他含量增加较多且oav》1的醇类物质有正己醇、α-松油醇、橙花醇，分别比未发酵样品提高了1.67倍、1.44倍和3.32倍，结合这些挥发性香气的阈值，这5种醇类物质是覆盆子乳酸菌饮料的醇类特征香气成分，赋予了覆盆子乳酸菌饮料玫瑰花香和果香。此外，oav值最高对覆盆子发酵饮料风味贡献最明显的1-辛烯-3醇具有明显的土腥味，在混菌发酵后，其含量降低36％，降低了该物质对覆盆子发酵饮料风味的不良影响。
[0104]
在氧化反应中，酮类物质的生成意味着氧化反应的结束，而乳酸菌的加入可以促进氧化反应的进行。酮类物质是一种香气阈值较低的物质，因此其对覆盆子乳酸菌饮料的风味有较大的贡献。与发酵前相比，2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-壬酮的含量在经过乳酸菌发酵之后增加较明显，分别增加了58％、65％、81％，其中oav值排在前三且对风味贡献率较大的是2-庚酮，在混菌发酵样品中其含量要高于单菌发酵样品，是覆盆子饮料的特征香气成分，赋予了饮料果香及轻微的药香味。酯类物质的总含量仅次于醇类物质，其生成可能是乳酸菌在发酵过程中，在酯化酶系催化下，促使饮料中的醇类物质与有机酸进行反应，合成某些酯类物质。经过发酵，混菌样品中oav》1的水杨酸甲酯和乙酸壬酯的含量相比未发酵样品提高2.04倍、1.73倍，并高于单菌发酵的含量，这两种物质能赋予了覆盆子乳酸菌饮
料冬青叶香气和栀子花香气。
[0105]
经乳酸菌发酵后，其中不良酸类风味物质【如庚酸(腐臭味)、壬酸(酸败味)、葵酸(难闻气味)等】的总含量降低了61％，同时混菌发酵能降低三种具有不良风味的高级有机酸含量，降低了这些物质对覆盆子饮料风味的影响。此外，混菌发酵后，萜烯类物质含量增加显著，其中α-松油烯的含量增加了12倍，是覆盆子乳酸菌饮料的特征香气成分，这些萜烯类物质赋予了覆盆子乳酸菌饮料果香、草香和花香。醛类物质因其本身的结构不稳定，容易被氧化或还原成其他物质，发酵后含量降低了65％。与发酵前相比，覆盆子饮料中醛类物质的含量均减少，其中，具有苦杏仁味的苯甲醛含量显著降低了77％，减弱了覆盆子饮料的苦味。
[0106]
结合感官评价结果(表3)，混菌发酵样品的风味评分为19.55，要显著高于未发酵和单菌发酵的样品(p《0.05)，因此混菌发酵能显著改善覆盆子发酵饮料的风味。
[0107]
表3不同覆盆子乳酸菌发酵饮料感官评分
[0108][0109]
2.2、混菌覆盆子发酵饮料体外发酵过程中肠道菌群的变化
[0110]
已有研究表明，人体的肠道中存在大量微生物菌群，这些微生物菌群可以防止致病菌在肠道的定植；利用膳食化物产生对人体有益的代谢产物，从而提高人体肠道的免疫力，进而维持人体的健康。研究表明，可以通过服用含有乳酸菌等益生菌产品提高肠道菌群中有益菌的含量，从而改变肠道环境保持肠道菌群的稳定。
[0111]
分别对空白对照组bg(生理盐水)、对照组ufg(未发酵的覆盆子汁)、对照组fig(灭活覆盆子乳酸菌发酵饮料)及实验组fg(覆盆子乳酸菌发酵饮料)4个组别分别进行体外模拟消化后，随即将消化液进行体外结肠发酵48h，于0、6、12、24、48h取样，通过16s rdna测序鉴定肠道细菌组成的变化。如图3所示，肠道菌群在门水平(phylum)上，主要有梭杆菌门(fusobacteria)、放线菌门(actinobacteria)、拟杆菌门(bacteroidetes)、厚壁菌门(firmicutes)和变性菌门(proteobacteria)组成。在体外发酵48h后，与bg组相比，其余3组在体外发酵48h后，变性菌门(proteobacteria)和放线菌门(actinobacteria)的细菌相对丰度显著上升(p＜0.05)，均上升10％以上；梭杆菌门(fusobacteria)和拟杆菌门(bacteroidetes)的细菌相对丰度显著下降(p＜0.05)，均下降50％以上；厚壁菌门(firmicutes)的细菌丰度基本不变。
