造血干细胞治疗骨再生和牙齿相关疾病的方法与流程

1.本发明涉及一种脐血造血干细胞在牙齿相关疾病中的用途。具体地，本发明涉及脐血造血干细胞在制备用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的产品中的用途，或者在制备用于牙齿相关组织形成或修复产品中的用途；还涉及包含脐血造血干细胞的组合物在治疗牙齿相关疾病中的用途。


背景技术：

[0002] 脐带血作为造血干/祖细胞( hscs/hpcs)的另一来源，已经应用于临床治疗多种恶性和非恶性血液疾病。脐带血中hscs/hpcs的质与量是决定其临床应用效果的最重要因素。同时，脐带血中还存在多种非造血的干细胞和前体细胞，如间充质干细胞(mscs)、内皮前体细胞( epcs)和非限制性体干细胞(usscs)等。
[0003]
脐带血来自脐带和胎盘，通常在妇女分娩后扔掉，现已知脐带血中含有丰富的造血干细胞，临床上发现ucbt比bmt更有优势，脐血干细胞的免疫原性更弱，即使供者和受体者存在1-2个位点差异，也不会发生严重的免疫排斥反应。
[0004]
近三十年来，脐带血造血干细胞移植治疗血液病的成功，极大地促进了脐血干细胞的应用和发展。再生医学的迅速发展，干细胞悄然用于除血液病以外的疾病的治疗，如脑瘫，心脑血管疾病，糖尿病，骨质疏松，呼吸病，肾脏疾病和肝脏疾病等与细胞衰老相关的疾病。
[0005]
牙齿相关疾病的人群已远远超过其它任何一种疾病。在牙齿相关疾病中，牙周病是一种全世界范围内发病率很高的疾病，最终导致牙齿支持组织丧失和牙齿缺失，并能引起一系列的全身系统性疾病。牙齿缺失可对人体消化系统和全身健康造成严重的影响，同时也会使患者产生不良的社会心理影响。但目前对牙周病及牙齿组织缺损没有好的药物或治疗方法进行治疗或修复；有关牙齿缺失的治疗主要仍是采用人工材料制作牙齿的替代物。
[0006]
随着年龄增加，牙齿会出现各种各样的问题，牙龈退缩、牙齿脱落，牙齿稀松，牙缝变宽。造成牙体缺损的原因主要为龋齿，其次为外伤、磨蚀、酸蚀等。修复方法可根据牙体缺损情况和使用材料情况，选用树脂、全瓷、烤瓷修复等。大多数牙周病进展缓慢，始发时多为牙龈炎，除偶有刷牙出血外并无多少自觉症状，所以不引人注意。而牙龈炎发展到一定程度即为牙周炎，此时可出现严重口腔异味，牙周反复脓肿，牙齿松动，牙缝越来越大，越来越稀疏，严重者牙齿脱落。
[0007]
但已破坏的牙周组织（包括牙龈萎缩）是不可逆的，目前的治疗方法很难完全恢复。因此，临床上有待开发一种新的方法来促进牙周组织的再生和牙龈的稳定。
[0008]
成骨生物衍生材料是由经过特殊处理的天然骨组织形成的生物医用材料，也称为生物骨再生材料。生物组织可取自同种或异种动物体的骨组织，通过特殊处理包括维持骨组织原有构型而进行的固定、灭菌和消除抗原性的轻微处理，以及拆散原有构型、重建新的物理形态的强烈处理。
[0009]
理想的牙骨修复材料应具备以下特征：首要作用为结构支撑作用，须具备一定的机械强度和韧性；其次还应具备良好的生物相容性、可降解性和成密质骨性；此外还要具有适当的孔隙结构，便于细胞在其表面增殖和分化。
[0010]
我们用脐血干细胞和成骨生物材料，合并为牙齿成骨或牙龈再生材料，可有效地促进牙龈组织的再生，用于治疗牙齿和牙周疾病，并取得了较好的效果，旨在解决老年性的牙齿、牙髓、牙周和牙龈等疾病问题。
[0011]
我们还提供了生产具有矿化基质能力的成骨细胞的方法，包括所述脐血干细胞促进成骨细胞生长和分化的条件，所述成骨细胞产生可检测量的含钙和/或磷酸盐的矿化基质，或促进该基质产生的条件。在实施例中，脐血干细胞可促进成骨细胞的生长或促进骨的产生。


技术实现要素：

[0012]
本发明的目的在于提供一种标准化脐带血造血干细胞在在牙齿相关疾病中的应用。涉及脐血造血干细胞在制备用于预防或治疗与牙齿相关的疾病的产品中的用途，或者在制备用于牙齿相关组织形成或修复产品中的用途；还涉及包含脐血造血干细胞的组合物，牙骨修复材料在治疗牙齿相关疾病中的用途。
