一种口服递送罗伊式乳杆菌微胶囊及其制备和应用

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及口服递送罗伊式乳杆菌微胶囊及其制备和应用。


背景技术：

2.人体肠道内存在大量的微生物，正常情况下，肠道内的不同菌群共同维持着肠道内微生态系统的平衡，提供人体所需营养，抵抗病原体入侵和调节肠道黏膜细胞的增殖，参与消化、分解代谢药物和毒物、以及免疫调节等功能。肠道微生物群是肠道微生态系统的主体部分，其中含量最多的是肠道细菌。肠道细菌主要分为三大类，即有益菌、有害菌和机会致病菌。有益菌主要指益生菌群，可以合成多种维生素和蛋白质，为机体提供营养，还能增强机体的免疫功能。有害菌能够释放毒素诱导基因突变而致癌。机会致病菌指的是在机体缺乏免疫力时，全身播散性感染或者移居到其他部位造成感染的病原体。肠道菌群的平衡在一定程度上决定机体的健康状况，肠道菌群失调会影响肠道内部微环境和肠道细胞功能，比如有益菌数量减少，使得肠道抗氧化性降低，粘膜层损伤加重，一些致病菌会破坏促炎和抗炎细胞因子之间的平衡、对黏膜屏障造成损伤等，有害菌持续增加，会提高癌细胞的增殖能力，进一步促进结直肠癌(colorectal cancer，crc)进展，并限制免疫治疗疗效。肠道微生物的种类和数量直接影响肠道微生态的平衡，关系着结直肠上皮细胞的代谢及功能。调控肠道微生态可通过调节多个信号通路，改变肿瘤微环境，从而起到crc治疗作用。因此，解码肠道菌群和crc之间的机制关联，通过调节肠道菌群来治疗结肠癌至关重要。
3.益生菌的作用包括抑制炎症、调节宿主免疫系统、维持肠上皮屏障、促进致癌物失活及癌组织凋亡，减缓或逆转肠道微生态失调带来的负面影响。近年来，许多学者的研究发现了益生菌在crc患者中的治疗作用，并认为，在临床治疗crc时，可合理使用益生菌，以恢复肠道菌群平衡，降低化疗副作用，达到抑制crc进展的效果。尽管益生菌的相关功效在实验室条件下已得到证实，但有些功效在人体中往往不能完全实现，因为要想获得确切的治疗功效，必须满足两个条件：1)益生菌在被人体摄入时必须保持一定活性；2)必须有足够数量的益生菌定植于肠道中。为了提供它们的健康作用，益生菌必须保持一定的活菌数。这就要求益生菌在产品和宿主中都保持活性和代谢稳定，然而，在贮藏、运输、销售和消费过程中，益生菌受到诸如食品组分(酸、氧、添加剂等)、其它微生物、储存温度、ph、后酸化、h2o2和宿主消化系统(胃酸、胆盐、酶)等的影响，以致活菌数大幅下降，最终定植于肠道中的活菌数低于理论上能够发挥生理作用的最小值。
4.此外，随着现代医疗的不断发展，抗生素的种类越来越多，存在着一些抗生素的滥用情况，有些致病菌开始出现了抗药性，而益生菌、有益菌等基本都被抗生素杀死。其原因之一就是现在益生菌的耐药性较差。目前还没有发现哪种益生菌有着对抗生素的耐受性。也就是说，抗生素在杀害有害菌时，也对有益菌产生了致命的伤害。所以，通过一些方式方法来提高益生菌对抗生素的耐受性十分有必要。
5.微胶囊化技术是一项用途广泛而又发展迅速的新技术，利用微胶囊技术将益生菌
包埋在肠溶性壁材中，理论上来讲，不仅可以增强菌体对不良环境的抵抗性，还能使微胶囊中的益生菌在肠道适宜条件下快速释放出来，显著提高菌体在肠道中的存活率，真正发挥益生菌的健康作用。但是，影响益生菌微胶囊活性的因素有很多，许多理论和实际问题需要更进一步深入探讨并逐步解决，如：在外界不良环境情况下和胃肠道中提高菌的存活率机理较为复杂，理论研究还需进一步深入；开发新型易降解的壁材，需要针对壁材、包埋方式以及包埋方法三者是否对益生菌微胶囊存活率存在协同作用等进行研究。
6.cn104911171a公开了以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法，该方法首先是纯化凹土，其次将凹土与海藻酸钠、明胶混合成复合壁材，接着将已制备好的益生菌菌悬液在一定的条件下与上述复合壁材混合均匀，然后缓慢滴入cacl2中固化成型，最后真空冷冻法干燥，获得益生菌微胶囊，此方法制备得到的益生菌微胶囊包埋物质的活性较低和存活率较低。
7.cn102228235a公开了一种益生菌微胶囊的制备方法及其应用，采用将海藻酸钠溶液与变性淀粉溶液等体积混合，再与益生菌混合，通过喷雾器喷嘴喷入cacl2溶液中，静置固化后生理盐水洗涤过滤，这种方法虽然在一定程度增强了胶囊壁的机械强度，但是所得到的胶囊大小难于控制，很难应用于食品以及药品当中工业生产，而且加入变性淀粉后，微胶囊的ph敏感释放的特性减弱，导致其在进入胃部后，部分微胶囊在胃部的酸性环境下表面无法变得致密，而在肠道的弱酸环境下又无法迅速崩解，释放出包埋的益生菌。
8.临床上，口服给菌被认为是一种无创且安全的方法，能实现自我给药且灵活处理药量，有助于更大的患者依从性。但是，益生菌通过口服的方式在宿主体内发挥其功能面对着很大的挑战，强酸性的胃液、各种消化酶和胆盐会导致大量的益生菌死亡，从而使益生菌在肠道中的应用受到限制。所以，要想实现口服益生菌功能的最大化，就需要设计能够保持细菌自主性和动态功能的递送系统，提高细菌在体内的活力，进而促进细菌递送系统的临床转化。


技术实现要素：

9.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种口服递送罗伊氏乳杆菌(l.r)微胶囊及其制备和应用，所述微胶囊实现l.r功能的最大化，保护l.r免受胃液侵蚀顺利抵达肠道，通过调节肠道菌群来发挥抗肿瘤作用。
10.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
11.本发明的第一方面，在于提供一种罗伊氏乳杆菌(l.r)微胶囊，为l.r@(sa-cs)2微胶囊。
12.本发明的第二方面，在于提供上述l.r@(sa-cs)2微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
13.(1)将光密度为1
×
106～1.2
×
108cfus/ml的益生菌l.r与浓度为1～5mg/ml的海藻酸钠水溶液混合并搅拌，离心分离沉淀、洗涤，用生理盐水重悬得到第一悬液；将第一悬液加入到浓度为1～2mol/l的氯化钙水溶液中搅拌，离心分离沉淀、洗涤，用生理盐水重悬得到第二悬液；将第二悬液加入到浓度为1～2mg/ml的壳聚糖水溶液中搅拌，离心分离沉淀、洗涤，得到中间产物，记为l.r@(sa-cs)；其中，益生菌l.r与海藻酸钠水溶液的第一体积比、第一悬液与氯化钙水溶液的第二体积比、第二悬液与壳聚糖水溶液的第三体积比均为1:
(35～50)；
14.(2)将l.r@(sa-cs)用生理盐水重悬，得到l.r@(sa-cs)悬液；将l.r@(sa-cs)悬液与浓度为1～5mg/ml的无菌海藻酸钠水溶液混合并搅拌，离心分离沉淀、洗涤，用生理盐水重悬得到第三悬液；将第三悬液加入到浓度为1～2mol/l的氯化钙水溶液中搅拌，离心分离沉淀、洗涤，用生理盐水重悬得到第四悬液；将第四悬液加入到浓度为1～2mg/ml的壳聚糖水溶液中搅拌，离心分离沉淀、洗涤，得到产物，记为l.r@(sa-cs)2微胶囊；其中，l.r@(sa-cs)悬液与海藻酸钠水溶液的第四体积比、第三悬液与氯化钙水溶液的第五体积比、第四悬液与壳聚糖水溶液的第六体积比均为1:(35～50)。
15.在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊的制备方法，第一体积比、第二体积比、第三体积比、第四体积比、第五体积比和第六体积比相同。
16.在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
