白桦脂醇在制备缓解急性移植物抗宿主病药物中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及白桦脂醇在制备缓解急性移植物抗宿主病药物中的应用。


背景技术：

2.异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-hsct)是目前临床上治疗多种血液系统恶性肿瘤的主要方法。allo-hsct后的总死亡率约为50％，导致患者死亡的主要原因是复发、感染和移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,gvhd)。其中gvhd是allo-hsct后最常见和最严重的并发症，发病率高达30-70％，并且与显著的发病率和死亡率相关。gvhd会阻碍移植后的免疫重建，其主要的靶器官为皮肤、胃肠道和肝脏。皮肤损伤通常包括斑丘疹，其在最极端的情况中会出现水疱和溃疡。胃肠道表现包括腹部绞痛和疼痛、腹泻、便血等。肝病是由于胆小管受损导致胆汁淤积，从而导致高胆红素血症和碱性磷酸酶升高。这些并发症严重影响患者的生存及预后。因此如何抑制gvhd的发生是提高异基因造血干细胞移植疗效的关键问题和研究热点。
3.gvhd分为两种，其中急性gvhd(agvhd)主要以th1型细胞因子为主，包括il-1β、il-6和ifn-γ等，主要引起皮肤、胃肠道和肝脏损伤等不良反应。而慢性gvhd(cgvhd)发病除涉及主要以th2和th17型炎症因子外，巨噬细胞和b细胞也发挥了作用，巨噬细胞产生的转化生长因子β(tgf-β)的水平升高会损害treg功能，使得炎症反应加剧。同时，供体b细胞的稳态和耐受机制被扰乱使得记忆功能下降，被宿体抗原激活后b细胞快速扩增，引起更多部位的感染。目前治疗急性ghvd最常用的方法是糖皮质激素，但仅有30-50％的患者会对激素的一线治疗有反应，部分患者仍然无法找到针对gvhd的有效治疗，因此仍亟需寻找针对gvhd的新的治疗方案及治疗靶点。
4.白桦脂醇(betulin)，是一种五环三萜类化合物。广泛存在于白桦树、酸枣仁、大枣等植物中，其中在白桦树皮中含量最高。大量的研究阐明了白桦脂醇的许多特性，包括其及其衍生物可抑制肿瘤细胞生长；同时其还具有抗病毒效果，能限制抑制1型单纯疱疹病毒、hiv和乳头状瘤病毒的活性；也有明显的抗菌活性，如抑制利什曼和曼氏血吸虫的活性。同时也有文献报道，白桦脂醇有明显的抗炎效果，如白桦脂醇能抑制细胞因子的产生，同时抑制tgf-a和nf-kb/ikb的信号传导。又有文献指出，在小鼠肝损伤模型中，预注射白桦脂醇可显著降低促炎细胞因子ifn-γ、tnf-α和il-6的水平，同时显著抑制cona诱导的nkt和常规t细胞的激活，改善肝损伤。但是，关于白桦脂醇是否能够用于治疗急性移植物抗宿主病尚未见报道。


技术实现要素：

5.本发明旨在解决上述问题，提供了白桦脂醇在制备缓解急性移植物抗宿主病药物中的应用。
6.具体的，可以用于改善异基因造血干细胞移植引起的急性移植物抗宿主病的小鼠模型中小鼠体重的下降，降低评分，延迟生存时间。
7.进一步的，所述白桦脂醇用于减少炎性因子的分泌缓解急性移植物抗宿主病。进一步的，所述炎性因子包括il-1α、il-6、ifn-γ、tnf-α和mcp-1。
8.炎性细胞因子释放或细胞因子风暴已经被认为是急性gvhd发生和严重性的主要调节物。本发明白桦脂醇可通过降低炎性因子的表达，如il-1α、il-6、ifn-γ、tnf-α等，预防细胞因子风暴的出现。
9.进一步的，所述白桦脂醇用于减少th1和tc1细胞数量，通过明显减少了受试小鼠体内th1细胞、tc1细胞的数量来减轻agvhd的发生。
10.进一步的，所述白桦脂醇用于促进肠道上皮屏障修复。
11.进一步的，所述白桦脂醇的给药方式为口服。
12.进一步的，所述白桦脂醇的给药剂量为15-30mg/kg，优选为20mg/kg。
13.进一步的，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或添加剂。