[0013]
本发明的技术方案如下：本发明提供造血干细胞治疗骨再生和牙齿相关疾病的方法，其特征在于：采用脐带血造血干细胞，加或不加成骨活性的生物材料，用于牙齿相关疾病的预防，处理或治疗。
[0014]
优选的，所用脐带血干细胞的提取和制备方法，包括但不限于以下步骤：a. 用自制的干细胞分离液从人脐带血中提取脐带血造血干细胞，所述脐带血在提取前经过abo/rh血型、hla分型、微生物学检测；b．将所获得的cbhsc进行相关质量检测，将符合质量标准的cbhsc用冷冻保护剂处理，分装于冻存管或冻存袋，进行梯度降温，按其abo /rh血型和hla分型进行液氮冷冻保存，建立可供检索的cbhsc信息档案，即为标准化cbhsc库；c. 采用标准化cbhsc库来源的脐血造血干细胞用于动物实验，临床前研究，临床研究和治疗。
[0015]
优选的，所述牙齿相关疾病，包括但不限于以下类型：牙周病、牙周炎、牙齿缺损、牙齿组织缺损、牙齿缺损修复、牙齿相关组织缺损和修复、牙齿相关组织替代物等。
[0016]
优选的，具有成骨活性的生物材料包含无机原料，选自碳酸钙、五氧化二磷、羟基磷灰石、氯化锶、碳酸镁或碳酸锌中的任意几种组合。
[0017]
优选的，所述具有生物活性结构的成骨有机物可来源于：人、牛、马、猪、羊、狗、兔和虎牙或骨。
[0018]
优选的，所述的生物材料包含羟磷灰石和磷酸三钙的混合物。
[0019]
优选的，所述的成骨活性的生物材料包括羟磷灰石、磷酸三钙和生长因子的混合物。
[0020]
优选的，所述生长因子包括bmp、ihh或其混合物。
[0021]
优选的，所述生物材料包括但不限于磷酸三钙底物、磷酸三钙-胶原底物、胶原底物、磷酸钙底物、矿化的人胎盘胶原底物、透明质酸底物、和陶瓷底物。
[0022]
优选的，所述生物材料可以被基质孔中存在的成骨细胞矿化。
[0023]
脐血造血干细胞及组合物在牙齿相关疾病中的用途，其中所述的与牙齿相关的疾病，或牙齿相关组织形成或修复选自：牙周病、牙周炎、牙齿缺损、牙齿组织缺损。
[0024]
脐血造血干细胞及组合物在牙齿相关疾病中的用途，其中所述的牙齿相关组织包括但不限于牙齿、牙根、牙髓、牙龈等。
[0025]
由上述公开的技术方案可见，本发明提出了基于组织工程技术的生物牙根再生的新理念。其次，本发明将生物牙根再生的新理念在大型动物小型猪上实施，获得成功，证明该发明方法可行，有望成为一种新的修复方式应用于临床。第三，本发明提供的具体实施方法系统、可靠，为进行生物牙根再生的深入研究及商品化提供理论依据和技术支持，综上，本发明对于利用生物牙根再生修复牙齿缺失有十分重要和深远的意义：首先本发明所谓的组合物，牙骨修复材料是指干细胞与成骨生物衍生材料混合所形成的促进牙骨或牙龈再生的组合物。
[0026]
本发明所谓的成骨生物衍生材料，是由经过特殊处理的天然骨组织形成的生物医用材料，也称为生物骨再生材料。生物组织可取自同种或异种动物体的骨组织，通过特殊处理包括维持骨组织原有构型而进行的固定、灭菌和消除抗原性的轻微处理，以及拆散原有构型、重建新的成骨态。
[0027]
有益效果：本发明用脐血干细胞和成骨生物材料，合并为牙齿成骨或牙龈再生材料，可有效地促进牙龈组织的再生，用于治疗牙齿和牙周疾病，并取得了较好的效果，旨在解决老年性的牙齿、牙髓、牙周和牙龈等疾病问题。
[0028]
本发明还提供了生产具有矿化基质能力的成骨细胞的方法，包括所述脐血干细胞促进成骨细胞生长和分化的条件，和所述成骨细胞产生可检测量的含钙和/或磷酸盐的矿化基质，或促进该基质产生的条件。在实施例中，脐血干细胞可促进成骨细胞的生长或促进骨的产生。
[0029]
图1是患者卢某干细胞/cpc6个月治疗前后牙槽骨高度及骨密度的x线片对比图；图2是患者余某干细胞/cpc6个月治疗前后牙槽骨高度及骨密度的x线片对比图。
