一种可同时检测多衣原体的多重PCR检测引物组合物及方法

一种可同时检测多衣原体的多重pcr检测引物组合物及方法
【技术领域】
1.本发明涉及防疫检测技术领域，尤其涉及一种可同时检测多衣原体的多重pcr检测引物组合物及方法。


背景技术：

2.随着国内城市化进程的加快和生活水平的提高，宠物的饲养数量迅速增加，特别是犬、猫、鸟等。因此，与宠物的密切接触是人类可能感染衣原体的一个重要原因。动物衣原体病是由各类衣原体感染哺乳动物、禽类、节肢昆虫所发生的一类十分重要的人兽共患传染病。现有研究表明：宠物犬、猫和鸟以及人类均能感染鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体，犬主要感染鹦鹉热衣原体，也能感染猫衣原体，犬感染衣原体发病症状主要表现为结膜炎、角膜炎、脑炎和肺炎等；猫主要感染猫衣原体，也能感染鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体，衣原体能通过空气或受感染猫的眼鼻分泌物传播，主要感染症状为肺炎、结膜炎和鼻炎，导致怀孕猫可能发生流产；宠物鸟特别是鹦鹉类鸟主要感染鹦鹉热衣原体，且可以通过吸入或密切接触导致人类患上鹦鹉热病。因此，人类在于宠物接触的过程中能够感染三种衣原体，从而引起结膜炎、呼吸道疾病、肺炎、肾小球炎、心内膜炎及肝脾肿大等症状，其中鹦鹉热衣原体肺炎临床表现多变，早期诊断困难，病情发展迅速，若不及时明确诊断并使用敏感抗菌药物，患者可能短时间内呼吸衰竭甚至死亡。
3.然而，由于衣原体病感染动物种类繁多，表现形式多样，且相当部分是人畜共患疾病，对衣原体病的高效检测就显得难度较大。传统的衣原体检测方法有直接染色镜检法、培养分离法、免疫荧光及补体结合试验等。近年来分子生物学方法越来越多地用于衣原体的检测，该方法灵敏度高，特异性好，主要包括核酸探针技术和pcr(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)扩增技术。
4.病原体的pcr检测需要设计合成相应的特异性引物和适合每对引物的pcr扩增条件，近年来，兽医临床上发现的多种病原体的混合感染促进了单管同步检测多种病原体的检测方法的发展。多重pcr又称多重引物pcr或复合pcr，它是在同一pcr反应体系中加入两对及以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的pcr反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般pcr相同。与普通pcr相比，多重pcr具有特异性强、灵敏度高、检测时间短，成本低等优点，而且能够同时检测多种病原，利于对疾病作出快速、准确的诊断。鉴别不同病原的多重pcr体系需要针对不同的病原体设计各自特异且种内保守的核酸引物，由于引物间相互作用的复杂性，因而多重pcr的扩增体系需要各方面的优化调整。总而言之，多重pcr方法的复杂性与引物对数成正比，因此，如何设计引物对和pcr扩增条件成为了保证多衣原体检测精度的关键。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种可同时检测多衣原体的多重pcr检测引物组合物及方法，旨在克服传统病原分离及常规血清学诊断方法耗时耗力、敏感性不高及特异性差等缺
点，可为今后开展疫情临床诊断和研究提供理论依据，也可为控制和消灭相关疫情奠定基础。。
6.为了实现上述目的，本发明提供一种可同时检测多衣原体的多重pcr检测方法，包括：
7.步骤s1：分别提取并制备鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的dna样品；
8.步骤s2：根据所述dna样品对鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的基因进行同源性分析，设计与筛选每种衣原体的特异性引物，确保每对引物只能扩增出相应病原的序列片段，且引物之间互不干扰，不存在同源与互补；其中，所述特异性引物的序列如下：
9.鹦鹉热衣原体ompa基因的上下游引物分别为：
10.cps f:5
’‑
atctctaccgatcttccaatgc-3’(seq id no:1)；
11.cps r:5
’‑
tgttgttccagccgttatagg-3’(seq id no:2),片段282bp；
12.猫衣原体ompa基因的上下游引物分别为：
13.cfe f:5
’‑
ccttgtcggattgattggtctt-3’(seq id no:3)；
14.cfe r:5
’‑
gttgagcaatgcggatagtgt-3’(seq id no:4),片段455bp；
15.肺炎衣原体ompa基因的上下游引物分别为：
16.cpn f:5
’‑
actgccgtagatagacctaacc-3’(seq id no:5)；
17.cpn r:5
’‑
aacgagattgaacgctgtagag-3’(seq id no:6),片段171bp；
18.步骤s3：对所述特异性引物进行预设的pcr反应条件优化，以建立多重pcr反应体系。
19.在一个优选实施方式中，所述步骤s3包括：