14.具体的，所述载体选自片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂、音剂及溶液剂和悬浮剂的一种或多种；所述添加剂选自抗氧化剂、防腐剂、增溶剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、分散剂和表面活性剂中的一种或多种。
15.进一步的，所述药物单独使用，或与其他药物联合使用。
16.本发明的另一方面提供了白桦脂醇在制备肠道上皮屏障修复药物中的应用。
17.本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：本发明首次发现了白桦脂醇能有效治疗急性移植物抗宿主病，改善生存率及体重下降，通过影响th1细胞的数量及减少细胞因子风暴的发生有效缓解agvhd；同时，白桦脂醇还能促进肠道上皮屏障修复，缓解agvhd。
附图说明
18.图1为灌服betulin减轻agvhd的结果图；其中，a-c为小鼠的生存、评分及体重改变情况；d为he染色观察靶器官肺脏、小肠和大肠的病理损伤情况。
19.图2为灌服betulin减少agvhd小鼠多种炎性因子的表达数据图。
20.图3为betulin减少多种靶器官中th1和tc1细胞的数据图，包括脾脏(a)、肝脏(b)、肺(c)及肠道(d)。
21.图4为betulin促进肠道上皮屏障修复数据图；其中，a为灌服的fitc-dextran在血清中的浓度；b为edu检测肠道类器官组织中肠道上皮细胞的增殖情况；c、d为real-time qpcr检测小肠(c)和大肠(d)中紧密连接相关蛋白的表达。
具体实施方式
22.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
23.实施例1betulin可以减轻急性移植物抗宿主病(agvhd)的发生
24.用6-8周龄的c57bl/6(h-2b)和balb/c(h-2d)两种雌性小鼠分别作为供体和受体动物，构建小鼠的异基因造血干细胞移植的agvhd模型，以研究betulin在急性移植物抗宿主病中的作用。其中，c57bl/6小鼠为供体小鼠，balb/c小鼠为受体小鼠。模型的构建方法具
体如下：受体小鼠在移植前送到辐照中心接受6.5gry的全身性辐照，辐照结束后根据小鼠体重随机分组。在第0天，脱颈处死供体小鼠，在无菌环境中摘取小鼠脾脏，研磨到无组织块并用200目滤网过滤。同时取供体小鼠股骨及髂骨，冲出骨髓细胞并用200目滤网过滤。然后用氯化铵缓冲液裂解红细胞，用stemcell的t细胞分选试剂盒分选脾脏细胞中的t细胞，制成细胞悬液；用stemcell的cd90.2阳性分选试剂盒去除骨髓细胞的中t细胞，获得去除t细胞的骨髓细胞悬液(tcd-bm)。将受体小鼠分为2组，每组10只，每只balb/c(h-2d)受体小鼠尾静脉注射0.3ml细胞悬液，其中含c57bl/6(h-2b)供体鼠1
×
106t细胞及5
×
106tcd-bm细胞。分组及给药情况见表1所示。
25.表1
[0026][0027]
实验结果显示，小鼠进行异基因移植后第40天后，对照组存活率为0，白桦脂醇给药组(betulin组)明显延迟了小鼠的生存时间，同时小鼠体重恢复情况明显优于对照组(图1a-1c)。同时在移植后14天，收集靶器官包括肺、大肠、小肠等，进行he染色。he染色的具体步骤如下：1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ10min，二甲苯ⅱ10min，无水乙醇ⅰ5min，无水乙醇ⅱ5min，95％酒精5min，90％酒精5min，80％酒精5min，70％酒精5min，蒸馏水洗一次。2、苏木素染细胞核：切片放入苏木素染液中染色3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。3、伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min，流水冲洗。4、脱水封片：将切片依次放入95％酒精ⅰ5min-95％酒精ⅱ5min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-二甲苯ⅰ5min-二甲苯ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。根据病理切片所示，灌服betulin可以显著减轻靶器官的损伤程度(图1d)。上述试验结果表明白桦脂醇可以使agvhd模型小鼠大幅提高生存率，对agvhd有很好的治疗效果。