具体实施方式
[0030]
下面以具体实施例对本发明进行说明，特此申明，此处所选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0031]
定义：在具体描述本发明时，有必要对本文中所要用到的某些术语进行定义和解释，以利对本发明的理解。
[0032] 造血干细胞：造血干细胞（hematopoietic stem cell，hsc）是指骨髓中的干细胞，具有自我更新能力并能分化为各种血细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板，它们也可以分化成各种其他细胞。它们具有良好的分化增殖能力，干细胞可以救助很多患有血液病的人们，最常见的就是白血病。捐献造血干细胞特别是脐带血对捐献者的身体并无任何伤害。
[0033]
胎盘：胎儿血液与母亲血液交换营养物质的场所。
[0034]
脐带：连接胎盘与胎儿之间的纽带，有脐带静脉、动脉和中间的结缔组织。
[0035]
脐带血：孕妇产后脐带和胎盘的血管中含有的血液。
[0036]
脐带血单个核细胞，是从脐血中分离的以单个核细胞为主的细胞集合体，其中含脐带血造血干细胞，淋巴细胞，单核细胞和小单核细胞等。
[0037]
脐血干细胞：从脐带血中分离造血干细胞，称脐带血造血干细胞或脐血干细胞。
[0038]
细胞质量标准：根据国内外有关干细胞文献资料，自行制定或与国内有关权威机构共同制定的能反映细胞特征和指导临床应用的一系列指标的组合。
[0039]
本发明所谓的干细胞成骨组合物，是指干细胞与成骨生物衍生材料混合所形成的促进牙骨或牙龈再生的组合物。
[0040]
本发明所谓的成骨细胞培养基由dmem，10％胎牛血清，包含青链霉素、谷氨酰胺、抗坏血酸和地塞米松组成。
[0041]
本发明所谓的成骨生物衍生材料，是由经过特殊处理的天然骨组织形成的生物医用材料，也称为生物骨再生材料。生物组织可取自同种或异种动物体的骨组织，通过特殊处理包括维持骨组织原有构型而进行的固定、灭菌和消除抗原性的轻微处理，以及拆散原有构型、重建新的成骨态。
[0042]
以下结合本发明的技术方案，以实施例的方式说明本发明的实施内容。
[0043] 实施例一：脐带血造血干细胞的制备。
[0044]
一、材料原料：有资质的医疗机构采集并保存在细胞制备中心的脐带血。
[0045]
设备：超净工作台，水平离心机，倒置显微镜和普通显微镜。离心管和平衡天平，采血袋。
[0046]
试剂：泛影葡胺（sigma公司），羟甲基纤维素（sigma公司），氯化铯（sigma公司），聚蔗糖（ficoll-400，phamacia公司），磷酸二氢钾、氢氧化钠（均为广州化学试剂厂）。
[0047] 淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），比重为1.076 g/ml。
[0048]
细胞培养基：含10%小牛血清的高糖dmem培养基（gibco公司）。
[0049] 干细胞分离液，自制，包括重量比为15：10：1：15的泛影葡胺、羟甲基纤维素、氯化铯和聚蔗糖。
[0050]
二、方法细胞制备：在每管10 ml脐带血中加入10ml自制的干细胞分离液。20℃以1500r/min离心15分钟，离心管中液体分为四层，吸取血清层和分离层之间的白色云雾状有核细胞层。以pbs洗涤，800r/min常温离心4分钟，细胞计数。
[0051]
细胞存活率分析：台盼蓝染色，活细胞计数。瑞氏染色和有核细胞分析。
[0052] 流式细胞仪检测：pbs 洗涤细胞后，将 pe-cd34，pe-cd133、pe-cd90，pe-cd44、pe-cd45、单克隆抗体分别加入 pbs 悬浮的细胞悬液中，4℃孵育 40min，洗涤细胞，流式细胞仪检测。同时设 pe-igg1 及 fitc
