一种乳酸乳球菌乳酸亚种及其在腐乳制备中的应用的制作方法

no.62711。保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地点为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2022年8月23日。
8.所述的乳酸乳球菌乳酸亚种在腐乳制备中的应用。
9.为进一步实现本发明目的，优选地，在灭菌后的培养基中接种乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lacti)，培育后离心，稀释到5-6log cfu/g，然后与毛霉菌液一起接种到豆腐白坯，25-30℃温度下发酵25-30h，加盐腌制，得腐乳。
10.优选地，所述乳酸乳球菌乳酸亚种的培养基为m17、mrs和豆腐黄浆水，初始p h值为6-9。
11.优选地，所述培养基的灭菌方法为120-125℃灭菌10-30min。
12.优选地，所述培养基中乳酸乳球菌乳酸亚种的接种量为3-10wt％。
13.优选地，所述的乳酸乳球菌乳酸亚种在培养基中接种的方法是25-35℃的温度下培养18-30h后，在3000-8000g的转速下离心10-30min，倾去上清液，加入0.85-2wt％的无菌食盐水，制成乳酸乳球菌乳酸亚种菌悬液。
14.优选地，稀释后的乳酸乳球菌乳酸亚种菌悬液的浓度为5-6log cfu/g；毛霉菌悬液的浓度为5-6log cfu/g；乳酸乳球菌乳酸亚种菌悬液与毛霉菌悬液按1:1-2体积比接种到豆腐白坯。
15.优选地，所述的乳酸乳球菌乳酸亚种在豆腐白坯中的接种量为1-3ml/100g。
16.优选地，所述的腐乳毛坯加入8-12％的食盐腌制3-12h后装瓶，在15-32℃温度下后熟45-60天。
17.本发明相对于已有的商业菌株，具有以下的优点：
18.1)本发明乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)菌株生长速度快，活力高，培养条件简单，易于工业化生产和管理，开发应用前景广阔。
19.2)本发明乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)菌株具备耐酸、耐盐特性，能很好的适应腐乳等高盐产品的生产环境。
20.3)本发明乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)菌株产羊毛硫ia型细菌素nisin，对腐乳工厂中产生物膜的代表性蜡样芽孢杆菌具有显著的抑制效果，能提高腐乳等产品生产的安全性。
21.4)本发明乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)菌株对抗生素氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、克林霉素、四环素、红霉素和氯霉素敏感，安全性符合efsa的要求，无相关耐药基因。
22.5)本发明乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)菌株不产尸胺、组胺、腐胺、酪胺四种生物胺，不产明胶酶及溶血素，不能利用色氨酸产生吲哚，无相关氨基酸脱羧酶编码基因及毒力基因。
23.6)本发明乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)菌株生长温域宽，生命力旺盛，活力高，最大活菌数高达12.64log cfu/ml。
24.7)本发明乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)菌株在ph3-10的培养液中能生长，在6-8％质量浓度nacl的培养液中能生长，基因组存在3种应对高渗胁迫的编码基因及8种不同的双组分系统，具有较好的耐酸、耐盐特性。
25.8)本发明乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)菌株具有
lactis subsp.lactis ljl7m20菌液使用mh培养基30℃培养2天，调菌液至0.5麦氏浊度(8log cfu/ml左右)。分别在96孔板中加入100μl抗生素稀释液和100μl菌液，设置空白培养基对照和菌液对照，30℃培养2天。使用酶标仪测定孔板中菌液在600nm下的od值，实验设置3个平行。乳酸乳球菌药敏结果的判定参照efsa标准，如表1：
43.表1菌株耐药性拐点
[0044][0045]
(5)菌株生物胺测定
[0046]
采用显色法测定乳酸乳球菌产生物胺(尸胺，组胺，腐胺，酪胺)的情况。先制备生物胺诱导培养基，在m17液体培养基中分别添加0.1％的前体氨基酸(酪氨酸盐酸盐、鸟氨酸盐酸盐、组氨酸、赖氨酸)以及0.005％vb6，121℃灭菌15min。将活化好的lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20按3％的比例接种至生物胺诱导培养基，连续诱导5代。分别取100μl诱导后的菌液加入到显色培养基中，培养24h。根据培养基颜色判断菌株产生物胺情况，紫色为阳性，淡紫色或黄色为阴性。
[0047]
(6)菌株明胶酶活性测定