[0028]
实施例2betulin通过减少炎性因子的分泌减轻agvhd
[0029]
目前认为，炎性细胞因子释放或细胞因子风暴是急性gvhd发生和严重性的主要调节物，急性gvhd主要以th1型细胞因子为主，包括il-1β、il-6和ifn-γ等，引起皮肤、胃肠道和肝脏损伤等不良反应。因此采用眼眶静脉丛采血的方法，收集agvhd造模后第十四天的各实验组受体鼠的血清，用于相关炎性因子的检测，包括il-1α、il-6、ifn-γ、tnf-α等。每只小鼠取血0.5-1ml，滴入干净的1.5ml ep管，室温静置一小时以上，3000rpm离心15min，吸取上清即为小鼠的血清。采用biolegend legendplex多因子检测试剂盒测定受体小鼠血清中炎性因子的表达，具体步骤如下：
[0030]
(1)标准品的配制：用250μl缓冲液溶解冻干标准品，颠倒多次使其充分混匀，静止10min，然后移入ep管中，标记为c7。再拿7个ep管，分别标记为c6/c5/c4/c3/c2/c1/c0，每个管中加75μl缓冲液，4倍倍比稀释，从c7中取出25μl进行梯度稀释，直到稀释到c1为止，c0为
缓冲液(0pg/ml)。
[0031]
(2)样品及标准品孵育：在每孔中加入25μl缓冲液和25μl基质液，再加入25μl各标准品到相应标准品孔及25μl各样品到相应样品孔，随后加入25μl微球混合液到各孔，混合均匀后避光震荡孵育2小时。用清洗缓冲液洗一次，加25μl检测抗体到各孔，震荡孵育板子1小时，随后直接加25μl pe标记的链霉亲和素到各孔，震荡孵育板子30min。随后，每孔加150μl 1
×
清洗缓冲液，重悬微球，流式上机检测。
[0032]
(3)数据分析：利用legendplex数据分析软件，根据已知浓度的标准品的平均荧光强度制作标准曲线，通过待测样本的平均荧光强度计算出样本中可溶性蛋白的浓度。
[0033]
结果显示，与对照组相比，betulin组的小鼠体内的部分炎性因子如il-1α、il-6、ifn-γ、tnf-α和mcp-1的浓度都明显低于对照组，提示灌服betulin可以显著减轻小鼠体内多种炎性细胞因子的释放，缓解其对靶器官的损伤。
[0034]
实施例3betulin通过减少th1和tc1细胞数量减轻agvhd
[0035]
取agvhd造模后第十四天的各实验组受体鼠颈椎脱臼法处死小鼠，取出小鼠脾脏、肝脏、肺及肠道组织，将脾脏进行研磨至看不到明显的组织块，200目细胞筛过滤细胞悬液，将细胞悬液进行1300rpm，4℃离心8min，弃上清，细胞沉淀中加入5ml红细胞裂解液，将所有细胞充分混匀后，室温放置5min，加入30ml rpmi-1640培养基终止反应，再进行1300rpm4℃离心6min，弃上清，用1ml的rpmi-1640培养基重悬细胞，计数待用；将肝脏、肺进行研磨至看不到明显的组织块，200目细胞筛过滤细胞悬液，将细胞悬液进行1300rpm，4℃离心8min，弃上清，加入40％percoll重悬细胞纯化免疫细胞，加入5ml红细胞裂解液，将所有细胞充分混匀后，室温放置5min，加入30ml rpmi-1640培养基终止反应，再进行1300rpm 4℃离心6min，弃上清，用1ml的rpmi-1640培养基重悬细胞，计数待用；将小肠组织取下，冲洗肠腔，纵剖剪成为0.2*0.2cm碎片，加入5ml肠消化液，37℃震荡消化30min，200目细胞筛过滤细胞悬液，1300rpm 4℃离心6min，弃上清，用1ml的rpmi-1640培养基重悬细胞，计数待用。采用流式细胞仪检测受者agvhd脾脏、肝脏、肺及小肠中供者th1细胞、tc1的百分比。染色步骤如下：(1)细胞表面染色。取1