17.(1)将2ml光密度为1
×
108cfus/ml的益生菌l.r与98ml浓度为5mg/ml的海藻酸钠水溶液混合并在室温搅拌20～30min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，用2ml生理盐水重悬；然后，转入98ml浓度为1.1mol/l的氯化钙水溶液中室温搅拌10～15min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，用2ml生理盐水重悬；最后，转入98ml浓度为1mg/ml的壳聚糖水溶液中搅拌20～30min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，得到中间产物，记为l.r@(sa-cs)。
18.(2)将l.r@(sa-cs)用2ml生理盐水重悬，得到2ml l.r@(sa-cs)悬液，将其与98ml浓度为5mg/ml的海藻酸钠水溶液混合并在室温搅拌20～30min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，用2ml生理盐水重悬；然后，转入98ml浓度为1.1mol/l的氯化钙水溶液中室温搅拌10～15min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，用2ml生理盐水重悬；最后，转入98ml浓度为1mg/ml的壳聚糖水溶液中搅拌20～30min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，得到产物，记为l.r@(sa-cs)2微胶囊。
19.本发明的第三方面，在于提供上述l.r@(sa-cs)2微胶囊的应用。
20.在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊在制备调节肠道菌群的口服益生菌制品中的应用。
21.在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊在制备耐胃酸的口服益生菌制品中的应用。
22.在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊在制备耐胆酸的口服益生菌制品中的应用。
23.在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊在制备改善抗生素引起的菌群失调症的口服益生菌制品中的应用。
24.在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊在制备治疗结肠癌的口服制品中的应用。
25.在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊与gpr109a激动剂的联合在制备治疗结肠癌的口服制品中的应用。
26.在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊与mk-6892的联合在制备治疗结肠癌的口服制品中的应用。
27.本发明中，室温是指25-37℃。
28.相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：
29.(1)本发明的l.r@(sa-cs)2微胶囊实现了l.r的缓慢释放而未影响l.r的活力，l.r@(sa-cs)2微胶囊减缓l.r的代谢过程而未影响l.r的代谢功能以及引起肿瘤细胞发生凋亡的功能。
30.(2)口服本发明的l.r@(sa-cs)2微胶囊能够保护l.r免受胃液侵蚀顺利抵达肠道，并通过产生某些代谢产物引起结肠癌细胞的大量凋亡。而且，在抗生素预处理的情况下，l.r@(sa-cs)2微胶囊仍然能进入肠道内代谢产生scfas，使肿瘤部分减小。
31.(3)口服本发明的l.r@(sa-cs)2微胶囊能明显调节肠道菌群，使有害菌减少和产丁酸的有益菌增多，进而通过菌群来发挥治疗结肠癌的作用。而且，相较于对照组，口服本发明的l.r@(sa-cs)2微胶囊和mk-6892的结肠癌小鼠的肿瘤抑制率为93％，肿瘤抑制效果显著，且具有很好的生物相容性。
32.(4)本发明制备过程简单，耗时短，且成本低。
附图说明
33.图1a是本发明所用原料l.r的表面形貌的sem图。
34.图1b是本发明制得的l.r@(sa-cs)2微胶囊的表面形貌的sem图。
35.图2是在不同时间分别对l.r、l.r@(sa-cs)2微胶囊的细菌活力进行alarmarblue检测的结果比较图(n＝5)。
36.图3是分别对l.r、l.r@(sa-cs)2微胶囊进行baclight染色后观察到的荧光图。
37.图4是分别对l.r、l.r@(sa-cs)2微胶囊进行baclight染色的流式细胞结果。
38.图5显示了l.r、l.r@(sa-cs)2微胶囊在人工胃液中不同时间的细菌存活数量(n＝3)。
39.图6显示了l.r、l.r@(sa-cs)2微胶囊在人工肠液中不同时间的细菌存活数量(n＝3)。
40.图7显示了l.r、l.r@(sa-cs)2微胶囊在体外抗生素中不同时间的细菌存活数量(n＝3)。
41.图8显示了l.r、l.r@(sa-cs)2微胶囊在体外胆酸溶液中不同时间的细菌存活数量(n＝3)。
42.图9显示了健康小鼠灌胃l.r、l.r@(sa-cs)2微胶囊经过不同时间后体内胃液中的细菌存活数量(n＝3)。
43.图10显示了健康小鼠灌胃l.r、l.r@(sa-cs)2微胶囊经过不同时间后体内小肠液中的细菌存活数量(n＝3)。
44.图11显示了健康小鼠灌胃l.r、l.r@(sa-cs)2微胶囊经过不同时间后体内盲肠液中的细菌存活数量(n＝3)。
45.图12显示了健康小鼠灌胃l.r、l.r@(sa-cs)2微胶囊经过不同时间后体内结肠液中的细菌存活数量(n＝3)。
46.图13是健康小鼠灌胃saline/l.r/lr@(sa-cs)2后不同时间排出的粪便中活的l.r的定量统计柱状图(n＝3)。
47.图14是结肠癌细胞ct26在l.r、l.r@(sa-cs)2微胶囊中的细胞活性实验结果。
48.图15是结肠癌细胞ct26在l.r、l.r@(sa-cs)2微胶囊中的流式细胞结果。
49.图16是结肠癌细胞ct26在l.r上清液s1、l.r@(sa-cs)2微胶囊上清液s2中的细胞活性实验结果。
50.图17是结肠癌细胞ct26在l.r上清液、l.r@(sa-cs)2微胶囊上清液中的流式细胞结果。
51.图18是l.r上清液s1、l.r@(sa-cs)2微胶囊上清液s2分别与结肠癌细胞ct26孵育后细胞内凋亡相关蛋白的wb条带结果图。
52.图19是l.r上清液s1、l.r@(sa-cs)2微胶囊上清液s2分别与结肠癌细胞ct26孵育后细胞内凋亡相关蛋白半定量分析图。
53.图20是非靶向代谢组学检测l.r代谢产物的差异代谢物的pls-da分析图。
54.图21是非靶向代谢组学检测l.r代谢产物的差异代谢物的lipidmaps注释分类图。
55.图22是非靶向代谢组学检测l.r代谢产物的差异代谢物的热图。
56.图23是结肠癌小鼠灌胃saline/l.r/lr@(sa-cs)2后排出的粪便的16s测序分析肠道菌群的热图。
57.图24是结肠癌小鼠灌胃saline/l.r/lr@(sa-cs)2后排出的粪便的16s测序分析肠道菌群的分组聚类分析图。
58.图25是结肠癌小鼠抗生素清除实验中0d、20d各分组小鼠活体成像图(n＝5)。
59.图26是结肠癌小鼠抗生素清除实验中小鼠安乐死后各分组结肠肿瘤拍照图片(n＝5)。