20.选择20μl的pcr反应体系，该体系包含dna混合模板2μl，上下游引物的浓度为10μmol/l，highaffinity hotstart taqmix 3.8μl，ddh2o补平至20μl；
21.根据多重条带的明暗度，相应的调整3对引物的比例；
22.退火温度根据引物的tm值范围
±
5℃进行设置，利用梯度pcr仪将退火温度设定为50.0℃-60.0℃，同时在控制单一变量的情况下对循环次数进行优化，循环次数分别设置为30、35、40，最终确定最佳多重pcr反应体系及反应程序。
23.在一个优选实施方式中，所述步骤s3中，多重pcr反应条件为：在一个循环内，依次在95℃温度条件下维持5min，94℃温度条件下维持15s，55.6℃温度条件下维持20s，72℃温度条件下维持30s；在完成35个循环后，在72℃温度条件下维持1min。
24.在一个优选实施方式中，所述步骤s3之后还包括步骤s4，
25.步骤s4：对所述多重pcr反应体系进行多重pcr扩增特异性验证。
26.在一个优选实施方式中，所述步骤s4包括：
27.同时用3对特异性引物，分别以沙眼衣原体、猪衣原体、流产衣原体、鼠衣原体、豚鼠衣原体、家畜衣原体为模板，同时以ddh2o为阴性对照，按照已经优化好的反应条件和所述多重pcr反应体系体系进行pcr反应，以验证其特异性。
28.在一个优选实施方式中，所述步骤s3之后还包括步骤s5：
29.步骤s5：对所述多重pcr反应体系进行多重pcr扩增敏感性验证。
30.在一个优选实施方式中，所述步骤s5包括：
31.先将鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的dna样品用超微量核酸蛋测定仪测
定原模板浓度，再以10倍连续梯度稀释分别将鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的模板稀释成预设数量的浓度梯度，按照优化好的pcr反应条件进行扩增，以测定多重pcr的敏感性。
32.在一个优选实施方式中，所述步骤s3之后还包括步骤s6：
33.步骤s6：对所述多重pcr反应体系进行多重pcr扩增重复性验证。
34.在一个优选实施方式中，所述步骤s6包括：
35.以所述步骤s3的多重pcr方法对鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体重复检测6次，以验证结果的稳定性。
36.本发明还提供了一种可同时检测多衣原体的多重pcr检测引物组合物，包括鹦鹉热衣原体ompa基因的上下游引物、猫衣原体ompa基因的上下游引物及肺炎衣原体ompa基因的上下游引物；其中，
37.鹦鹉热衣原体ompa基因的上下游引物的序列分别为：
38.cps f:5
’‑
atctctaccgatcttccaatgc-3’(seq id no:1)；
39.cps r:5
’‑
tgttgttccagccgttatagg-3’(seq id no:2),片段282bp；
40.猫衣原体ompa基因的上下游引物的序列分别为：
41.cfe f:5
’‑
ccttgtcggattgattggtctt-3’(seq id no:3)；
42.cfe r:5
’‑
gttgagcaatgcggatagtgt-3’(seq id no:4),片段455bp；
43.肺炎衣原体ompa基因的上下游引物的序列分别为：
44.cpn f:5
’‑
actgccgtagatagacctaacc-3’(seq id no:5)；
45.cpn r:5
’‑
aacgagattgaacgctgtagag-3’(seq id no:6),片段171bp。
46.本发明提供的可同时检测多衣原体的多重pcr检测引物组合物及方法，设计的3对引物，tm值相近，保证了在相同退火温度下，鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体都能得到很好的扩增，实验的操作过程简单只需要加入taqmix、上下游引物和dna模板即可，结果观察简单，操作简便。若出现171bp大小条带，则检测样品中含有肺炎衣原体；若出现282bp大小条带，则检测样品中含有鹦鹉热衣原体；若出现455bp大小条带，则检测样品中含有猫衣原体；若同时出现几条带，则检测样品中同时含相应的几种病原，即表现为病原的混合感染，从而能够一次性检查出多种病原混合感染的情况，降低漏诊几率。同时，多重pcr均能特异性扩增出鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体条带，与普通pcr检测方法相比，本发明采用的多重pcr灵敏度和准确性与单项pcr结果一样；并且与单项pcr及免疫学检测方法相比，多重pcr花费小、特异性强且反应快速、检测时间短。
【附图说明】
47.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
48.图1为不同退火温度进行多重pcr反应的示意图；
49.图2为多重pcr的特异性试验结果的示意图；
50.图3为多重pcr的敏感性试验结果的示意图；
51.图4为多重pcr的稳定性试验结果的示意图。