×
106细胞悬液加入流式管中，先加cd16/cd32抗体4℃封闭20min，进行1300rpm离心5min，充分弃去上清，用100μlpbs(含1％fbs)重悬细胞，并按照说明书加入不同组分的流式抗体，4℃避光孵育30min，待孵育结束后1300rpm离心5min，弃上清。再用pbs洗涤细胞沉淀两次，最后加入200μl的pbs对细胞进行重悬，利用流式细胞仪进行检测。同时做单阳管调节补偿，做阴性管圈门，flowjo软件分析流式数据。(2)细胞胞内染色。取1
×
106个细胞用200μl含10％fbs的rpmi-1640完全培养基重悬，置于96孔板中混匀，加入500ng/ml的pma、50ng/ml的ionomycin和10μg/ml的brefeldina，将上述细胞放置在37℃、5％co2培养箱刺激4小时。刺激结束后，再加入含brefeldina(10μg/ml)的pbs，1300rpm离心5min，弃上清。加入含细胞表面抗体的100μl pbs(含brefeldin a及1％fbs)重悬细胞，4℃避光孵育30min。再加入pbs(含brefeldina及1％fbs)，1300rpm离心5min，弃上清。用4％pfa对细胞进行重悬，室温固定30min，1300rpm离心5min，弃上清。再加入1％saponin(pbs配制)，室温破膜15min，1300rpm离心5min，弃上清。再加入100μlpbs(含1％saponin)重悬细胞，并在其中加入胞内抗体，4℃避光孵育30min。1300rpm离心5min，含1％saponin的pbs洗涤细胞两次。用200μl pbs重悬细胞进行上机检测，同时做单阳管调节补偿，做阴性管圈门，使用flowjo软件分析数据。
[0036]
实验结果显示，与agvhd模型对照组相比，betulin的灌服显著减少了多种靶器官中th1细胞、tc1细胞数量，包括了脾脏、肝脏、肺及肠道组织(图3)。该实验结果提示，betulin可以通过减少靶器官中的th1细胞和tc1细胞来减轻agvhd。
[0037]
实施例4betulin通过促进肠道上皮屏障修复来减轻agvhd
[0038]
为了进一步探索betulin对肠道上皮屏障的影响，取造模后第十四天的各实验组受体鼠，按照0.6mg/g的量对受体鼠灌服fitc-dextran，用酶标仪检测小鼠外周血血清中fitc的含量，以此评价各组受体鼠肠道粘膜屏障功能的受损程度。具体步骤如下：每组6只，体重20g左右，禁食12h以上，fitc-dextran以125mg/ml浓度溶解在pbs中，以每100g体重给予60mg fitc-dextran剂量灌胃，4h后处死小鼠，收集眼球血液，3500r/min离心10min，收集血清，用荧光分光光度计(激发波长480nm、发射波长530nm)测量吸光度值，按标准曲线计算fitc-dextran含量。实验结果显示与agvhd模型对照组相比，灌服betulin显著减少了受体鼠外周血血清中fitc的含量(图4a)。此外，采用实时定量pcr的方法检测小鼠肠道组织中紧密连接蛋白的表达情况，实时定量pcr仪型号为quantstudio 3，反应条件为：95℃3分钟，1个循环；95℃10秒、60℃1分钟，40循环。使用quantstudio
tm
design&analysis软件(applied biosystems)分析ct值。结果显示betulin明显上调小肠(图4c)和大肠(图4d)细胞中紧密连接蛋白的表达。
[0039]
体外实验中，分离了小鼠肠道，进行小鼠肠道类器官培养，具体步骤如下：小鼠安乐死，表面喷洒酒精杀菌。在无菌条件下取出近胃端3～10cm肠组织，用镊子去除肠道外部的肠系膜、脂肪，放入4℃预冷的dpbs溶液中。使用手术剪将肠管剪开，肠腔面朝上，一只手使用手术镊夹住肠组织一端，另一只手使用手术刀片轻轻刮去肠腔表面肠绒毛，待肠绒毛被刮净后，将肠组织置于新的含dpbs的培养皿中清洗，重复清洗2次。将清洗后的小肠组织剪碎至2mm宽，转移至新的培养皿中，用dpbs清洗2遍。将清洗好的肠段转移至含有5mmol/ledta的预冷dpbs中消化，置于4℃孵育30min。消化完成后，将组织碎片转移到新的含dpbs的培养皿中清洗，重复2次以去除edta。用5ml移液管在预冷的0.1％bsa的pbs的培养皿或50ml离心管中吹打、重悬组织碎片，使组织反复穿过移液管尖以产生机械剪切力从而使隐窝与基底层分离，取一部分悬液镜检，当可以看到大量的隐窝样结构后，停止吹打，并对吹打后的组织悬液进行70μm滤网过滤。收集穿过滤网的组织悬液，300