‑ꢀ
igg1 标记的阴性对照抗体，并用加入单克隆抗干细胞作为空白对照。
[0053]
三、结果所得细胞经台盼蓝染色显示，细胞存活率均达95%以上。细胞计数：每ml细胞数
×
所取细胞悬液总量计算公式：每ml脐血带所获细胞数=
ꢀ‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
每离心管所加脐带血量
注：本实验中，每离心管所加脐带血量为10ml。
[0054]
经计算后细胞计数结果，分离脐带血所获细胞数：每ml脐带血所获有核细胞数为3.46
×
106个。
[0055] 流式细胞仪检测表明，uc-mncs中cd34+、cd133+细胞比例应大于1.0%。
[0056]
实施例二、本实施例提供一种生物骨修复材料的制备方法步骤如下：步骤1：取天然皮质牛骨，制备成1cm*1cm*2cm的长条状结构，去除血液脂肪及骨髓等成分并充分冲洗，然后用双氧水超声浸泡90min进一步去除脂肪成分，用无水乙醇浸泡30min，用表面活性剂进一步清洗后在用水充分清洗并干燥，得天然生物骨支架材料备用；步骤2：加入0.1-1.0n的naoh，加热25-100℃浸泡30分钟，用纯净水洗涤干净，80℃烘干，粉碎，过30目滤网，即成。
[0057]
实施例三，脐血造血干细胞生物学成骨性分析的体内研究将脐血造血干细胞与羟基磷灰石和三磷酸钙(ha/tcp)混合后移植到裸鼠皮下，通过组织形态学的观察来研究干细胞体内成骨/成牙分化能力。
[0058]
体内移植：步骤1：取脐血造血干细胞，计数，取1ml细胞悬液置含有40mg羟基磷灰石(ha)的2ml圆底ep管中(要保证每组细胞量一致，约2-3
×
106细胞/组)。
[0059]
步骤2：37℃，5％co2条件下孵育1.5h。为保证细胞与ha充分结合，应在摇动的情况下孵育。
[0060]
步骤3：离心，使ha沉于管底，吸上清，将脐血干细胞与ha混合待用。
[0061]
步骤4：裸鼠称重，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。75％酒精消毒背部皮肤，在背部中线处剪一2-3cm的切口。
[0062]
步骤5：钝性分离皮下结缔组织，将细胞与ha混合物植入裸鼠皮下缝合皮肤。
[0063]
步骤6：移植后第八周，获取移植细胞用10％福尔马林固定，10％edta脱钙(ph值8.0)，石蜡包埋，he染色，定性测量组织矿化量；结果：干细胞在体内成骨/成牙分化能力强。
[0064] 实施例三、脐血干细胞及组合物促进牙周骨缺损修复材料和方法小型猪 (6-8月龄，体重30-40千克)由中国农业大学实验动物中心提供。本实验通过广东省实验动物中心伦理委员会批准。小型猪脐血干细胞的分离和培养方法参见实施例一。
[0065]
按照文献报道的方法，制备12只雌性五指山小型猪的牙周炎骨缺损模型，制备24处下颌第一恒磨牙的牙周炎骨缺损。24处缺损随机分为以下3组：1、空白对照组，不做任何治疗；2、单纯材料组，翻瓣、刮治、移植ha/tcp支架材料、明胶海绵覆盖缺损、缝合；3、脐血干细胞移植组，翻瓣、刮治、移植ha/tcp支架材料+2.0
×
107脐血干细胞、明胶海绵覆盖缺损、缝合。
[0066]
在制备牙周炎骨缺损模型前(-4w)、移植治疗前(0w)和治疗后12w进行临床检查，包括探诊深度、牙龈退缩和附着丧失。在0w和治疗后12w应用ct观察骨再生的情况。在-4w、治疗后1-7d、2w、4w、8w和12w进行血常规检查、血生化检查。在治疗后12w，处死动物，从实验
部位获取标本，固定、脱钙、石蜡包埋，行he染色，观察组织再生情况。
[0067] 统计学处理：通过student-t检验和方差分析进行统计学分析，p＜0.05认为是有统计学差异。