60.图27是结肠癌小鼠抗生素清除实验中小鼠安乐死后各分组肿瘤重量比较图(n＝5)。
61.图28是结肠癌小鼠抗生素清除实验中各分组小鼠的体重变化图(n＝5)。
62.图29是cck8检测体外丁酸钠对ct26细胞杀伤作用的统计柱状图。
63.图30是在丁酸钠存在下肿瘤细胞凋亡相关蛋白的表达的wb条带图。
64.图31是cck8检测体外mk对ct26细胞杀伤作用的统计柱状图。
65.图32是cck8检测丁酸钠联合mk对细胞杀伤作用的统计柱状图。
66.图33是结肠癌小鼠给药抗肿瘤治疗实验中各组小鼠体重变化图。
67.图34是结肠癌小鼠给药抗肿瘤治疗实验中各组肿瘤组织内凋亡蛋白的表达情况的wb条带图。
68.图35是结肠癌小鼠给药抗肿瘤治疗实验中给药后0d、5d、10d、20d小鼠活体成像图。
69.图36是结肠癌小鼠给药抗肿瘤治疗实验中给药后21d小鼠安乐死后肿瘤拍照图片。
70.图37是结肠癌小鼠给药抗肿瘤治疗实验中给药后21d小鼠安乐死后肿瘤重量比较图。
71.图38是结肠癌小鼠给药抗肿瘤治疗实验中治疗21d后各组小鼠的结肠和肿瘤组织he染色及肿瘤组织ki67染色图片。
72.图39a是健康小鼠灌胃saline/l.r/l.r@(sa-cs)2后血常规wbc检测结果。
73.图39b是健康小鼠灌胃saline/l.r/l.r@(sa-cs)2后血常规rbc检测结果。
74.图39c是健康小鼠灌胃saline/l.r/l.r@(sa-cs)2后血常规plt检测结果。
75.图40a是健康小鼠灌胃saline/l.r/l.r@(sa-cs)2后血生化alt检测结果。
76.图40b是健康小鼠灌胃saline/l.r/l.r@(sa-cs)2后血生化ast检测结果。
77.图40c是健康小鼠灌胃saline/l.r/l.r@(sa-cs)2后血生化cera检测结果。
78.图41a是结肠癌小鼠给药后体内炎症因子tnf-α的变化统计图(n＝3)。
79.图41b是结肠癌小鼠给药后体内炎症因子ifn-γ的变化统计图(n＝3)。
80.图41c是结肠癌小鼠给药后体内炎症因子il-6的变化统计图(n＝3)。
81.图42是结肠癌小鼠给药后主要器官组织病理的染色图片。
82.各图中，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001认为差异有统计学意义，ns表示无明显变化。
具体实施方式
83.下面结合附图和具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
84.下列实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购得的常规产品。例如，以下实验中用到的健康小鼠为健康雄性spf级bal b/c小鼠，购买自上海昇敞生物科技有限公司；小鼠结肠癌细胞ct26由复旦大学癌症中心提供，也可从atcc细胞库获得；mrs液体培养基购自上海海博生物；1640细胞培养基购自gioco；药物mk全称是mk-6892，cas号：917910-45-3，是一种选择性烟酸(na)受体gpr109a激动剂，购自美国mce。罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri，简称l.r)购自北京百欧博伟生物技术有限公司(产品号bio-53258)。
85.一、l.r@(sa-cs)2微胶囊的制备
86.(1)将2ml益生菌l.r(光密度为1
×
108cfus/ml)与98ml浓度为5mg/ml的海藻酸钠(sodium alginate，sa)水溶液混合并在室温搅拌30min，离心分离沉淀、用pbs洗涤(清洗并离心处理)2遍后，用2ml生理盐水重悬；然后，转入98ml浓度为1.1mol/l的氯化钙水溶液中室温搅拌15min，离心分离沉淀、用pbs洗涤(清洗并离心处理)2遍后，用2ml生理盐水重悬；最后，转入98ml浓度为1mg/ml的壳聚糖(chitosan，cs)水溶液中搅拌30min，离心分离沉淀、用pbs洗涤(清洗并离心处理)2遍后，得到中间产物，记为l.r@(sa-cs)。
87.(2)将l.r@(sa-cs)用2ml生理盐水重悬，得到2ml l.r@(sa-cs)，与98ml浓度为5mg/ml的海藻酸钠水溶液混合并在室温搅拌30min，离心分离沉淀、用pbs洗涤(清洗并离心处理)2遍后，用2ml生理盐水重悬；然后，转入98ml浓度为1.1mol/l的氯化钙水溶液中室温搅拌15min，离心分离沉淀、用pbs洗涤(清洗并离心处理)2遍后，用2ml生理盐水重悬；最后，转入98ml浓度为1mg/ml的壳聚糖水溶液中搅拌30min，离心分离沉淀、用pbs洗涤(清洗并离心处理)2遍后，得到产物，记为l.r@(sa-cs)2微胶囊。
88.海藻酸钠水溶液、氯化钙水溶液、壳聚糖水溶液和生理盐水均为无菌溶液。
89.二、l.r@(sa-cs)2微胶囊的结构表征
90.使用生物扫描电镜sem(u8010，hitachi)观察l.r和l.r@(sa-cs)2微胶囊的表面形貌，分别如图1a和图1b所示，可以发现：单独l.r表面光滑，菌落之间分散；l.r@(sa-cs)2微胶囊的细菌表面出现较厚的凝胶层，菌落连接比较致密。
91.采用动态光散射仪dls(nano zs90，莫尔文仪器有限公司)测量了l.r和l.r@(sa-cs)2微胶囊的粒径分别为1217nm和5529nm，很明显，l.r@(sa-cs)2微胶囊的粒径较之单独l.r的粒径有显著的增加。
92.采用动态光散射仪dls(nano zs90，莫尔文仪器有限公司)测量单独原料sa和cs的zeta电位，分别为-49.6mv和24mv，即，sa带负电，cs带正电。同时，采用该动态光散射仪dls测量l.r@(sa-cs)2微胶囊制备过程中各阶段的zeta电位，依次有初始的单独l.r、包裹sa后、中间产物l.r@(sa-cs)、再包裹sa后和l.r@(sa-cs)2微胶囊的zeta电位，分别为：-22.7mv、-42.4mv、30.3mv、-61.3mv、55mv，可以发现：在初始的单独l.r表面包裹1层带负电的sa后，电位由原来的-22.7mv变为-42.4mv，再继续包裹带正电的cs后得到l.r@(sa-cs)，电位变为30.3mv；继续在l.r@(sa-cs)表面包裹1层带负电的sa后，电位变为-61.3mv；再继续包裹带正电的cs后得到l.r@(sa-cs)2微胶囊，电位变为55mv。可见，在l.r@(sa-cs)2微胶囊制备过程中，随着添加材料的不同，测量出来的zeta电位呈现正负交替的现象。
93.由上述结果可知，l.r@(sa-cs)2微胶囊中，l.r成功包裹有多层sa-cs。
94.三、l.r@(sa-cs)2微胶囊的细菌活力实验
95.①
将l.r@(sa-cs)2微胶囊用mrs液体培养基悬浮并调整光密度为1
×
107cfus/ml，取12ml的l.r@(sa-cs)2微胶囊悬浮液在37℃，170rpm摇床孵育活化3h后。然后，分别继续摇床孵育0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h后，各取100μl孵育溶液加入培养孔中，每孔加入10μl的alarmarblue检测液，放入孵箱12h，再用酶标仪检测570nm下的吸光度值。同时，用l.r替代l.r@(sa-cs)2微胶囊作同样的操作进行比较。结果如图2所示。由图2可见，在前8h，l.r@(sa-cs)2微胶囊的细菌活力较之单独的l.r略低；在8h后，两组细菌的活力逐渐趋于一致。这说明，在l.r@(sa-cs)2微胶囊中，l.r是缓慢释放的，而且，随着时间的进行，释放的l.r数目增加，直到24h后l.r的活力能达到单独l.r的正常活力范围值。