[0048]
将活化好的lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20按3％接种于明胶培养基中，30℃培养24h。然后放入4℃冰箱5h，观察培养基是否液化。
[0049]
(7)菌株溶血活性测定
[0050]
将活化好的lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20划线于血琼脂平板上，30℃培养48h，观察是否出现α-溶血(绿色光泽)现象，然后在4℃下静置24h观察是否出现β-溶血(溶血圈)现象，无现象则为γ-溶血。
[0051]
(8)产靛基质情况
[0052]
将活化好的lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20按3％接种于胰蛋白胨水培养基，30℃培养72h。然后向培养液中加入少量乙醚，震荡均匀，提取和浓缩靛基质，待乙醚浮于培养基表面时缓慢滴加8-10滴kovacs氏试剂，出现红色圆环则为靛基质阳性。以大肠杆菌atcc25922作为质控菌株。
[0053]
(9)菌株温度适应性及生长特性测定
[0054]
将lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20接种于m17液体培养基中，于30℃
培养24h，获得种子液。按2％(v/v)接种于m17液体培养基中，分别在25℃，30℃，35℃，40℃，45℃下恒温培养24h后，测其od600nm值。取种子液，按2％(v/v)接种于m17液体培养基中，于30℃培养，在0-12h，每隔2h测一次od600nm值，在13-48h，每隔4小时测一次od600nm值。使用涂布法测定最大菌落数。
[0055]
(10)菌株ph耐受性及nacl耐受性
[0056]
取种子液，按2％接种量分别接种于初始ph值为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10的m17液体培养基中，30℃培养24h后，测其od600nm值。取种子液，按2％接种量分别接种于naci浓度为0，1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％的m17液体培养基中，30℃培养24h后，测其od600nm值。
[0057]
(11)全基因组测定
[0058]
使用m17肉汤培养基活化-80℃保藏的lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20，30℃培养24h，连续传代二次，收集菌体并用液氮速冻，使用ctab法提取基因组dna，获取的dna在-20℃下保存备用。使用超微量分光光度计测定提取的dna的od值，a260/280比值在1.8-2.0之间则视为质量合格。将dna样品进行建库，使用长读测序平台oxford nanopore promethion进行三代测序，在illumina novaseq 6000测序仪上使用双端技术(pe 150)进行二代测序。使用三代测序数据进行基因组组装，并使用二代测序数据进行校正。使用ncbi原核基因组注释管道(pgap)进行组装基因组的注释。
[0059]
(12)nisin测定
[0060]
将lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20接种于m17液体培养基中，于30℃培养24h，制备无菌上清液(8000
×
g，离心10min，0.2μm过膜)。使用elisa试剂盒测定无菌上清液nisin浓度。
[0061]
(13)对腐乳工厂中产生物膜的代表性蜡样芽孢杆菌的抑制情况
[0062]
实验室前期研究中显示，江门某腐乳厂各生产环节(车间环境样本、加工设备样本、原料及半成品样本)分离了138株蜡样芽孢杆菌，根据rapd-pcr分型结果，挑选了13株在豆浆体系中与不锈钢和聚苯乙烯表面形成生物膜能力不同(高、中、低)的代表性菌株，具体如表2：
[0063]
表2腐乳工厂中产生物膜的代表性蜡样芽孢杆菌
[0064][0065]
将lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20用m17液体培养基连续传代2-3次，调菌液至0.5麦氏浊度，将100μl调好的菌液加入5mlm17液体培养基中，30℃培养24h。将腐乳工厂中13株蜡样芽孢杆菌分别用bhi液体培养基连续传代2-3次，将100μl菌液加入5mlbhi液体培养基中，30℃培养12h。lb固体培养基冷却到40℃左右，分别加入13株蜡样芽孢杆菌菌液(调菌液浓度至5-6log cfu/ml左右)。贴上8mm纸片，在超净台内吹干平板。吸取筛选菌株的菌液、无菌上清液(8000
×
g，离心10min，0.2μm过膜)及调至ph7.0的无菌上清液50μl到纸片上。培养12h左右，测量抑菌圈直径。
[0066]
(14)工厂模拟接种发酵试验
[0067]
将lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20接种于m17液体培养基中，于30℃培养24h，备用。喷洒了霉菌菌种的豆腐块取自开平某腐乳厂，接种乳酸乳球菌菌液后，放入发酵杯，28℃发酵30h。稀释涂布后，测定腐乳毛坯中蜡样芽孢杆菌数量，并设置空白对照。