[0112]
如图4所示，在肠道菌群的属(genus)水平上，和bg组相比，ufg、fig和fg组的菌群
结构都发生一定的改变。其中，埃希氏菌属(escherichia)和双歧杆菌属(bifidobacterium)在发酵过程中相对丰度显著上升，分别上升10％和2倍以上；考拉杆菌属(phascolarctobacterium)和拟杆菌属(bacteroides)的相对丰度显著下降，均下降40％以上；其余菌属均有不同程度的变化。在肠道菌群中，埃希氏菌属(escherichia)中的大多数菌株是人体肠道正常的菌群。双歧杆菌属(bifidobacterium)和乳杆菌属(lactobacillus)是常见的肠道有益菌，与bg组和ufg组相比，fig组和fg组中的双歧杆菌属和乳杆菌属的相对丰度均增加2倍以上。而fg组和fig组相比，这两种菌属的细菌丰度变化不大。表明摄入灭菌型和活菌型的覆盆子乳酸菌发酵饮料均能够提高这两种菌属在肠道微生物中的占比，有利于人体维持肠道健康，且灭菌型覆盆子乳酸菌发酵饮料不需要冷链运输，可以降低成本。
[0113]
此外，对人体有益的细菌菌属，如巨球型菌属(megasphaera)、普拉梭菌属(faecalibacterium)、韦荣氏球菌属(veillonella)等的相对丰度有所上升，均上升50％以上。在本研究中，可观察到添加覆盆子乳酸菌发酵饮料的fig和fg组，多种机会致病菌属和有害细菌属水平相对丰度下降，包括考拉杆菌属(phascolarctobacterium)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、lachnoclostridium属、霍尔德曼氏菌属(holdemanella)、多尔氏菌属(dorea)和柯林斯菌属(collinsella)，这些菌属与人体常见的疾病相关联，体外发酵48h后，这些有害菌属的细菌丰度均下降了50％以上。其中，考拉杆菌属(phascolarctobacterium)是人体常见的肠道微生物，可以产生乙酸和丙酸，增强人体肠道功能，对人体健康有作用，但其与患心血管病风险的氧化三甲胺水平成正相关，且含有氧化三甲胺的代谢基因cut c/d，fig和fg组考拉杆菌属的丰度下降，说明覆盆子乳酸菌发酵饮料可以降低患心血管病的概率。据已有的报道可知，克雷伯氏菌属(klebsiella)是一种获得细菌性感染的常见病原微生物；lachnoclostridium属丰度的上升与结肠癌症直接相关；霍尔德曼氏菌属(holdemanella)与胃食管反流病伴焦虑、抑郁密切相关；多尔氏菌属(dorea)丰度的增加与肠易激综合征的发病相关。
[0114]
综上所述，相较于加入模拟消化后的生理盐水，体外发酵中加入未接种的覆盆子汁和覆盆子发酵饮料，能有效提高对肠道有益细菌菌属的相对丰度，降低有害菌属的相对丰度。相比于未接种乳酸菌的覆盆子汁，覆盆子乳酸菌发酵饮料更能降低肠道中有害菌属的丰度，防止致病菌的定植，增强益生功能。
[0115]
2.3、体外发酵过程中短链脂肪酸的变化
[0116]
由图5可知，经体外发酵后，相较于bg组，添加覆盆子汁的ufg组和覆盆子乳酸菌发酵饮料的fig和fg组ph下降幅度较大。可见，服用覆盆子汁和覆盆子乳酸菌发酵饮料均能降低结肠环境的ph值，且发酵后的覆盆子饮料下降地更加明显。结肠环境ph值的下降能够抑制致病菌的定植。由6的结果可知，相较于bg组，其余3组致病菌属的相对丰度有所下降。乳酸和短链脂肪酸主要是结肠中的厌氧菌通过发酵未消化的碳水化合物或降解蛋白质产生的，具有调节人体肠道菌群多样性、向肠道上皮细胞提供营养、减少炎症的产生、抑制肠道中的致病菌等功能。