96.②
将l.r@(sa-cs)2微胶囊用mrs液体培养基悬浮并调整光密度为1
×
107cfus/ml，取12ml的l.r@(sa-cs)2微胶囊悬浮液在37℃、170rpm摇床孵育12小时后，取200μl孵育溶液，离心分离沉淀、用pbs洗涤(清洗并离心)两次，再用100μl的活/死baclight染色重新悬浮，避光孵育15min。最后，将样品置在载玻片上，用倒置荧光显微镜观察细菌的存活情况或用流式细胞仪进行检测细菌的存活率。同时，用l.r替代l.r@(sa-cs)2微胶囊作同样的操作进行比较。荧光显微镜观察结果如图3所示，syt09绿色荧光代表活菌，pi红色荧光代表死菌。由图3可见，l.r@(sa-cs)2微胶囊与单独的l.r的荧光结果没有明显的差异。流式细胞结果如图4所示。根据图4，l.r@(sa-cs)2微胶囊与l.r中活菌的比例分别是96.8％和97.7％。由上述结果可见，两组中存活的细菌数目无明显差异，这说明l.r@(sa-cs)2微胶囊组与l.r组中均有大量的细菌保持活力。
97.四、l.r@(sa-cs)2微胶囊的体外模拟人工胃肠液实验
98.用1ml人工胃液sgf(ph 1.2，每1l水含有2克氯化钠、3.2克胃蛋白酶和7ml盐酸)将l.r@(sa-cs)2微胶囊(光密度为4.0
×
105cfus)重悬，并在37℃下轻轻摇晃孵育，在指定时间点(0.5h、1h、2h、3h、4h)，提取50μl孵育溶液，离心分离沉淀、用pbs洗涤(清洗并离心)后，用pbs稀释1000倍并涂布在固体mrs琼脂平板上，在37℃下孵育过夜后进行计数统计。同时，用l.r(光密度为4.0
×
105cfus)替代l.r@(sa-cs)2微胶囊作同样的操作进行比较。结果如图5所示。由图5可见，在人工胃液sgf中，未包裹的l.r很快就会死亡，2h时细菌已经完全失去活
力；l.r@(sa-cs)2微胶囊的细菌能在胃液中存活4h，证明l.r@(sa-cs)2微胶囊对人工胃液抵抗的效果明显优于单独的l.r。
99.用1ml人工肠液sif(ph 6.8，每1l水含0.2m氢氧化钠溶液、6.8克磷酸二氢钾和10克胰蛋白酶)将l.r@(sa-cs)2微胶囊(光密度为4.0
×
105cfus)重悬，并在37℃下轻轻摇晃孵育，在指定时间点(1h、2h、3h、4h)，提取50μl孵育溶液，离心分离沉淀、用pbs洗涤(清洗并离心)后，用pbs稀释1000倍并涂布在固体mrs琼脂平板上，在37℃下孵育过夜后进行计数统计。同时，用l.r(光密度为4.0
×
105cfus)替代l.r@(sa-cs)2微胶囊作同样的操作进行比较。结果如图6所示。由图6可见，在sif中，两组的增长趋势基本一致。说明l.r和l.r@(sa-cs)2微胶囊均可以抵抗肠液，能在肠液中生存。
100.用1ml抗生素氨苄西林(10mg/ml)将l.r@(sa-cs)2微胶囊(光密度为4.0
×
105cfus)重悬，并在37℃下轻轻摇晃孵育，在指定时间点(0.5h、1h、2h、3h、4h)，提取50μl孵育溶液，离心分离沉淀、用pbs洗涤(清洗并离心)后，用pbs稀释1000倍并涂布在固体mrs琼脂平板上，在37℃下孵育过夜后进行计数统计。同时，用l.r(光密度为4.0
×
105cfus)替代l.r@(sa-cs)2微胶囊作同样的操作进行比较。结果如图7所示。由图7可见，在抗生素氨苄西林溶液中，两组的细菌量都在随时间减少，但是，相较于单独l.r组，l.r@(sa-cs)2微胶囊依然表现出对l.r明显的保护作用，l.r减少的速度明显低得多。
101.用1ml人工胆酸(0.3mg/ml)将l.r@(sa-cs)2微胶囊(光密度为4.0
×
105cfus)重悬，并在37℃下轻轻摇晃孵育，在指定时间点(1h、2h、3h、4h)，提取50μl孵育溶液，离心分离沉淀、用pbs洗涤(清洗并离心)后，用pbs稀释1000倍并涂布在固体mrs琼脂平板上，在37℃下孵育过夜后进行计数统计。同时，用l.r(光密度为4.0
×
105cfus)替代l.r@(sa-cs)2微胶囊作同样的操作进行比较。结果如图8所示。由图8可见，在人工胆盐中，两组的细菌量都在随时间减少，但是，相较于单独l.r组，l.r@(sa-cs)2微胶囊组的下降趋势明显减缓。
102.综上，在体外胃肠环境模拟实验中，l.r@(sa-cs)2微胶囊组对胃肠液的抵抗能力要优于单独l.r。
103.五、l.r@(sa-cs)2微胶囊的体内模拟人工胃肠液实验
104.健康小鼠灌胃l.r@(sa-cs)2微胶囊(4.0
×
108cfus)后在指定时间点1h、2h、3h、4h小鼠安乐死，取胃内容物用2ml的pbs稀释后，吸取50μl的液体，离心分离沉淀、用pbs洗涤(清洗并离心)后，用pbs稀释1000倍并分散涂布在固体mrs琼脂平板上，在37℃下孵育过夜，对细菌的数量进行统计，同时，用l.r(4.0
×
108cfus)替代l.r@(sa-cs)2微胶囊作同样的操作进行比较。结果如图9所示。
105.健康小鼠灌胃l.r@(sa-cs)2微胶囊(4.0
×
108cfus)后在指定时间点1h、2h、3h、4h小鼠安乐死，取小肠内容物用2ml的pbs稀释后，吸取50μl的液体，离心分离沉淀、用pbs洗涤(清洗并离心)后，用pbs稀释1000倍并分散涂布在固体mrs琼脂平板上，在37℃下孵育过夜，对细菌的数量进行统计，同时，用l.r(4.0
×
108cfus)替代l.r@(sa-cs)2微胶囊作同样的操作进行比较。结果如图10所示。
106.健康小鼠灌胃l.r@(sa-cs)2微胶囊(4.0
×
108cfus)后在指定时间点1h、2h、3h、4h小鼠安乐死，取盲肠内容物用2ml的pbs稀释后，吸取50μl的液体，离心分离沉淀、用pbs洗涤(清洗并离心)后，用pbs稀释1000倍并分散涂布在固体mrs琼脂平板上，在37℃下孵育过夜，对细菌的数量进行统计，同时，用l.r(4.0
×
108cfus)替代l.r@(sa-cs)2微胶囊作同样的操
作进行比较。结果如图11所示。
107.健康小鼠灌胃l.r@(sa-cs)2微胶囊(4.0
×
108cfus)后在指定时间点1h、2h、3h、4h小鼠安乐死，取结肠内容物用2ml的pbs稀释后，吸取50μl的液体，离心分离沉淀、用pbs洗涤(清洗并离心)后，用pbs稀释1000倍并分散涂布在固体mrs琼脂平板上，在37℃下孵育过夜，对细菌的数量进行统计，同时，用l.r(4.0
×
108cfus)替代l.r@(sa-cs)2微胶囊作同样的操作进行比较。结果如图12所示。
108.图9～图12的结果显示：与体外模拟人工胃肠液实验结果相似，在体内胃液中，单独l.r的数量下降明显(p《0.01)，l.r@(sa-cs)2微胶囊则能保护细菌生存较长的时间；在体内小肠液、盲肠液和结肠液中，随着停留时间的延长，两组细菌的数量均增多，说明l.r和l.r@(sa-cs)2微胶囊在体内都能抵抗肠液，在肠道中生存。所以，在体内胃肠环境模拟实验中，l.r@(sa-cs)2微胶囊组对胃肠液的抵抗能力要优于单独l.r。
109.六、l.r@(sa-cs)2微胶囊的体内代谢过程探究
110.给健康小鼠分别灌胃生理盐水saline、l.r与l.r@(sa-cs)2微胶囊后，于第1、3、5、7、11、15和21天收集其粪便，称重粪便样品，用pbs稀释(稀释因子一致为10％)后涂布在固体琼脂平板上，在微生物培养箱中培养24h。然后，计数每个样品的菌落。检测结果如图13所示，与灌胃生理盐水组相比，灌胃l.r组与灌胃l.r@(sa-cs)2微胶囊组的粪便涂布的细菌数都随时间慢慢减少，而且，灌胃l.r@(sa-cs)2微胶囊组的菌数减少速度明显比灌胃单独l.r的速度慢(p《0.001)，进一步体现出微胶囊包裹的优势，能保护细菌抵抗胃肠环境，通过缓慢释放减慢细菌的代谢过程。