[0068] 2、结果脐血干细胞能促进牙周组织再生观察人脐血干细胞能否修复小型猪牙周炎骨缺损模型。在移植后12周，移植人脐血干细胞组的pd为3.5
±
0.6mm，同种异体造血干细胞移植组的pd为3.3
±
0.4mm，ha/tcp组为13.1
±
1.1mm，空白对照组为10.6
±
1.3mm。统计学分析表明人脐血干细胞或者同种异体干细胞移植组与ha/tcp组和空白对照组相比牙周组织得到了明显再生，而人脐血干细胞或者同种异体干细胞移植组之间并没有显著差异。ct扫描显示人脐血干细胞或者同种异体干细胞移植组的牙槽骨明显再生，基本恢复到了正常水平，而ha/tcp组和空白对照组仅仅少量再生或者没有再生。
[0069]
组织学观察表明，在人脐血干细胞或者同种异体干细胞移植组，明显再生出新骨、牙骨质和牙周纤维，在ha/tcp组和空白对照组，仍可见明显的牙周炎表现，包括深牙周袋、缺乏新生骨和牙周纤维。此外，与移植治疗前4w相比，治疗后各时间点的血常规检查、血生化检查、免疫球蛋白检查和免疫学相关指标都没有明显变化，表明人脐血干细胞移植组修复牙周炎骨缺损没有排斥反应的发生。
[0070] 人脐血干细胞或者同种异体干细胞移植组修复小型猪牙周炎骨缺损模型，不会引起免疫排斥反应。
[0071] 实施例4：脐血干细胞促进的生物牙根再生材料和方法脐血干细胞的制备，参见实施例1。
[0072]
牙周膜细胞膜片制备：将生长旺盛的2
×
105第二或第三代牙周膜干细胞接种在25ml的培养瓶中，培养成分为dmem培养基(含10％胎牛血清，100μmol/l的l-抗坏血酸，2mmol/l谷氨酰胺，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素)。培养10-14天，培养皿边缘细胞出现皱褶，用较钝刀片或细胞刮子将细胞膜片整体揭下来，过程中细胞膜片不要干燥。
[0073]
支架材料的制备：将羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料做成类似牙根的外形，尺寸为：直径5mm，长度15mm的圆锥体。羟基磷灰石/磷酸三钙为多孔网状结构，孔径多为200～500μm，牙髓干细胞复合在羟基磷灰石/磷酸三钙三维支架上，在生物反应器内生长第5天的牙髓干细胞，细胞充分伸展，细胞表面的突起和分泌颗粒很多，连接成一片，直径多在20-50μm。
[0074]
回植前细胞复合：将1
×
108培养至第3代的根尖牙乳头干细胞悬于培养基，将牙根型支架材料置于含细胞的培养基，在37℃摇床上充分混合2h，将支架材料小心夹出，放置于培养皿中，将剩余的细胞悬液小心滴加于支架材料上，静置4h后加培养液，在生物反应器内培养5d后回植。
[0075]
回植方法：分别选取小型猪的缺牙区。切开黏膜，翻开黏骨膜用瓣，暴露牙槽嵴顶。用种植机以800转/分钟的速度在牙槽骨内钻一个与羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料形状相似的孔，将上述根尖牙乳头干细胞/牙髓干细胞与牙根形羟基磷灰石/磷酸三钙混合后在生物反应器内培养7天，牙周膜干细胞膜片包绕羟基磷灰石/磷酸三钙表面，回植于小型猪牙
槽骨内。
[0076]
结果：本发明应用普通的培养皿制备牙周膜细胞膜片的方法，培养基成分中加入100μmol/l的l-抗坏血酸2-磷酸，可以促进细胞快速增殖，并能分泌大量细胞外基质胶原成分，将所有细胞连接在一起，生长到一定程度后，可将整个细胞膜片完整揭下来。细胞膜片不破坏细胞外基质连接形成的支架，不破坏细胞表面蛋白的粘附增殖及分化等功能，可促进回植体内后形成牙周组织。正常牙周膜特别薄约0.2mm，如果采用支架材料，相对较厚，材料降解后遗留的空隙是个问题，牙周膜片避免了此问题，相比常规采用recell温度响应培养皿，需要特殊的材料pipa-am，更方便简单。
[0077]
