一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法

1.本发明涉及一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，具体涉及一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，属于生物医药应用技术领域。


背景技术：

2.脊髓损伤是脊柱损伤最严重的并发症，往往导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍。脊髓损伤不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会对整个社会造成巨大的经济负担。由于脊髓损伤所导致的社会经济损失，针对脊髓损伤的预防、治疗和康复已成为当今医学界的一大课题。
3.参考已授权专利，cn107217037a制备神经干细胞的方法，该种神经干细胞的方法通过原代神经干细胞悬浮培养，达到纯化细胞的目的，之后加入血清进行细胞贴壁培养，极大的加强了神经干细胞的活性，提高了神经干细胞的增殖速度。
4.而，可以看出现有一些细胞治疗大多采用静脉注射的方式进行，将体外培养好的细胞注射到不同规格的氯化钠注射液中，部分情况下加入血清或人血白蛋白制成悬液回输给患者，然而，将氯化钠注射液或含有血清/人血白蛋白的混合液作为细胞保存液，几个小时后细胞存活率和生物学效力会很大程度的降低，不利于细胞较长时间的保存和远距离运输。因此，针对上述问题设计研发出一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，解决现有一些细胞治疗大多采用静脉注射的方式进行，将体外培养好的细胞注射到不同规格的氯化钠注射液中，部分情况下加入血清或人血白蛋白制成悬液回输给患者，然而，将氯化钠注射液或含有血清/人血白蛋白的混合液作为细胞保存液，几个小时后细胞存活率和生物学效力会很大程度的降低，不利于细胞较长时间的保存和远距离运输的问题。
6.本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，所述神经干细胞制备方法包括如下步骤：
7.s1.预培养：从感染慢病毒载体前的第2-5天起，用含血小板源生长因子的培养基预培养c17.2神经干细胞，同时制备神经干细胞保存液；
8.s2.铺板：将经过步骤(s1)预培养的c17.2神经干细胞于24孔板铺板，过夜培养；
9.s3.预处理：向c17.2神经干细胞的培养基中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵，并继续培养2-3个小时；
10.s4.用携带外源bfgf的慢病毒载体感染经步骤(s3)预处理的c17.2神经干细胞，37℃培养箱孵育6小时，吸弃培养基更换新的培养基继续培养；
11.s5.将培养的神经干细胞放置在保存液中进行保存。
12.进一步的，所述(s1)中每100ml保存液由以下组分组成：白蛋白1-5g、维生素1.0-1.5g、葡萄糖0.2-0.4g、氯化钠0.5-0.8g、氯化钾0.025-0.030g、肉苁蓉苷0.03-0.06g、甘油
1.5-2.0g、碱性成纤维细胞生长因子0.03-0.06g、磷酸氢二钠0.15-0.17g、磷酸氢二钾0.04-0.05g、硫酸软骨素0.1-0.15g、复方氨基酸0.10-0.15g，其余为注射用水。
13.进一步的，所述复方氨基酸由以下质量分数的原料组成：甘氨酸5％、精氨酸5％、亮氨酸15％、异亮氨酸25％、苏氨酸30％和甲硫氨酸20％组成。
14.进一步的，所述维生素选自维生素b、维生素c、维生素e和维生素k中的一种或多种。
15.进一步的，所述(s1)的培养基中还含有海藻糖和蔗糖，海藻糖和蔗糖质量比为3：1；
16.进一步的，所述步骤(s1)中的血小板源生长因子在培养基中的终浓度为5-10ng/ml。
17.进一步的，所述步骤(s1)中，从感染慢病毒载体前的第3-5天起，用含血小板源生长因子的培养基预培养c17.2神经干细胞。
18.进一步的，所述步骤(s2)中，将经过步骤(s1)预培养的c17.2神经干细胞于24孔板铺板的浓度为1
×
104-5
×
104个/孔。
19.进一步的，所述步骤(s3)中的聚二烯丙基二甲基氯化铵在培养基中的终浓度为3-5μg/ml。
20.进一步的，所述步骤(s3)中，向c17.2神经干细胞的培养基中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵，并继续培养2个小时。