111.七、结肠癌细胞ct26在l.r@(sa-cs)2微胶囊中的细胞活性实验
112.①
将l.r@(sa-cs)2微胶囊用mrs液体培养基悬浮并调整光密度为1
×
107cfus/ml，取6ml的l.r@(sa-cs)2微胶囊悬浮液在37℃摇床孵育活化3h待用。将结肠癌ct26细胞接种于96孔板中，每孔1.0
×
104个细胞，在1640培养基中培养细胞长满80％时，在每孔中加入100μl待用的l.r@(sa-cs)2微胶囊悬浮液后再孵育10h。移去培养液，每孔加入cck8试剂和1640细胞培养基(两者的体积比为1:10)，再孵育1.5h，用酶标仪检测450nm处的吸光度值(od值)，并计算细胞存活率。同时，用l.r替代l.r@(sa-cs)2微胶囊作同样的操作进行比较，并以向细胞中加入1640细胞培养基孵育10h作为对照组(control)。结果如图14所示。由图14可见，相比对照组，单独l.r组和l.r@(sa-cs)2微胶囊组都能引起结肠癌ct26细胞的死亡，且两组引起结肠癌ct26细胞死亡的程度无明显差异。
113.②
将l.r@(sa-cs)2微胶囊用mrs液体培养基悬浮并调整光密度为1
×
107cfus/ml，取6ml的l.r@(sa-cs)2微胶囊悬浮液在37℃摇床孵育活化3h待用。将结肠癌ct26细胞接种于6孔板中，每孔3
×
105个细胞，在1640培养基中细胞培养24h，每孔中加入1.5ml待用的l.r@(sa-cs)2微胶囊悬浮液后再孵育10h。弃上清，然后用不含edta的胰酶消化30s后收集细胞，离心，pbs洗涤(清洗并离心)2次，加入annexin v-fitc/pi染料避光37℃孵育30min。最后用pbs洗去多余的染料，用流式细胞仪进行检测。同时，用l.r替代l.r@(sa-cs)2微胶囊作同样的操作进行比较，并以向细胞中加入1640细胞培养基孵育10h作为对照组。流式检测结果如图15所示。由图15可见，相较于对照组仅有6.04％的肿瘤细胞凋亡率，l.r和l.r@(sa-cs)2微胶囊引起肿瘤细胞凋亡率分别高达80.4％与85％，两组引起的凋亡率基本相等，这说明l.r能引起肿瘤细胞发生凋亡，且微胶囊包裹对l.r的功能几乎无影响。
114.八、结肠癌细胞ct26在l.r@(sa-cs)2微胶囊上清液中的细胞活性实验
115.将l.r@(sa-cs)2微胶囊用mrs液体培养基悬浮并调整光密度为1
×
107cfus/ml，取6ml的l.r@(sa-cs)2微胶囊悬浮液在37℃摇床孵育过夜，4750r离心10min后收集上清液，用0.22μm孔径过滤器过滤上清液后，得到上清液s2。用l.r替代l.r@(sa-cs)2微胶囊作同样的操作，得到上清液s1。
116.①
将结肠癌ct26细胞接种于96孔板中，每孔1.0
×
104个细胞，在1640培养基中培养细胞长满80％时，在每孔中加入100μl上清液s2(或上清液s1)再孵育10h，移去培养液，每孔加入cck8试剂和1640细胞培养基(两者的体积比为1:10)，再孵育1.5h，用酶标仪检测450nm处的吸光度值(od值)，并计算细胞存活率。以向细胞中加入1640细胞培养基孵育10h作为对照组(control)。检测结果如图16所示。由图16可见，相比对照组(control)，上清液s1和上清液s2都能引起肿瘤细胞的死亡，且上清液s1、s2引起细胞死亡的程度无明显差异。
117.②
将结肠癌ct26细胞接种于96孔板中，每孔1.0
×
104个细胞，在1640培养基中培养细胞长满80％时，在每孔中加入100μl上清液s2(或上清液s1)再孵育10h，弃上清，然后用不含edta的胰酶消化30s后收集细胞，离心，pbs洗涤(清洗并离心)2次，加入annexin v-fitc/pi染料避光37℃孵育30min。最后用pbs洗去多余的染料，用流式细胞仪进行检测。以向细胞中加入1640细胞培养基孵育10h作为对照组。流式结果如图17所示。由图17可见，相较于对照组仅有3.33％的肿瘤细胞凋亡率，上清液s1和上清液s2引起肿瘤凋亡率基本相等，分别高达84.1％与83.5％。
118.综合来看，l.r或l.r@(sa-cs)2微胶囊导致的结肠癌ct26细胞的凋亡，是在上清液s1或上清液s2中发生的，说明l.r可能是通过产生某些代谢物引起肿瘤细胞凋亡的，且在l.r@(sa-cs)2微胶囊中l.r的代谢功能以及引起肿瘤细胞发生凋亡的功能几乎无影响。
119.九、结肠癌细胞ct26内凋亡相关蛋白的免疫印迹实验
120.将l.r@(sa-cs)2微胶囊用mrs液体培养基悬浮并调整光密度为1
×
107cfus/ml，取6ml的微胶囊悬浮液在37℃摇床孵育过夜，4750r离心10min后收集上清液，用0.22μm孔径过滤器过滤上清液后，得到上清液s2待用。用l.r替代l.r@(sa-cs)2微胶囊作同样的操作，得到上清液s1待用。将ct26细胞铺于6孔板内，每孔3
×
105个细胞，用1640培养基培养24h，在每孔中加入1.5ml上清液s2(或上清液s1)再孵育10h，用pbs洗涤(清洗并离心处理)三次后，收集并用ripa裂解液裂解细胞。裂解完的细胞在4℃，12000r离心15min后收集上清液，按照western blot标准说明进行操作。用bca蛋白试剂盒测定蛋白的总含量。同时，以向细胞中加入1640细胞培养基孵育10h作为对照组(control)。wb结果如图18所示，与对照组相比，s1组和s2组中，促凋亡蛋白csapase-3与bax增加，抑凋亡蛋白bcl-2减少，这说明l.r@(sa-cs)2微胶囊的上清液s2或l.r的上清液s1与ct26细胞培养后，都会引起细胞内相关凋亡蛋白发生变化。
121.用imagej软件对wb实验结果进行半定量分析得到图19，其中，s1组和s2组中，三种凋亡相关蛋白的表达量无明显差异。相比对照组，s1组(或s2组)的促凋亡蛋白csapase-3与bax增加了0.19和0.16，抑凋亡蛋白bcl-2减少了0.24。这表明无论是在l.r@(sa-cs)2微胶囊还是l.r中，l.r可能是通过产生某些代谢物使肿瘤细胞内促凋亡蛋白csapase-3与bax增加，抑凋亡蛋白bcl-2减少，从而使肿瘤细胞ct26发生了凋亡。
122.十、l.r代谢产物的非靶向代谢组学检测
123.将l.r(4.0
×
106cfus)重悬于10mlmrs液体培养基中，37℃摇床孵育12h，4750r离心10min，取1ml样本于冻干机中冻干，加入100μl的80％甲醇水溶液；涡旋震荡，冰浴静置5min，15000g、4℃离心15min；然后取一定量的上清液加质谱级水稀释至甲醇含量为53％；15000g、4℃离心15min，收集上清，作为上清(supernatant)组进样lc-ms进行分析。同时，以mrs液体培养基作为对照的mrs组进样lc-ms进行分析。
124.图20给出了主成分pca分析图，由图20可见，mrs组和supernatant组之间完全分散，没有交集，且每组的6个样品分布相对较集中。说明样本的组间差异较大而组内差异较小。
125.进一步对鉴定到的差异代谢物进行功能和分类的注释，代谢物的lipidmaps注释分类结果如图21所示，横坐标代表代谢物数目，纵坐标代表注释到的lipidmaps的脂质八大类以及下一级小类；该图展示的是lipidmaps分类注释到的代谢物数目，mrs组和supernatant组差异最大的是短链脂肪酸，说明l.r的上清液中主要成分是短链脂肪酸。