【具体实施方式】
52.为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合附图和具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。
53.还应当理解，在此本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。
54.还应当进一步理解，在本发明说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。
55.实施例一
56.在本发明的实施例中，提供一种可同时检测多衣原体的多重pcr检测方法，用于同步进行衣原体(属)的鉴定和单管分型检测鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体三种动物衣原体的多重pcr技术。在本发明的示例性说明中，主要是针对鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体，但不局限于上述病原体，对于其他类似待检测病原体也可采用相似的引物设计与反应条件优化，因此，基于该相似的引物设计与反应条件优化的其他类似待检测病原体的检测方法也在本发明的保护范围内。
57.在本实施例中，可同时检测多衣原体的多重pcr检测方法包括步骤s1-s3。
58.步骤s1：分别提取并制备鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的dna样品。
59.具体的，本步骤依次进行以下操作：取菌液1ml-5ml，10000rpm离心1min，吸净上清；向沉淀中加入200μl缓冲液ga(用于悬浮细胞)，振荡至菌体彻底悬浮；向管中加入20μl proteinase k(蛋白酶k)溶液，混匀；加入200μl缓冲液gb(用于裂解以使核酸和蛋白分离)，振荡15s，70℃放置10min，溶液变清亮后短暂离心去除管内壁的水珠；加入220μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，将所得溶液和絮状沉淀都加入差一个吸附柱cb3中，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(用于去蛋白杂质)，12000rpm离心30s，倒掉废液，吸附柱cb3放入收集管中(重复此步骤1次)；将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱cb3置于室温放置数分钟；将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl-200μl洗脱缓冲液te(用于溶解dna)，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，得到dna样品，维持-20℃温度条件下保存备用。
60.步骤s2：根据dna样品对鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的基因进行同源性分析，设计与筛选每种衣原体的特异性引物，确保每对引物只能扩增出相应病原的序列片段，且引物之间互不干扰，不存在同源与互补。
61.具体的，可根据gene bank中登录的鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的参考基因序列，采用mega11软件对鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体参考基因序列进行同源性分析，依据分析结果，应用primer premier5.0软件针对各自保守区设计3对引物，并通过ncbi blast对其特异性进行鉴定，筛选确定最终所用引物，确保所设计的引物能够扩增出相对应的目标产物，且多对引物之间未出现任何交叉反应。需要说明的是，上述软件及应
用工具只是为了说明本步骤实施方式的示例性说明，本领域技术人员还可使用其他方式来获得参考基因序列及其后续的分析、鉴定，并不局限于采用上述软件及应用工具。
62.其中，所述特异性引物的序列如下：
63.鹦鹉热衣原体ompa基因的上下游引物分别为：
64.cps f:5
’‑
atctctaccgatcttccaatgc-3’(seq id no:1)；
65.cps r:5
’‑
tgttgttccagccgttatagg-3’(seq id no:2),片段282bp；
66.猫衣原体ompa基因的上下游引物分别为：
67.cfe f:5
’‑
ccttgtcggattgattggtctt-3’(seq id no:3)；
68.cfe r:5
’‑
gttgagcaatgcggatagtgt-3’(seq id no:4),片段455bp；
69.肺炎衣原体ompa基因的上下游引物分别为：
70.cpn f:5
’‑
actgccgtagatagacctaacc-3’(seq id no:5)；
71.cpn r:5
’‑
aacgagattgaacgctgtagag-3’(seq id no:6),片段171bp。
72.表1：pcr特异性引物