本实验中细胞复合到材料后在生物反应器内培养5天，生物反应器动力性三维培养促进了支架内部营养物质的交换，促进了种子细胞在支架材料中的均匀分布，有利于细胞保持成骨表型及促进细胞外基质在支架材料中的沉积，既可减少对细胞的损伤作用，又可为细胞的生长提供有利的力学环境。
[0078] 回植6～9月后，回植的生物牙根在x线片表现为不透射的高密度影，周围有低密度影像环绕。组织学上，再生的生物牙根组织形态与新生的骨组织完全不同，是由许多处于不同生长阶段的球形硬组织团块组成，球形团块相互连接成网状。新生的球形硬组织体积较小，外面围绕着疏松排列呈蓝紫色的细胞，推测可能是成牙本质细胞或成牙骨质细胞，中央为均匀、粉染的基质。较成熟的球形硬组织团块体积较大，中间基本不含细胞，或可见极少量被包埋于其中的细胞碎片。团块中有类牙本质样的结构，其中可见排列不规则的牙本质小管样结构，也有类似牙骨质样的结构，镜下表现为较均匀一致的硬组织。新形成的硬组织区域外为纤维结缔组织包绕，未见炎细胞浸润，部分区域内还可见类似sharp
′
s纤维样的结构插入正在形成的类牙骨质和牙本质样结构中。
[0079]
实施例5：人脐血干细胞移植用于牙周病的治疗1、脐血干细胞的制备。
[0080] 2、选取多个口腔牙周损伤病例。
[0081]
在牙周病初始治疗之后，将两个同种异体hpdlscs片与ha/tcp植入到3mm
×
5mm
×
7mm的牙周损伤缺陷处。
[0082]
通过复诊确定病例患者的好转情况。
[0083] 结果如表1所示。
[0084]
表1.
[0085]
实施例6 成骨分化(组织化学分析)将hpdlc接种在6孔板中，并通过将培养基从正常生长培养基改成成骨培养基(包
含10％fcs、抗坏血酸、10-7m地塞米松、8mm-磷酸甘油的dmem/f12)而诱导其沿着成骨途径分化。作为对照，将 hpdlc培养在包含10％fcs的正常生长培养基中。
[0086] 在培养14天后，在pbs中洗涤hpdlc一次。然后，就alp活性或钙沉积物的存在对经诱导的培养物和对照培养物进行染色(von kossa 染色)。
[0087]
对于经诱导的培养物，证明了alp活性增加和钙沉积增加，这支持了基因表达的结果。
[0088] 所有三个标记物在经诱导的培养物中上调；这证明hpdlc能够沿着成骨途径分化，表明该细胞群由未成熟间充质干细胞组成。
[0089]
实施例7：人脐血干细胞、多孔磷酸钙骨支架修复小鼠骨缺损的实验磷酸钙骨支架 （calcium phosphate cement, cpc）具有良好的生物相容性、骨传导性和可塑性。人脐血干细胞（human cord blood stem cells, hcbscs）是脐带血中提取的造血干细胞，本实验将负载 hcbscs的多孔 cpc 支架作为实验组，以cpc组作为对照，植入小鼠骨缺损部位，观察hcbscs的cpc支架对成骨的影响。
[0090] 1 材料与方法1.1 实验材料多孔磷酸钙骨水泥支架由广西创美口腔中心提供，hcbscs由广州熙帝生物科技有限公司提供，参见实施例一。spf级4~5周龄balb/c小鼠20只，16~20g，由中山大学医学部实验动物中心提供。
[0091] 1.2 hcbscs 与cpc支架复合:接种细胞前，将cpc支架在培养基中浸泡 3 h。将 1.5
×
105 hcbscs细胞与cpc 支架材料混合待用，以cpc支架为对照。
[0092] 1.3动物实验20只小鼠随机分为2组：cpc +hcbscs组 、cpc组用 10%水合氯醛将小鼠行腹腔注射麻醉，于工作台固定，常规消毒、铺巾，在颅骨外侧做一约 2 cm 切口，暴露颅骨，完全去除骨膜。 用环形电钻在颅骨处钻取直径为 8 mm 的圆形骨缺损，完全去除缺损中的碎骨质。 将以上2组 cpc 支架分别植入骨缺损中，缝合伤口。