126.根据样品代谢物表达谱的相近程度，将代谢物进行聚类分析，绘制差异代谢物热图，如图22所示。图中横坐标为样本，纵坐标为各差异表达代谢物，不同颜色表示不同的代谢物表达水平，颜色由蓝色经由黄色至红色表示丰度值从低到高，红色表示高表达代谢物，蓝色表示低表达代谢物。图22直观地展示差异代谢物在不同处理中的丰度差异，图中红色方框圈出的是supernatant组相比mrs组来说高表达的成分，可见l.r培养后的上清液中高表达的代谢物属于短链脂肪酸类。
127.十一、口服l.r@(sa-cs)2微胶囊后结肠癌小鼠的肠道菌群变化
128.小鼠原位结肠癌模型构建：选用6-8周龄，体重20-22g的雄性spf级bal b/c小鼠。用异氟烷麻醉小鼠后，于左下腹切口，对手术切口进行消毒，自左下腹寻找盲肠并将其拖出切口外。采用30细针将悬浮于100μl生理盐水的1
×
106个已用萤火虫荧光标记好的结肠癌细胞ct26-fluc注射于盲肠中部血供丰富区域的浆膜下层。注意缓慢推注，时间控制在30s，注射结束拔针后采用小棉球压迫1min，待注射液体被肠壁吸收后，将盲肠复位，避免加压，关闭腹腔。整个手术过程遵循无菌操作的原则。建模完成后，将所有小鼠置于spf动物房中常规饲养10天后，代表造模完成。
129.以造模完成的小鼠原位结肠癌小鼠为对象，设置以下三组实验组：
①
造模后灌胃100μl生理盐水(saline)组、
②
造模后灌胃100μl的l.r组、
③
造模后灌胃100μl的l.r@(sa-cs)2微胶囊组，
②
和
③
中细菌剂量均为4.0
×
108cfus/只。同时，以健康小鼠组的常规饲养作为对照组。7天后，收集对照组和各实验组小鼠的粪便，每组小鼠三颗粪便。实验需要的物品均需提前高压灭菌，整个过程保证无菌进行。
130.收集好的样本进行16s rdna测序。据此绘制肠道菌群的热图，如图23所示，每行代表物种，每列代表样本分组，图中用蓝色到红色的渐变色反映丰度由低到高的变化，越趋近于蓝色，丰度越低，越趋近于红色，丰度越高。由图23可见，小鼠分组灌胃后，肠道菌群发生了明显的差异。灌胃l.r组结肠癌小鼠的菌群组成与灌胃生理盐水组结肠癌小鼠的菌群组成相似，其菌群中变形菌(proteobacteria)和梭杆菌(fusobacterium)等有害菌相较于健康小鼠明显增多，菌群比例明显不同。灌胃l.r@(sa-cs)2微胶囊组结肠癌小鼠的菌群比例虽然未完全跟健康小鼠菌群一致，但与仅灌胃生理盐水组结肠癌小鼠相比，已经很接近健康小鼠的肠道菌群组成，说明结肠癌小鼠口服l.r@(sa-cs)2微胶囊起到了明显的调节肠道
菌群的作用。
131.聚类分析如图24所示，是对照组和各实验组在种水平上的物种相对丰度分布图，所占比例越大表示丰度越高。可见，相比灌胃生理盐水组，灌胃l.r@(sa-cs)2微胶囊组的结肠癌小鼠的肠道菌群发生明显变化，主要是变形菌和梭杆菌等有害菌减少，拟杆菌(bacteroid)和厚壁菌(firmicutes)等产丁酸的有益菌增多。
132.十二、口服l.r@(sa-cs)2微胶囊后结肠癌小鼠的抗生素清除实验
133.小鼠原位结肠癌模型构建：选用6-8周龄，体重20-22g的雄性spf级bal b/c小鼠。用异氟烷麻醉小鼠后，于左下腹切口，对手术切口进行消毒，自左下腹寻找盲肠并将其拖出切口外。采用30细针将悬浮于100μl生理盐水的1
×
106个已用萤火虫荧光标记好的结肠癌细胞ct26-fluc注射于盲肠中部血供丰富区域的浆膜下层。注意缓慢推注，时间控制在30s，注射结束拔针后采用小棉球压迫1min，待注射液体被肠壁吸收后，将盲肠复位，避免加压，关闭腹腔。整个手术过程遵循无菌操作的原则。将所有小鼠置于spf动物房中常规饲养3天后分两组进行。第一组不用抗生素，将小鼠置于spf动物房中常规饲养7天，造模完成。第二组将复合抗生素abx(1mg/ml氨苄西林、1mg/ml新霉素三硫酸盐水合物、1mg/ml甲硝唑、0.5mg/ml万古霉素盐酸盐)添加到小鼠的饮用水中饲养7天，进行7天抗生素预处理，消耗肠道菌群，造模完成。
134.接下来，对于不用抗生素组和用抗生素组的结肠癌小鼠，各分别设置有三组实验组：
①
造模后第0d、3d、7d、11d天，各灌胃100μl生理盐水saline组，剂量为、
②
造模后第0d、3d、7d、11d天，各灌胃100μl的l.r组、
③
造模后第0d、3d、7d、11d天，各灌胃100μl的l.r@(sa-cs)2微胶囊组。
②
和
③
中细菌剂量均为4.0
×
108cfus/只。即，实验分为6组：saline、l.r、l.r@(sa-cs)2、abx+saline、abx+l.r、abx+l.r@(sa-cs)2。
135.在0d与20d，根据每只小鼠体重腹腔注射相应量的荧光成像发光底物d-luciferin(钠盐)(浓度为15mg/ml，剂量为150mg/kg)，3min后用异氟烷麻醉小鼠，将麻醉小鼠置于成像腔内，d-luciferin注射约5min后进行小鼠活体成像拍照(如图25所示)。21d处死小鼠，取出盲肠及盲肠以下的肠组织，用相机进行拍照(如图26所示)，剥离肠表面的肿瘤组织，称量并记录肿瘤重量，如图27所示。记录整个实验过程中各组小鼠的体重，如图28所示。
136.根据图25-28，整个实验过程中各组小鼠的体重没有明显的变化，没有用抗生素预处理的各组小鼠中，l.r组的肿瘤比生理盐水组小，l.r@(sa-cs)2微胶囊组的肿瘤比生理盐水组明显减少(p《0.001)；用抗生素预处理过的各组小鼠中，l.r组的肿瘤与生理盐水组差别不大，但是l.r@(sa-cs)2微胶囊组的肿瘤比生理盐水组明显减少；而且，相较于未用抗生素预处理的生理盐水组，l.r@(sa-cs)2微胶囊组的肿瘤仍然明显减小(p《0.05)。说明l.r@(sa-cs)2微胶囊确实有抑制肿瘤增长的作用，且l.r@(sa-cs)2微胶囊在体内抗肿瘤的效果依赖于肠道菌群，在抗生素预处理的情况下，l.r@(sa-cs)2微胶囊仍然能进入肠道内代谢产生scfas，使肿瘤部分减小。
137.十三、体外丁酸钠联合mk治疗肿瘤
138.将ct26细胞接种于96孔板中，每孔1.0
×
104个细胞，在1640细胞培养基中培养细胞长满80％时，弃培养基，向每孔加入100μl含丁酸钠(nabu)的1640培养液孵育24h，设置多个孔，各孔中丁酸钠nabu的浓度分别设置为0、1、2、5、10、20mm。移去培养液，每孔加入cck8试剂和1640细胞培养基(两者体积比为1:10)，孵育1.5h，用酶标仪检测450nm处的吸光度值
(od值)，并计算细胞存活率。cck8结果统计柱状图如图29所示，说明丁酸钠对ct26细胞呈现浓度依赖性的杀伤作用。
139.同时，免疫印迹检测丁酸钠引起的肿瘤细胞凋亡相关蛋白的表达变化：将ct26细胞铺于6孔板内，每孔3
×
105个细胞，在1640细胞培养基中细胞培养24h后，每孔加入1.5ml浓度为1mm的丁酸钠孵育24h。用pbs洗涤(清洗并离心处理)三次后收集并ripa裂解液裂解细胞。裂解完的细胞在4℃，12000r离心15min后收集上清液，并按照western blot标准说明进行操作，以β微管蛋白(β-tubulin)作为内参。用bca蛋白试剂盒测定蛋白的总含量。同时，以向每孔细胞中加入1640细胞培养基为对照组。wb结果如图30所示。由图30可见，细胞发生了凋亡，主要是促凋亡蛋白caspase-3与bax增加，抑凋亡蛋白bcl-2减少。
140.将ct26细胞接种于96孔板中，每孔1.0
×