[0117]
由图5可知，经体外发酵后，相较于bg组，添加覆盆子汁的ufg组和覆盆子乳酸菌发酵饮料的fig和fg组ph下降幅度较大，消化液的ph值由起先的8.0分别下降至6.1左右。可见，服用覆盆子汁和覆盆子乳酸菌发酵饮料均能降低结肠环境的ph值，且发酵后的覆盆子
饮料下降地更加明显。而结肠环境ph值的下降能够抑制致病菌的定植。由图6的结果可知，相较于bg组，其余3组致病菌属的相对丰度有所下降。乳酸和短链脂肪酸主要是结肠中的厌氧菌通过发酵未消化的碳水化合物或降解蛋白质产生的，具有调节人体肠道菌群多样性、向肠道上皮细胞提供营养、减少炎症的产生、抑制肠道中的致病菌等功能。由图6可知，在体外发酵48h后，覆盆子乳酸菌发酵饮料fg组产生的scfas含量最高，达到33.33
±
0.05mmol/l，其次是灭活覆盆子乳酸菌发酵饮料fig组，为30.89
±
0.02mmol/l，再者是添加未接种的覆盆子汁ufg组，为27.28
±
0.05mmol/l，最后是生理盐水bg组，为11.70
±
0.02mmol/l。由此可知，食用覆盆子乳酸菌发酵饮料可以提高体外发酵后scfas含量，从而降低肠道环境的ph值。在本研究中，相较于灭活后的覆盆子乳酸菌发酵饮料，携带活菌的覆盆子乳酸菌发酵饮料更能提高体外发酵后scfas的含量，提高了7.90％，表明乳酸菌活菌与覆盆子乳酸菌发酵饮料的协同作用能提高覆盆子乳酸菌发酵饮料的益生功效。
[0118]
不同组别体外发酵过程中各种scfas的含量的变化见表4。在体外发酵过程中，各组的sfca水平随着体外发酵的进行逐渐升高，其中以乙酸、丙酸和丁酸为主。bg组的乳酸含量一直处于较低的水平，而添加覆盆子汁和发酵覆盆子汁的组别在经体外发酵24h后，乳酸含量显著提高(p《0.05)，与发酵前相比提高10倍以上，但在48h时测得的乳酸含量显著下降(p《0.05)，乳酸含量均下降至0.13mm以下。在发酵前期，细菌丰度较高的梭杆菌属(fusobacterium)、肠道中的双歧杆菌属(bifidobacterium)及乳杆菌属(lactobacillus)能够发酵胃肠未消化完全的碳水化合物产生乳酸，随着发酵的进行，梭杆菌属(fusobacterium)细菌丰度逐渐下降，而厌氧菌属(anaerostipes)和韦荣氏球菌属(veillonella)这两种能将乳酸转化成丁酸和丙酸的细菌相对丰度上升(图4)，导致体外发酵过程中乳酸含量的下降。在体外发酵的过程中，双歧杆菌属(bifidobacterium)、肠球菌属(enterococcus)、韦荣氏球菌属(veillonella)、链球菌属(streptococcus)等将在发酵未消化的化合物时能产生大量的乙酸和丙酸。随着发酵的进行，乙酸和丙酸的含量逐渐增加，发酵48h后，fg组的乙酸和丙酸含量最高，分别达到16.21
±
0.02mmol/l和6.65
±
0.29mmol/l，其次是fig组，含量分别为13.36
±
0.10mmol/l和6.54
±
0.28mmol/l，ufg组含量分别为9.27
±
0.04mmol/l和5.75
±
0.22mmol/l，bg组含量分别为3.77
±
0.03g/l和3.38
±
0.02mmol/l，这与4种菌属在发酵过程中相对丰度的增加有关。丁酸盐与结肠细胞的抗炎和抗肿瘤作用相关，丁酸盐既可以由毛螺菌属(lachnospira)和小杆菌属(dialister)等细菌代谢未消化的碳水化合物产生，也可通过厌氧菌属(anaerostipes)代谢乳酸产生。在发酵过程中，这几种细菌菌属在发酵过程的相对丰度逐渐上升，这也解释了丁酸含量随着发酵的进行而不断增加的原因。此外，微量的异丁酸、戊酸和异戊酸在发酵过程中被检出。综上所述，覆盆子乳酸菌发酵饮料作为能源物质可增加结肠内的scfas水平，乳酸菌活菌与覆盆子乳酸菌发酵饮料的协同作用能提高体外发酵后的scfas含量。