21.本发明的有益效果是：该种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，保存液成分稳定、营养物质多元、溶液渗透体系缓冲力强，并且无毒环保、成分明确、安全稳定，便于细胞保存和运输；同时还能提高细胞的保存时间和保存率，能维持细胞的高活力和生物学特性，具有廉价、高效、无毒的优势，可以使c17.2神经干细胞更容易被携带外源bfgf的慢病毒载体感染，还可以改善插入bfgf的c17.2神经干细胞生长状况和bfgf的表达量。
附图说明
22.图1为本发明的方法流程图。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例一：
25.一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，所述神经干细胞制备方法如下：
26.s1.预培养：从感染慢病毒载体前的第2-5天起，用含血小板源生长因子的培养基预培养c17.2神经干细胞，同时制备神经干细胞保存液；
27.s2.铺板：将经过步骤(s1)预培养的c17.2神经干细胞于24孔板铺板，过夜培养；
28.s3.预处理：向c17.2神经干细胞的培养基中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵，并继续培养2-3个小时；
29.s4.用携带外源bfgf的慢病毒载体感染经步骤(s3)预处理的c17.2神经干细胞，37℃培养箱孵育6小时，吸弃培养基更换新的培养基继续培养；
30.s5.将培养的神经干细胞放置在保存液中进行保存。
31.在进行脊髓损伤的实验过程中：培养的神经干细胞放置在保存液中进行保存，然后通过脊髓损伤模型制作，按照tator脊髓损伤制作法，将大鼠椎管打开夹击并缝合护理，制作脊髓损伤动物模型，术后动物置于一斜板让其静止，记下斜板与水平面夹角度数，手术动物置于一开口圆盆，让动物爬行于其中，观察动物的运动及其协调情况并打分，保存液中的神经干细胞，经孵育、清洗，并于冰中待移植，保存液中的神经干细胞移植大鼠损伤的脊髓并缝合肌肉、皮肤和护理，过度麻醉动物并作心脏灌注，取出损伤的脊髓经固定行冷冻水平切片，黏贴于经铬矾明胶包被的玻片备用，脊髓损伤面积观察，使用免疫酶染色法，将做好的组织片经gfap单抗染色显示脊髓损伤空洞面积，神经干细胞在体内的存活观察，用免疫组织荧光染色法，把经细胞核染料标记的脊髓标本行神经干细胞标记分子染色，观察移植细胞的存活，神经干细胞在体内的迁移，细胞核染料标记的干细胞在移植大鼠损伤的脊髓4周后的迁移情况，记录整理。
32.优选的，所述(s1)中每100ml保存液由以下组分组成：白蛋白1-5g、维生素1.0-1.5g、葡萄糖0.2-0.4g、氯化钠0.5-0.8g、氯化钾0.025-0.030g、肉苁蓉苷0.03-0.06g、甘油1.5-2.0g、碱性成纤维细胞生长因子0.03-0.06g、磷酸氢二钠0.15-0.17g、磷酸氢二钾0.04-0.05g、硫酸软骨素0.1-0.15g、复方氨基酸0.10-0.15g，其余为注射用水。
33.具体的，将维生素、葡萄糖、氯化钠、氯化钾、硫酸软骨素、复方氨基酸加入50ml注射用水，搅拌溶解，得溶液a；b)将白蛋白、肉苁蓉苷、甘油、碱性成纤维细胞生长因子加入到10ml注射用水中，搅拌均匀，得溶液b；c)将溶液b缓慢加入溶液a中，边加入边搅拌，混合均匀后，边搅拌边加入磷酸氢二钠和磷酸氢二钾，之后搅拌30min，注射用水定容至100ml，即得保存液；
34.优选的，所述复方氨基酸由以下质量分数的原料组成：甘氨酸5％、精氨酸5％、亮氨酸15％、异亮氨酸25％、苏氨酸30％和甲硫氨酸20％组成。
35.优选的，所述维生素选自维生素b、维生素c、维生素e和维生素k中的一种或多种。
36.优选的，所述(s1)的培养基中还含有海藻糖和蔗糖，海藻糖和蔗糖质量比为3：1；
37.优选的，所述步骤(s1)中的血小板源生长因子在培养基中的终浓度为5-10ng/ml。
38.优选的，所述步骤(s1)中，从感染慢病毒载体前的第3-5天起，用含血小板源生长因子的培养基预培养c17.2神经干细胞。
39.优选的，所述步骤(s2)中，将经过步骤(s1)预培养的c17.2神经干细胞于24孔板铺板的浓度为1
×
104-5
×
104个/孔。
40.优选的，所述步骤(s3)中的聚二烯丙基二甲基氯化铵在培养基中的终浓度为3-5μg/ml。
41.优选的，所述步骤(s3)中，向c17.2神经干细胞的培养基中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵，并继续培养2个小时。
42.该种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，保存液成分稳定、营养物质多元、溶液渗透体系缓冲力强，并且无毒环保、成分明确、安全稳定，便于细胞保存和运输；同时还能提高细胞的保存时间和保存率，能维持细胞的高活力和生物学特性，具有廉价、高效、无毒的