[0093] 1.4组织学观察于术后 12 周处死动物，观察材料降解及新骨生成情况。将未脱钙标本在 4%甲醛溶液中固定，甲酸中脱钙 7 d，二甲苯透明后石蜡包埋，行组织切片，苏木精和伊红（h-e）染色。用 image pro plus 软件分析新生骨的百分比和血管密度。
[0094] 1.5统计学分析应用 spss16.0 软件包进行数据处理，计量资料以x
±
s表示， 采用单因素方差分析，p《0.05 为差异具有显著性。
[0095] 2 结果2.1术后12周，h-e染色切片发现，2组均有新骨形成。cpc支架周围可见较多新骨，cpc支架内部也可见新骨形成，新骨可长入支架内部。
[0096] 干细胞+cpc支架组的成骨量多于cpc支架组的成骨量，提示干细胞能促进更多骨形成。定量分析发现，第 12 周时，实验组的新生骨比例为38.5%，而对照组的新生骨比例为21.6%，组间具有显著差异（p＜0.05）3 结论
脐血干细胞能促进小鼠颅骨的骨生成。
[0097]
实施例8：人脐血干细胞、多孔磷酸钙骨支架修复牙周骨缺损的临床疗效观察本实施例运用脐血干细胞和多孔磷酸钙骨支架（cpc）治疗牙周骨缺损，评价其修复效果。
[0098] 1.1材料多孔磷酸钙骨支架由广西创美口腔中心提供，hcbscs由广州熙帝生物科技有限公司提供。
[0099] 1.2临床资料选择就诊于我中心的中、重度慢性牙周炎患者为研究对象。纳入标准:患牙邻面有骨下袋，经牙周基础治疗 4 周以上探诊深度＞5 mm，需进行翻瓣骨移植术者(有牙髓炎症状者均常规行根管治疗术);无全身性疾病，女性非妊娠、哺乳期。共纳入20例患者的20个患牙，病变部位骨下袋(二壁或三壁袋)共20处。20例患者随机分成2 组(n=10): cpc /干细胞组(51.42
ꢀ±
12.33) 岁，cpc组(50.11
±
9.18)岁，两组患者在性别、年龄、吸烟以及牙髓状况方面差异均无统计学意义(p》0.05)。
[0100] 1.3方法1.3.1脐血干细胞的制备（参见实施例1），将干细胞和cpc材料混合充分，静置，1小时内使用，对照组仅用cpc材料。
[0101] 1.3.2手术局麻下患牙及其近远中各1～2个邻牙以内斜切口翻开全厚瓣暴露骨缺损区并清创后，cpc /干细胞组植入干细胞与cpc的混合物，cpc组植入cpc混合物，用中等压力将混合物充填入骨缺损区，使之与骨袋口平齐，充满根分叉，适当压紧，确保植入材料不得暴露于口腔中后缝合。术后口服罗红霉素胶囊3 d，西吡氯铵漱口水含漱4周，以防感染。于术后6个月观察牙龈退缩(gr)、探诊深度(pd)、临床附着水平(cal)等临床指标，并进行骨高度、骨密度分析。骨密度以平均光密度(mod)值的变化作为参考。
[0102] 1.4统计学分析用 spss 17． 0 软件进行统计学处理，统计变量以均数
±
标准差表示。配对用t。协方差分析比较组间骨高度及骨密度的变化以排除基线时各因素的干扰;组内比较时数值校正后采用方差分析。
[0103] 2 结果20例患者伤口愈合良好，无炎症及感染，未见明显骨粉暴露。
[0104] 2.1临床指标变化术后6个月两组探诊深度(pd)、临床附着水平(cal) 和牙龈退缩(gr)较术前相比均明显降低(p《0.05)。所有指标，cpc/干细胞组显著优于cpc组(p《0.05)。
[0105]
表2.两组临床指标变化情况
[0106]
*，术后6个月，同cpc组相比，p《0.05。
[0107] 2.2 x线片影像的变化术后6个月牙槽骨垂直或角形吸收处均可见新骨生长，骨量增加，有正常牙周膜间隙存在，周围正常骨组织的界线已变模糊，但骨小梁密度稍低于周围骨密度，其中cpc/干细胞组好于cpc组。
[0108] 2.3 骨缺损区牙槽骨高度及密度变化与术前比较，术后6个月对照组的牙槽骨高度及骨密度增加不明显，实验组牙槽骨高度及骨密度均增加明显(p《0.05)。
[0109]
表3.两组骨高度和骨密度的变化情况
[0110]
*，术后6个月，同cpc组相比，p《0.05。