[0073][0074]
步骤s3：对所述特异性引物进行预设的pcr反应条件优化，以建立多重pcr反应体系。
[0075]
具体的，步骤s3包括：
[0076]
选择20μl的pcr反应体系，该体系包含dna混合模板2μl，上下游引物的浓度为10μmol/l，highaffinity hotstart taqmix 3.8μl，ddh2o补平至20μl。多重pcr反应条件为：在一个循环内，依次在95℃温度条件下维持5min，94℃温度条件下维持15s，55.6℃温度条件下维持20s，72℃温度条件下维持30s；在完成35个循环后，在72℃温度条件下维持1min。
[0077]
其中，根据多重条带的明暗度，相应的适当调整3对引物的比例。退火温度根据引物的tm值范围
±
5℃进行设置，利用梯度pcr仪将退火温度设定为50.0℃-60.0℃，同时在控制单一变量的情况下对循环次数进行优化，循环次数分别设置为30、35、40，最终确定最佳多重pcr反应体系及反应程序。
[0078]
如图1所示，为本发明的不同退火温度进行多重pcr反应的示意图，其中，m：marker dl2000；标号1-10对应的退火温度分别为：50.0℃、51.2℃、52.1℃、53,2℃、54.4℃、55.6℃、56.8℃、57.9℃、58.8℃、59.9℃。
[0079]
一些实施例中，步骤s3之后还包括步骤s4：对多重pcr反应体系进行多重pcr扩增特异性验证。
[0080]
具体的，同时用3对特异性引物，分别以沙眼衣原体、猪衣原体、流产衣原体、鼠衣原体、豚鼠衣原体、家畜衣原体为模板，同时以ddh2o为阴性对照，按照已经优化好的反应条件和所述多重pcr反应体系体系进行pcr反应，以验证其特异性。
[0081]
如图2所示，为本发明中多重pcr的特异性试验结果的示意图，其中，m：marker dl2000；标号1：鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和猫衣原体多重pcr产物；标号2：鹦鹉热衣原体产物；标号3：肺炎衣原体产物；标号4：猫衣原体产物；标号6-10：流产衣原体、家畜衣原体、沙眼衣原体、猪衣原体、鼠衣原体和豚鼠衣原体模板pcr产物；标号11：阴性对照。
[0082]
其中，分别以沙眼衣原体、猪衣原体、流产衣原体、鼠衣原体、豚鼠衣原体、家畜衣原体为模板，同时以ddh2o为阴性对照，按照已经优化好的反应条件和体系在相同条件下进行pcr反应，多重pcr扩增后，产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可见鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体分别扩增出282bp，455bp，171bp的条带，与预期的条带相符，3对引物对双蒸水、沙眼衣原体、猪衣原体、流产衣原体、鼠衣原体、豚鼠衣原体、家畜衣原体均未出现任何扩增条带，结果显示与预期结果相一致，可见，多重pcr的特异性试验证实了这3对引物具有很强的特异性。
[0083]
一些实施例中，步骤s3之后还包括步骤s5：对多重pcr反应体系进行多重pcr扩增敏感性验证。
[0084]
具体的，先将鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的dna样品用超微量核酸蛋测定仪测定原模板浓度，再以10倍连续梯度稀释分别将鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的模板稀释成预设数量的浓度梯度，按照优化好的pcr反应条件进行扩增，以测定多重pcr的敏感性。
[0085]
如图3所示，为本发明的多重pcr敏感性试验结果的示意图，其中，m：marker dl2000；标号1：10-1
稀释；标号2:10-2
稀释；标号3:10-3
稀释；标号4:10-4
稀释；标号5:10-5
稀释；标号6:10-6
稀释；标号7:10-8
稀释；标号9：10-9
稀释；标号10：阴性对照。
[0086]
其中，首先利用超微量核酸蛋白测定仪测定鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体原始dna模板浓度，将dna模板按照10-1-10-9倍连续稀释成9个浓度梯度，按以上pcr反应体系与条件进行pcr扩增，结果显示，该mpcr鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的最低核酸浓度检测量分别为：即最低核酸检测分别为0.12fg、0.42fg和0.56fg，多重pcr敏感性试验验证了这3对引物对模板浓度的敏感性较高。
[0087]
一些实施例中，步骤s3之后还包括步骤s6：对多重pcr反应体系进行多重pcr扩增重复性验证。
[0088]
具体的，以步骤s3的多重pcr方法对鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体重复检测6次，以验证结果的稳定性。
[0089]