优势。
43.实施例二
44.本实施例是在实施例一的基础上，
45.一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，所述神经干细胞制备方法如下：
46.s1.预培养：从感染慢病毒载体前的第2-5天起，用含血小板源生长因子的培养基预培养c17.2神经干细胞，同时制备神经干细胞保存液；
47.s2.铺板：将经过步骤(s1)预培养的c17.2神经干细胞于24孔板铺板，过夜培养；
48.s3.预处理：向c17.2神经干细胞的培养基中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵，并继续培养2-3个小时；
49.s4.用携带外源bfgf的慢病毒载体感染经步骤(s3)预处理的c17.2神经干细胞，37℃培养箱孵育6小时，吸弃培养基更换新的培养基继续培养；
50.s5.将培养的神经干细胞放置在保存液中进行保存。
51.在进行脊髓损伤的实验过程中：培养的神经干细胞放置在保存液中进行保存，然后通过脊髓损伤模型制作，按照tator脊髓损伤制作法，将大鼠椎管打开夹击并缝合护理，制作脊髓损伤动物模型，术后动物置于一斜板让其静止，记下斜板与水平面夹角度数，手术动物置于一开口圆盆，让动物爬行于其中，观察动物的运动及其协调情况并打分，保存液中的神经干细胞，经孵育、清洗，并于冰中待移植，保存液中的神经干细胞移植大鼠损伤的脊髓并缝合肌肉、皮肤和护理，过度麻醉动物并作心脏灌注，取出损伤的脊髓经固定行冷冻水平切片，黏贴于经铬矾明胶包被的玻片备用，脊髓损伤面积观察，使用免疫酶染色法，将做好的组织片经gfap单抗染色显示脊髓损伤空洞面积，神经干细胞在体内的存活观察，用免疫组织荧光染色法，把经细胞核染料标记的脊髓标本行神经干细胞标记分子染色，观察移植细胞的存活，神经干细胞在体内的迁移，细胞核染料标记的干细胞在移植大鼠损伤的脊髓4周后的迁移情况，记录整理
52.优选的，所述(s1)中每100ml保存液由以下组分组成：白蛋白1-5g、维生素1.0-1.5g、葡萄糖0.2-0.4g、氯化钠0.5-0.8g、氯化钾0.025-0.030g、肉苁蓉苷0.03-0.06g、甘油1.5-2.0g、碱性成纤维细胞生长因子0.03-0.06g、磷酸氢二钠0.15-0.17g、磷酸氢二钾0.04-0.05g、硫酸软骨素0.1-0.15g、复方氨基酸0.10-0.15g，其余为注射用水。
53.具体的，将维生素、葡萄糖、氯化钠、氯化钾、硫酸软骨素、复方氨基酸加入50ml注射用水，搅拌溶解，得溶液a；b)将白蛋白、肉苁蓉苷、甘油、碱性成纤维细胞生长因子加入到10ml注射用水中，搅拌均匀，得溶液b；c)将溶液b缓慢加入溶液a中，边加入边搅拌，混合均匀后，边搅拌边加入磷酸氢二钠和磷酸氢二钾，之后搅拌30min，注射用水定容至100ml，即得保存液；
54.优选的，所述复方氨基酸由以下质量分数的原料组成：甘氨酸5％、精氨酸5％、亮氨酸15％、异亮氨酸25％、苏氨酸30％和甲硫氨酸20％组成。
55.优选的，所述维生素选自维生素b、维生素c、维生素e和维生素k中的一种或多种。
56.优选的，所述(s1)的培养基中还含有海藻糖和蔗糖，海藻糖和蔗糖质量比为3：1；
57.优选的，所述步骤(s1)中的血小板源生长因子在培养基中的终浓度为5-10ng/ml。
58.优选的，所述步骤(s1)中，从感染慢病毒载体前的第3-5天起，用含血小板源生长因子的培养基预培养c17.2神经干细胞。
59.优选的，所述步骤(s2)中，将经过步骤(s1)预培养的c17.2神经干细胞于24孔板铺板的浓度为1
×
104-5
×
104个/孔。
60.优选的，所述步骤(s3)中的聚二烯丙基二甲基氯化铵在培养基中的终浓度为3-5μg/ml。
61.优选的，所述步骤(s3)中，向c17.2神经干细胞的培养基中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵，并继续培养2个小时。
62.该种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法可以使c17.2神经干细胞更容易被携带外源bfgf的慢病毒载体感染，还可以改善插入bfgf的c17.2神经干细胞生长状况和bfgf的表达量。
63.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