×
g离心力4℃离心3min。弃上清，使用1ml 0.1％bsa的pbs重悬组织沉淀，取20μl悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，300
×
g离心力4℃离心3min，弃上清后置于冰上。用适量的基质胶重悬组织沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过30s。将基质胶和组织细胞的混合悬液点入24孔板底部正中央，每孔50μl左右，避免悬液接触孔板侧壁。将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育15min左右待基质胶凝固。待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的小鼠小肠类器官完全培养基，24孔板每孔500ul，避免破坏已凝固结构。将24孔板置于37℃二氧化碳培养箱中培养，每3天更换一次培养基。使用肠道类器官组织培养体系，证实betulin可以促进肠道上皮细胞的增殖(图4b)。
[0040]
这些结果提示灌服betulin可以促进受体鼠肠道上皮屏障的修复，从而减轻agvhd。
[0041]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变
动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.白桦脂醇在制备缓解急性移植物抗宿主病药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白桦脂醇用于减少炎性因子的分泌缓解急性移植物抗宿主病。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述炎性因子包括il-1α、il-6、ifn-γ、tnf-α和mcp-1。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白桦脂醇用于减少th1和tc1细胞数量。5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白桦脂醇用于促进肠道上皮屏障修复。6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白桦脂醇的给药方式为口服。7.如权利要求1或6所述的应用，其特征在于，所述白桦脂醇的给药剂量为15-30mg/kg。8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或添加剂。9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物单独使用，或与其他药物联合使用。10.白桦脂醇在制备肠道上皮屏障修复药物中的应用。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及白桦脂醇在制备缓解急性移植物抗宿主病药物中的应用。本发明首次发现了白桦脂醇能有效治疗急性移植物抗宿主病，改善生存率及体重下降，通过影响Th1细胞的数量及减少细胞因子风暴的发生有效缓解aGVHD；同时，白桦脂醇还能促进肠道上皮屏障修复，缓解aGVHD。缓解aGVHD。缓解aGVHD。


技术研发人员：吴德沛 林丹丹 沈莹 侯畅 李鹏飞 崔艳芳 徐杨
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/8/6