如图4所示，为本发明中多重pcr的稳定性试验结果的示意图，其中，m：marker dl2000；标号1-6：鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和猫衣原体多重pcr产物；标号7：阴性对照。
[0090]
其中，以建立的多重pcr方法对鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体重复扩增6次，扩增结果均一致，表明建立的多重pcr方法具有较好的稳定性。
[0091]
实施例二
[0092]
本发明还提供了一种可同时检测多衣原体的多重pcr检测引物组合物，包括鹦鹉热衣原体ompa基因的上下游引物、猫衣原体ompa基因的上下游引物及肺炎衣原体ompa基因的上下游引物；其中，
[0093]
鹦鹉热衣原体ompa基因的上下游引物的序列分别为：
[0094]
cps f:5
’‑
atctctaccgatcttccaatgc-3’(seq id no:1)；
[0095]
cps r:5
’‑
tgttgttccagccgttatagg-3’(seq id no:2),片段282bp；
[0096]
猫衣原体ompa基因的上下游引物的序列分别为：
[0097]
cfe f:5
’‑
ccttgtcggattgattggtctt-3’(seq id no:3)；
[0098]
cfe r:5
’‑
gttgagcaatgcggatagtgt-3’(seq id no:4),片段455bp；
[0099]
肺炎衣原体ompa基因的上下游引物的序列分别为：
[0100]
cpn f:5
’‑
actgccgtagatagacctaacc-3’(seq id no:5)；
[0101]
cpn r:5
’‑
aacgagattgaacgctgtagag-3’(seq id no:6),片段171bp。
[0102]
其中，引物组合物分别根据鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的ompa基因设计并且合成，并对设计的引物进行pcr反应条件的优化，确立最佳多重pcr反应条件进行试验，对该方法的特异性、敏感性及稳定性进行验证。本发明不仅保留了单项pcr的高度特异性、敏感性，又减少了操作步骤，实现了一次扩增可同时检测三种衣原体的目的，大大减少了检测时间和检测成本。
[0103]
综上所述，本发明提供的可同时检测多衣原体的多重pcr检测引物组合物及方法，设计的3对引物，tm值相近，保证了在相同退火温度下，鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体都能得到很好的扩增，实验的操作过程简单只需要加入taq mix、上下游引物和dna模板即可，结果观察简单，操作简便。若出现171bp大小条带，则检测样品中含有肺炎衣原体；若出现282bp大小条带，则检测样品中含有鹦鹉热衣原体；若出现455bp大小条带，则检测样品中含有猫衣原体；若同时出现几条带，则检测样品中同时含相应的几种病原，即表现为病原的混合感染，从而能够一次性检查出多种病原混合感染的情况，降低漏诊几率。同时，多重pcr均能特异性扩增出鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体条带，与普通pcr检测方法相比，本发明采用的多重pcr灵敏度和准确性与单项pcr结果一样；并且与单项pcr及免疫学检测方法相比，多重pcr花费小、特异性强且反应快速、检测时间短。
[0104]
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和修改，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的设备和这里示出与描述的图示示例。

技术特征：
1.一种可同时检测多衣原体的多重pcr检测方法，其特征在于，包括：步骤s1：分别提取并制备鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的dna样品；步骤s2：根据所述dna样品对鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的基因进行同源性分析，设计与筛选每种衣原体的特异性引物，确保每对引物只能扩增出相应病原的序列片段，且引物之间互不干扰，不存在同源与互补；其中，所述特异性引物的序列如下：鹦鹉热衣原体ompa基因的上下游引物分别为：cpsf:5
’‑
atctctaccgatcttccaatgc-3’(seq id no:1)；cpsr:5
’‑
tgttgttccagccgttatagg-3’(seq id no:2),片段282bp；猫衣原体ompa基因的上下游引物分别为：cfef:5
’‑
ccttgtcggattgattggtctt-3’(seq id no:3)；cfer:5
’‑
gttgagcaatgcggatagtgt-3’(seq id no:4),片段455bp；肺炎衣原体ompa基因的上下游引物分别为：cpnf:5
’‑
actgccgtagatagacctaacc-3’(seq id no:5)；cpnr:5
’‑