104个细胞，在1640细胞培养基中培养细胞长满80％时，弃培养基，向每孔加入100μl含药物mk的1640细胞培养液孵育24h，设置多个孔，各孔中药物mk的浓度分别设置为0、1、2、5、10、50、100、200μm。移去培养液，每孔加入cck8试剂和1640细胞培养基(两者体积比为1:10)，孵育1.5h，用酶标仪检测450nm处的吸光度值(od值)，并计算细胞存活率。cck8结果统计柱状图如图31所示，说明单独的药物mk没有明显的细胞毒性。
141.将ct26细胞接种于96孔板中，每孔1.0
×
104个细胞，在1640细胞培养基中培养细胞长满80％时，弃培养基，向每孔加入100μl含药物(设置有三个实验组，药物分别为：1μm mk、1mm nabu、1μm mk+1mm nabu)的1640细胞培养液，孵育24h。移去培养液，每孔加入cck8试剂和1640细胞培养基(两者体积比为1:10)，孵育1.5h，用酶标仪检测450nm处的吸光度值(od值)，并计算细胞存活率。以向每孔细胞加入1640细胞培养基孵育为对照组。cck8结果统计柱状图如图32所示。由图32可见，相比较对照组，mk组的细胞抑制率为16％、nabu的抑制率为43％、nabu+mk的抑制率为69％，nabu联合mk后表现出显著的细胞抑制率(p《0.0001)。所以，体外实验证明丁酸钠联合mk确实有抗肿瘤作用。
142.十四、体内l.r@(sa-cs)2微胶囊联合mk抗肿瘤
143.小鼠原位结肠癌模型构建：选用6-8周龄，体重20-22g的雄性spf级bal b/c小鼠。用异氟烷麻醉小鼠后，于左下腹切口，对手术切口进行消毒，自左下腹寻找盲肠并将其拖出切口外。采用30细针将悬浮于100μl生理盐水的1
×
106个已用萤火虫荧光标记好的结肠癌细胞ct26-fluc注射于盲肠中部血供丰富区域的浆膜下层。注意缓慢推注，时间控制在30s，注射结束拔针后采用小棉球压迫1min，待注射液体被肠壁吸收后，将盲肠复位，避免加压，关闭腹腔。整个手术过程遵循无菌操作的原则。建模完成后，将所有小鼠置于spf动物房中常规饲养10天后，代表造模完成。
144.造模完成开始治疗ct26原位结肠癌小鼠，以开始治疗的时间点记为第0天，即0d。实验分组为：g1-saline；g2-mk；g3-l.r；g4-l.r@(sa-cs)2；g5-l.r+mk；g6-l.r@(sa-cs)2+mk。于0d、3d、7d、11d灌胃给菌(l.r或l.r@(sa-cs)2)，4d、6d、8d、10d、12d灌胃给药(mk)进行治疗。给菌剂量为每次4.0
×
108cfus/只，mk剂量为45mg/kg，使用相同体积(100μl)的生理盐水(saline)进行治疗的作为对照组。于21d对小鼠进行安乐死处理，治疗过程中每三天记录一次体重。记录各组小鼠的体重变化，如图33所示。由图33可见，各组小鼠的体重在治疗期间均未出现明显的体重下降，表明微胶囊具有良好的生物安全性。
145.在21d取出肿瘤组织，免疫印迹检测各组中肿瘤组织凋亡蛋白的表达。称取等量组
织样本剪碎，加冷pbs，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体，冰上静置5min，小心将上清吸入另一预冷干净离心管。然后在4℃，500g条件下离心2-3min，弃上清。每20μl细胞压积中加入200μl预冷的buffer a，2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15s，置冰上10min。再次高速涡旋振荡5s，然后在4℃，16000g条件下离心5min。快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白。用bca蛋白试剂盒测定蛋白的总含量。收集的细胞上清，按照western blot标准说明进行操作，以β微管蛋白(β-tubulin)作为内参。wb结果如图34所示。由图34可见，g4～g6中，均表现为促凋亡蛋白caspase-3与bax增加，抑凋亡蛋白bcl-2减少。服用mk的g2/g5/g6组，gpr109a受体表达均增高，l.r@(sa-cs)2微胶囊联合mk组促凋亡蛋白表达量最高，抑凋亡蛋白表达量最少。
146.在0d、5d、10d、20d，根据每只小鼠体重腹腔注射相应量的荧光成像发光底物d-luciferin(钠盐)(浓度：15mg/ml，剂量：150mg/kg)，3min后用异氟烷麻醉小鼠，将麻醉小鼠置于成像腔内，d-luciferin注射约5min后进行小鼠活体成像拍照(如图35所示)，21d处死小鼠，取出盲肠及盲肠以下的肠组织，用相机进行拍照(如图36所示)，剥离肠表面的肿瘤组织，称量并记录肿瘤重量(如图37所示)。由图35-37可见，l.r@(sa-cs)2+mk组的治疗效果最好。与对照组比较，l.r@(sa-cs)2+mk组(g6)的肿瘤抑制率为93％，有明显的肿瘤抑制效果；与单独l.r@(sa-cs)2(g4)组比较，l.r@(sa-cs)2+mk组(g6)的肿瘤更小，有明显的统计学意义(p《0.001)。l.r+mk组(g5)的肿瘤抑制率为40％，效果显著弱于l.r@(sa-cs)2+mk组(g6)。
147.21d小鼠安乐死后，取出结肠与肿瘤组织，对结肠组织信息he染色，对肿瘤组织进行he染色和免疫组化ki67染色。
148.he染色：将各组组织固定于4％多聚甲醛溶液，随后用石蜡进行包埋。制作石蜡切片时需要先将石蜡切片脱蜡(石蜡切片依次放于二甲苯ⅰ浸泡10min，二甲苯ⅱ浸泡10min)。随后将切片依次放于无水乙醇5min
‑‑
95％乙醇5min-85％乙醇5min-70％乙醇5min进行水化，然后分别进行苏木素染色与伊红染色。染色完毕后，组织切片依次放于80％乙醇5s-95％乙醇2min-无水乙醇2min，对组织进行脱水。最后即可组织切片封片并进行镜下观察。
149.免疫组化ki67染色：将肿瘤组织切片放在60℃恒温箱中烘烤2小时。二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水(无水乙醇、95％、90％、85％、蒸馏水)后进行抗原修复。后用免疫组化笔围绕组织约2mm处画圈，使组织被油圈完全包围，置pbs中浸泡过氧化物酶阻断：滴加过氧化物酶阻断剂在组织上，室温下湿盒中孵育10min，滴加ki67一抗试剂使其完全覆盖于组织，湿盒中室温下孵育60min，再滴加二抗试剂使其完全覆盖于组织，室温下湿盒中孵育20min，滴加dab使其完全覆盖于组织上，孵育1min，蒸馏水终止显色。最后苏木素复染、盐酸酒精分化、流水反蓝。脱水、透明、中性树胶封片并进行镜下观察。
150.观察结果如图38所示。图38中，从上至下依次为结肠组织的he染色结果、肿瘤组织的he染色结果和肿瘤组织的ki67染色结果。由图38可见，g1组的结肠黏膜出现了明显的破坏，黏膜不完整，破碎；g6组的黏膜相对更加完整，修复的更好；g1组的肿瘤组织无明显的细胞死亡，g6组的肿瘤组织细胞核固缩明显，呈松散细胞排列，提示有大量肿瘤细胞死亡，且ki67提示增殖的肿瘤细胞最少。
151.十五、l.r@(sa-cs)2微胶囊体内安全性评估
152.将健康小鼠灌胃生理盐水saline(100μl)作为对照组，灌胃l.r(100μl，4.0
×
108cfu)、灌胃l.r@(sa-cs)2微胶囊(100μl，4.0
×
108cfu)一次后，在指定的时间点(0、6h、
12h、1d、7d、30d)对小鼠进行眼眶采血100μl，对各个时间点采到的全血进行wbc、rbc、plt检测(n＝6)。由图39a～图39c可见，血液检测中白细胞水平在灌胃l.r、l.r@(sa-cs)2微胶囊后前7天内升高，但逐渐会恢复到正常水平，而红细胞水平是先降低后恢复正常，其它血常规没有明显的差异。wbc计数的参考范围：0.8-6.8 109/l；rbc计数：6.36-9.42 10