[0119]
目前，对于发酵饮料胃肠道益生功能的报道甚少，主要集中在天然产物和发酵乳制品对胃肠道益生功能的报道。本研究填补了复合乳酸菌发酵覆盆子汁的体外发酵益生功能特性方面的空白。
[0120]
表4体外发酵过程中不同短链脂肪酸(scfas)含量的变化
[0121]
[0122][0123]
注：bg为空白对照组；ufg为未发酵的覆盆子汁组；fig为灭活覆盆子乳酸菌发酵饮料组；fg为覆盆子乳酸菌发酵饮料组。nd表示未检出。a、b、c表示不同组之间的显著性差异(p《0.05)。
[0124]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种改善覆盆子风味的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、往覆盆子干果中加水，并添加果胶酶，40-50℃酶解2-4h；s2、酶解后加糖调节料液的初始糖度至8％-12％，并调节料液的初始ph值为4.3-4.7；s3、对成分调整后的料液进行巴氏灭菌后，再加入由戊糖乳杆菌p-1与植物乳杆菌r-1制成的种子液，于37℃条件下恒温发酵45-55h。2.根据权利要求1所述的一种改善覆盆子风味的方法，其特征在于，步骤s3中，种子液的制备方法为：先用mrs培养基分别对戊糖乳杆菌p-1与植物乳杆菌r-1进行活化，并收集菌体用生理盐水重悬至od
600nm
值0.6-0.7，然后将两种菌悬液等体积混匀。3.根据权利要求1所述的一种改善覆盆子风味的方法，其特征在于，步骤s3中，按体积计，种子液的接种量为料液的5-7％。4.根据权利要求1所述的一种改善覆盆子风味的方法，其特征在于，步骤s1中，覆盆子干果在使用前先粉碎过35-45目筛。5.根据权利要求1所述的一种改善覆盆子风味的方法，其特征在于，步骤s1中，覆盆子干果与水的料液比为1g:15-25ml。6.根据权利要求1所述的一种改善覆盆子风味的方法，其特征在于，步骤s1中，果胶酶的添加质量为覆盆子干果的0.3％-0.5％。7.根据权利要求1所述的一种改善覆盆子风味的方法，其特征在于，步骤s2中，用白砂糖调节料液的初始糖度，用食品级小苏打或食品级柠檬酸调节料液的初始ph值。8.根据权利要求1所述的一种改善覆盆子风味的方法，其特征在于，步骤s3中，所述灭菌为巴氏灭菌，即65℃恒温加热30-45min。9.一种功能食品，其特征在于，采用权利要求1-8任一项所述的一种改善覆盆子风味的方法制备得到。10.根据权利要求9所述的一种功能食品，其特征在于，所述功能食品包括功能饮料。

技术总结
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种改善覆盆子风味的方法及其应用。本发明利用戊糖乳杆菌P-1与植物乳杆菌R-1进行协同发酵，显著提高了芳樟醇、2-庚酮和β-苯乙醇特征醇类风味物质的含量，同时可以降低1-辛烯-3醇(土腥味)、庚酸(腐臭味)、壬酸(酸败味)、葵酸(难闻气味)等不良风味的含量，进而改善了覆盆子的风味。同时，经过混菌发酵，显著提高了有益菌，降低了有害菌，并促进了短链脂肪酸的形成，使其更好的发挥调节人体肠道菌群多样性、向肠道上皮细胞提供营养、减少炎症的产生、抑制肠道中的致病菌等功能，使覆盆子功能食品更适合现代人的对食品风味以及健康食品的需求。现代人的对食品风味以及健康食品的需求。现代人的对食品风味以及健康食品的需求。


技术研发人员：费永涛 黄一鹤 胡方正 高苏娟 刘功良 白卫东
受保护的技术使用者：仲恺农业工程学院
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/8/6