64.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，其特征在于：所述神经干细胞制备方法包括如下步骤：s1.预培养：从感染慢病毒载体前的第2-5天起，用含血小板源生长因子的培养基预培养c17.2神经干细胞，同时制备神经干细胞保存液；s2.铺板：将经过步骤(s1)预培养的c17.2神经干细胞于24孔板铺板，过夜培养；s3.预处理：向c17.2神经干细胞的培养基中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵，并继续培养2-3个小时；s4.用携带外源bfgf的慢病毒载体感染经步骤(s3)预处理的c17.2神经干细胞，37℃培养箱孵育6小时，吸弃培养基更换新的培养基继续培养；s5.将培养的神经干细胞放置在保存液中进行保存。2.根据权利要求1所述的一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，其特征在于：所述(s1)中每100ml保存液由以下组分组成：白蛋白1-5g、维生素1.0-1.5g、葡萄糖0.2-0.4g、氯化钠0.5-0.8g、氯化钾0.025-0.030g、肉苁蓉苷0.03-0.06g、甘油1.5-2.0g、碱性成纤维细胞生长因子0.03-0.06g、磷酸氢二钠0.15-0.17g、磷酸氢二钾0.04-0.05g、硫酸软骨素0.1-0.15g、复方氨基酸0.10-0.15g，其余为注射用水。3.根据权利要求1所述的一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，其特征在于：所述复方氨基酸由以下质量分数的原料组成：甘氨酸5％、精氨酸5％、亮氨酸15％、异亮氨酸25％、苏氨酸30％和甲硫氨酸20％组成。4.根据权利要求1所述的一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，其特征在于：所述维生素选自维生素b、维生素c、维生素e和维生素k中的一种或多种。5.根据权利要求1所述的一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，其特征在于：所述(s1)的培养基中还含有海藻糖和蔗糖，海藻糖和蔗糖质量比为3：1。6.根据权利要求1所述的一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，其特征在于：所述步骤(s1)中的血小板源生长因子在培养基中的终浓度为5-10ng/ml。7.根据权利要求1所述的一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，其特征在于：所述步骤(s1)中，从感染慢病毒载体前的第3-5天起，用含血小板源生长因子的培养基预培养c17.2神经干细胞。8.根据权利要求1所述的一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，其特征在于：所述步骤(s2)中，将经过步骤(s1)预培养的c17.2神经干细胞于24孔板铺板的浓度为1
×
104-5
×
104个/孔。9.根据权利要求1所述的一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，其特征在于：所述步骤(s3)中的聚二烯丙基二甲基氯化铵在培养基中的终浓度为3-5μg/ml。10.根据权利要求1所述的一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，其特征在于：所述步骤(s3)中，向c17.2神经干细胞的培养基中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵，并继续培养2个小时。

技术总结
本发明公开了一种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，涉及生物医药技术领域，所述神经干细胞制备方法包括如下步骤：预培养：从感染慢病毒载体前的第2-5天起，用含血小板源生长因子的培养基预培养C17.2神经干细胞，同时制备神经干细胞保存液；将经过预培养的C17.2神经干细胞于24孔板铺板，过夜培养，向C17.2神经干细胞的培养基中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵，并继续培养2-3个小时；用携带外源bFGF的慢病毒载体感染经预处理的C17.2神经干细胞，37℃培养箱孵育6小时，吸弃培养基更换新的培养基继续培养；将培养的神经干细胞放置在保存液中进行保存。该种治疗脊髓损伤的神经干细胞制备方法，保存液成分稳定、营养物质多元、溶液渗透体系缓冲力强。渗透体系缓冲力强。渗透体系缓冲力强。


技术研发人员：王韵扬 胡锐 曹昕 陈晗 黄宥芸 叶舒玥
受保护的技术使用者：温州医科大学
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/8/6