12
/l；plt计数：450-1590 109/l。
153.将健康小鼠灌胃生理盐水saline(100μl)作为对照组，灌胃l.r(100μl，4.0
×
108cfu)、灌胃l.r@(sa-cs)2微胶囊(100μl，4.0
×
108cfu)一次后，并在指定的时间点(0、6h、12h、1d、7d、30d)对小鼠进行眼眶采血100μl，对各个时间点采到的血液离心收集血清进行ast、alt、bun、cera血生化检测。结果如图40a～图40c所示，谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、肌酐(cera)等水平在l.r和l.r@(sa-cs)2之间无显著性差异。与未经治疗的健康小鼠相比，经l.r和l.r@(sa-cs)2处理的健康小鼠的大部分血生化数据均在正常范围内。alt计数的正常范围：10.06-96.47u/l；ast：36.31-235.48u/l；cera：30-110μmol/l。
154.此外，体内药效学实验检测时，在7d与20d，对6组小鼠(g1-saline；g2-mk；g3-l.r；g4-l.r@(sa-cs)2；g5-l.r+mk；g6-l.r@(sa-cs)2+mk)眼眶采血100μl，离心收集血清，根据说明用elisa试剂盒检测血清中炎症因子tnf-α、ifn-γ、il-6的变化，如图41a～图41c所示。检测结果提示：在第7天时，灌胃细菌组的炎症因子：tnf-α、ifn-γ、il-6升高，但到20天时指标均能恢复至正常水平，表明口服细菌诱导的炎症是小鼠可耐受的，无慢性毒性。
155.体内药效学实验21d对小鼠进行安乐死后，取其脏器心、肝、脾、肺、肾，将各组组织固定于4％多聚甲醛溶液中，进行he染色进一步评估微胶囊生物安全性。检测结果如图42所示。图42中，从上至下依次为心、肝、脾、肺、肾的he染色结果。由图42可见，重要脏器心、肝、脾、肺、肾的细胞组织结构均未见明显病理改变，提示微胶囊具有良好的生物相容性。

技术特征：
1.一种罗伊氏乳杆菌微胶囊，其特征在于，为l.r@(sa-cs)2微胶囊。2.如权利要求1所述的微胶囊的制备方法，包括以下步骤：(1)将光密度为1
×
106～1.2
×
108cfus/ml的益生菌l.r与浓度为1～5mg/ml的海藻酸钠水溶液混合并搅拌，离心分离沉淀、洗涤，用生理盐水重悬得到第一悬液；将第一悬液加入到浓度为1～2mol/l的氯化钙水溶液中搅拌，离心分离沉淀、洗涤，用生理盐水重悬得到第二悬液；将第二悬液加入到浓度为1～2mg/ml的壳聚糖水溶液中搅拌，离心分离沉淀、洗涤，得到中间产物，记为l.r@(sa-cs)；其中，益生菌l.r与海藻酸钠水溶液的第一体积比、第一悬液与氯化钙水溶液的第二体积比、第二悬液与壳聚糖水溶液的第三体积比均为1:(35～50)；(2)将l.r@(sa-cs)用生理盐水重悬，得到l.r@(sa-cs)悬液；将l.r@(sa-cs)悬液与浓度为1～5mg/ml的无菌海藻酸钠水溶液混合并搅拌，离心分离沉淀、洗涤，用生理盐水重悬得到第三悬液；将第三悬液加入到浓度为1～2mol/l的氯化钙水溶液中搅拌，离心分离沉淀、洗涤，用生理盐水重悬得到第四悬液；将第四悬液加入到浓度为1～2mg/ml的壳聚糖水溶液中搅拌，离心分离沉淀、洗涤，得到产物，记为l.r@(sa-cs)2微胶囊；其中，l.r@(sa-cs)悬液与海藻酸钠水溶液的第四体积比、第三悬液与氯化钙水溶液的第五体积比、第四悬液与壳聚糖水溶液的第六体积比均为1:(35～50)。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一体积比、第二体积比、第三体积比、第四体积比、第五体积比和第六体积比相同。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将2ml光密度为1
×
108cfus/ml的益生菌l.r与98ml浓度为5mg/ml的海藻酸钠水溶液混合并在室温搅拌20～30min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，用2ml生理盐水重悬；然后，转入98ml浓度为1.1mol/l的氯化钙水溶液中室温搅拌10～15min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，用2ml生理盐水重悬；最后，转入98ml浓度为1mg/ml的壳聚糖水溶液中搅拌20～30min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，得到中间产物，记为l.r@(sa-cs)。(2)将l.r@(sa-cs)用2ml生理盐水重悬，得到2ml l.r@(sa-cs)悬液，将其与98ml浓度为5mg/ml的海藻酸钠水溶液混合并在室温搅拌20～30min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，用2ml生理盐水重悬；然后，转入98ml浓度为1.1mol/l的氯化钙水溶液中室温搅拌10～15min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，用2ml生理盐水重悬；最后，转入98ml浓度为1mg/ml的壳聚糖水溶液中搅拌20～30min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，得到产物，记为l.r@(sa-cs)2微胶囊。5.如权利要求1所述的微胶囊或如权利要求2～4中任一项所述的制备方法制得的微胶囊在制备调节肠道菌群的口服益生菌制品中的应用。6.如权利要求1所述的微胶囊或如权利要求2～4中任一项所述的制备方法制得的微胶囊在制备耐胃酸的口服益生菌制品中的应用。7.如权利要求1所述的微胶囊或如权利要求2～4中任一项所述的制备方法制得的微胶囊在制备耐胆酸的口服益生菌制品中的应用。8.如权利要求1所述的微胶囊或如权利要求2～4中任一项所述的制备方法制得的微胶囊在制备改善抗生素引起的菌群失调症的口服益生菌制品中的应用。9.如权利要求1所述的微胶囊或如权利要求2～4中任一项所述的制备方法制得的微胶
囊在制备治疗结肠癌的口服制品中的应用。10.如权利要求1所述的微胶囊或如权利要求2～4中任一项所述的制备方法制得的微胶囊与gpr109a受体激动剂的联合在制备治疗结肠癌的口服制品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种口服递送罗伊式乳杆菌微胶囊及其制备和应用。本发明构建了L.r@(SA-CS)2微胶囊，实现L.r的缓慢释放而未影响L.r的活力，减缓L.r的代谢过程而未影响L.r的代谢功能以及引起肿瘤细胞发生凋亡的功能。口服本发明微胶囊，能够保护L.r免受胃液侵蚀顺利抵达肠道，并通过产生某些代谢产物引起结肠癌细胞的大量凋亡；而且，在抗生素预处理的情况下仍然能进入肠道内代谢产生SCFAs，使肿瘤部分减小；还能明显调节肠道菌群，发挥抗肿瘤作用。尤其是，微胶囊和MK的联合使用，使得结肠癌小鼠的肿瘤抑制率达93％，肿瘤抑制效果显著，且具有很好的生物安全性。本发明微胶囊制备过程简单，耗时短，且成本低。且成本低。


技术研发人员：沈顺 李楠楠 刘莉
受保护的技术使用者：上海市浦东医院（复旦大学附属浦东医院）
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/8/6