aacgagattgaacgctgtagag-3’(seq id no:6),片段171bp；步骤s3：对所述特异性引物进行预设的pcr反应条件优化，以建立多重pcr反应体系。2.如权利要求1所述的可同时检测多衣原体的多重pcr检测方法，其特征在于，所述步骤s3包括：选择20μl的pcr反应体系，该体系包含dna混合模板2μl，上下游引物的浓度为10μmol/l，highaffinityhotstarttaqmix3.8μl，ddh2o补平至20μl；根据多重条带的明暗度，相应的调整3对引物的比例；退火温度根据引物的tm值范围
±
5℃进行设置，利用梯度pcr仪将退火温度设定为50.0℃-60.0℃，同时在控制单一变量的情况下对循环次数进行优化，循环次数分别设置为30、35、40，最终确定最佳多重pcr反应体系及反应程序。3.如权利要求2所述的可同时检测多衣原体的多重pcr检测方法，其特征在于，所述步骤s3中，多重pcr反应条件为：在一个循环内，依次在95℃温度条件下维持5min，94℃温度条件下维持15s，55.6℃温度条件下维持20s，72℃温度条件下维持30s；在完成35个循环后，在72℃温度条件下维持1min。4.如权利要求1所述的可同时检测多衣原体的多重pcr检测方法，其特征在于，所述步骤s3之后还包括步骤s4，步骤s4：对所述多重pcr反应体系进行多重pcr扩增特异性验证。5.如权利要求4所述的可同时检测多衣原体的多重pcr检测方法，其特征在于，所述步骤s4包括：同时用3对特异性引物，分别以沙眼衣原体、猪衣原体、流产衣原体、鼠衣原体、豚鼠衣原体、家畜衣原体为模板，同时以ddh2o为阴性对照，按照已经优化好的反应条件和所述多重pcr反应体系进行pcr反应，以验证其特异性。6.如权利要求1所述的可同时检测多衣原体的多重pcr检测方法，其特征在于，所述步骤s3之后还包括步骤s5：步骤s5：对所述多重pcr反应体系进行多重pcr扩增敏感性验证。7.如权利要求6所述的可同时检测多衣原体的多重pcr检测方法，其特征在于，所述步
骤s5包括：先将鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的dna样品用超微量核酸蛋测定仪测定原模板浓度，再以10倍连续梯度稀释分别将鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的模板稀释成预设数量的浓度梯度，按照优化好的pcr反应条件进行扩增，以测定多重pcr的敏感性。8.如权利要求1所述的可同时检测多衣原体的多重pcr检测方法，其特征在于，所述步骤s3之后还包括步骤s6：步骤s6：对所述多重pcr反应体系进行多重pcr扩增重复性验证。9.如权利要求8所述的可同时检测多衣原体的多重pcr检测方法，其特征在于，所述步骤s6包括：以所述步骤s3的多重pcr方法对鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体重复检测6次，以验证结果的稳定性。10.一种可同时检测多衣原体的多重pcr检测引物组合物，其特征在于，包括鹦鹉热衣原体ompa基因的上下游引物、猫衣原体ompa基因的上下游引物及肺炎衣原体ompa基因的上下游引物；其中，鹦鹉热衣原体ompa基因的上下游引物的序列分别为：cpsf:5
’‑
atctctaccgatcttccaatgc-3’(seq id no:1)；cpsr:5
’‑
tgttgttccagccgttatagg-3’(seq id no:2),片段282bp；猫衣原体ompa基因的上下游引物的序列分别为：cfef:5
’‑
ccttgtcggattgattggtctt-3’(seq id no:3)；cfer:5
’‑
gttgagcaatgcggatagtgt-3’(seq id no:4),片段455bp；肺炎衣原体ompa基因的上下游引物的序列分别为：cpnf:5
’‑
actgccgtagatagacctaacc-3’(seq id no:5)；cpnr:5
’‑
aacgagattgaacgctgtagag-3’(seq id no:6),片段171bp。

技术总结
本发明公开一种可同时检测多衣原体的多重PCR检测引物组合物及方法，包括：分别提取并制备鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的DNA样品；根据DNA样品对鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体的基因进行同源性分析，设计与筛选每种衣原体的特异性引物，确保每对引物只能扩增出相应病原的序列片段；对特异性引物进行预设的PCR反应条件优化，以建立多重PCR反应体系。设计的3对引物，Tm值相近，保证了在相同退火温度下，鹦鹉热衣原体、猫衣原体和肺炎衣原体都能得到很好的扩增，实验的操作过程简单只需要加入Taq mix、上下游引物和DNA模板即可，结果观察简单，操作简便，能够一次性检查出多种病原混合感染的情况，降低漏诊几率。降低漏诊几率。降低漏诊几率。


技术研发人员：吴海冲 郑永慧 黄翠琴 郑智杰 梁孝本
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/8/6