[0111]
由图1可明显看出患者卢某的治疗情况，干细胞/cpc治疗后牙槽骨高度及骨密度均增加。
[0112]
由图2可明显看出患者余某的治疗情况，治疗前，牙周骨明显缺损，干细胞/cpc治疗后牙槽骨高度及骨密度均明显增加。
[0113] 3 结论：本结果表明cpc联合干细胞及技术治疗中、重度慢性牙周炎导致的牙周骨缺损，在术后6个月均显示出了在促进牙周再附着及骨密度增加。
[0114]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实
质和范围。

技术特征：
1.造血干细胞治疗骨再生和牙齿相关疾病的方法，其特征在于：采用脐带血造血干细胞，加或不加成骨活性的生物材料，用于牙齿相关疾病的预防，处理或治疗。2.根据权利1所述的造血干细胞治疗骨再生和牙齿相关疾病的方法，其特征在于，所用脐带血干细胞的提取和制备方法，包括但不限于以下步骤：a. 用自制的干细胞分离液从人脐带血中提取脐带血造血干细胞，所述脐带血在提取前经过abo/rh血型、hla分型、微生物学检测；b．将所获得的cbhsc进行相关质量检测，将符合质量标准的cbhsc用冷冻保护剂处理，分装于冻存管或冻存袋，进行梯度降温，按其abo /rh血型和hla分型进行液氮冷冻保存，建立可供检索的cbhsc信息档案，即为标准化cbhsc库；c. 采用标准化cbhsc库来源的脐血造血干细胞用于动物实验，临床前研究，临床研究和治疗。3.根据权利1所述的造血干细胞治疗骨再生和牙齿相关疾病的方法，其特征在于，具有成骨活性的生物材料包含无机原料，选自碳酸钙、五氧化二磷、羟基磷灰石、氯化锶、碳酸镁或碳酸锌中的任意几种组合。4.根据权利1所述的造血干细胞治疗骨再生和牙齿相关疾病的方法，其特征在于，所述具有生物活性结构的成骨有机物可来源于：人、牛、马、猪、羊、狗、兔和虎牙或骨。5.根据权利1所述的造血干细胞治疗骨再生和牙齿相关疾病的方法，其特征在于，所述的生物材料包含羟磷灰石和磷酸三钙的混合物。6.根据权利1所述的造血干细胞治疗骨再生和牙齿相关疾病的方法，其特征在于，所述的成骨活性的生物材料包括羟磷灰石、磷酸三钙和生长因子的混合物。7.根据权利7所述的造血干细胞治疗骨再生和牙齿相关疾病的方法，其特征在于，所述生长因子包括bmp、ihh或其混合物。8.根据权利1所述的造血干细胞治疗骨再生和牙齿相关疾病的方法，其特征在于，所述生物材料包括但不限于磷酸三钙底物、磷酸三钙-胶原底物、胶原底物、磷酸钙底物、矿化的人胎盘胶原底物、透明质酸底物、和陶瓷底物。9.根据权利1所述的造血干细胞治疗骨再生和牙齿相关疾病的方法，其特征在于，所述生物材料可以被基质孔中存在的成骨细胞矿化。10.根据权利1-9所述的造血干细胞治疗骨再生和牙齿相关疾病的方法，其特征在于，所述牙齿相关疾病，包括但不限于以下类型：牙周病、牙周炎、牙齿缺损、牙齿组织缺损、牙齿缺损修复、牙齿相关组织缺损和修复、牙齿相关组织替代物等。

技术总结
本发明公开了造血干细胞治疗骨再生和牙齿相关疾病的方法，采用脐带血造血干细胞，加或不加成骨活性的生物材料，其中所用脐带血干细胞为标准化脐血干细胞库来源的细胞，脐血干细胞能促进成骨细胞生长和分化，成骨细胞产生可检测量的含钙和/或磷酸盐的矿化基质和该基质产生的条件；本发明方法应用于预防或治疗与牙齿相关的疾病的产品、牙齿相关组织形成或修复产品以及包含脐血造血干细胞及其组合物在治疗牙齿关疾病中的用途，该方法系统、可靠，为进行生物牙根再生的深入研究及商品化提供理论依据和技术支持。论依据和技术支持。论依据和技术支持。


技术研发人员：邹清雁 刘海霞 杜少茵 梁海燕 钟文玲 丁先风 邹奕君 吴志君 吴涛
受保护的技术使用者：广州熙帝生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.23
技术公布日：2023/8/5