[0068]
黄浆水是豆腐在压制过程中产生的黄色沥水，含有丰富的营养，适宜微生物的生长和繁殖，在长期存放和发酵的过程中会自然酸化。我国安徽、广东等地会利用黄浆水作为豆腐的天然凝固剂，接种霉菌后，经长时间发酵变成毛豆腐。毛豆腐可以加热食用或加盐腌制成腐乳产品，滋味鲜美、风味独特。本发明深入研究毛豆腐的菌群体系，筛选到1株具有安全性和抑制蜡样芽孢杆菌特性的乳酸乳球菌乳酸亚种，该菌株具有活力高、耐酸、耐盐的特性，在腐乳生产中具有潜在的应用价值。
[0069]
本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)对抗生素氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、克林霉素、四环素、红霉素和氯霉素敏感，基因组中无相关耐药基因，安全性符合efsa的要求。
[0070]
本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20)不产尸胺、组胺、腐胺、酪胺四种生物胺，不产明胶酶及溶血素，不能利用色氨酸产生吲哚，基因组中无相关毒力基因。
[0071]
本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20)生命力旺盛，活力高，最大活菌数为12.64log cfu/ml，符合食品商业化菌株的生产需求。
[0072]
本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20)在
ph3-10的培养液中能生长，在6-8％质量浓度nacl的培养液中能生长，基因组中存在3种应对高渗胁迫的编码基因及8种不同的双组分系统。
[0073]
本发明的述乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20)基因组中存在细菌素nisin基因簇及完整代谢通路，上清液nisin浓度为214.55μg/l。
[0074]
本发明的乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20)对腐乳工厂中产生物膜的代表性蜡样芽孢杆菌的抑制效果显著。接种该菌株后，腐乳毛坯中蜡样芽孢杆菌菌数下降1.48log cfu/g。
[0075]
本发明中乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20)是使用无菌取样袋现场采集的毛豆腐样品，通过稀释和平板涂布法筛选得到。该菌株的菌落形态为：在m17固体培养基平板上菌落突起，呈圆形，直径为1-2mm，白色，不透明，湿润光滑；菌体为球状菌，无芽孢，成对或堆状排列；常规生理生化实验结果表明菌株ljl7m20为革兰氏阳性菌、过氧化氢酶阴性、无法利用柠檬酸。进一步对16s rdna序列进行分析，并通过blast比对和建树结果，鉴定其为乳酸乳球菌(lactococcus lactis)。结合表型实验及全基因组nr数据库注释，进一步确定该菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)。
[0076]
本发明中乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20)符合食品抑菌剂特性。该菌株对efsa规定的9种抗生素敏感，不产生物胺等毒性代谢物，基因组中无相关耐药基因及毒力基因。该菌株活力高，最大活菌数为12.64log cfu/ml，具有一定耐酸、耐盐特性，基因组中存在3种应对高渗胁迫的编码基因及8种不同的双组分系统。该菌株能产细菌素nisin，能抑制腐乳工厂中产生物膜的代表性蜡样芽孢杆菌，减少腐乳生产中的蜡样芽孢杆菌数量，可以作为抑菌剂应用到腐乳体系中，从而控制蜡样芽孢杆菌的污染程度，有效提升腐乳生产的安全性。
[0077]
实施例1：菌株筛选和鉴定
[0078]
(1)采样及分离：使用无菌采样袋，现场采集发酵房中的毛豆腐，低温带回。立即使用无菌生理盐水分别稀释至10-3
,10-4
,10-5
倍，取100μl样品液涂布于m17固体培养基上。然后放入30℃的恒温培养箱中，培养48小时。挑取疑似菌落，进行平板划线分离，如此重复4-5次，直至获得单菌落。
[0079]
(2)形态观察及生理生化鉴定：该菌株在m17培养基上的菌落呈圆形，直径为1-2mm，白色，不透明，湿润光滑(见图1)；经革兰氏染色，菌体为球状菌，无芽孢，成对或堆状排列(见图2)。使用3％过氧化氢测定菌株是否具有过氧化氢酶；使用克氏柠檬酸盐培养基测定菌株是否利用柠檬酸。lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性菌株，无法利用柠檬酸。
[0080]
(3)抑菌初筛：将lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20用m17培养基连续活化2次，30℃培养24h。将蜡样芽孢杆菌atcc14579用bhi液体培养基连续活化2次，培养12h。lb固体培养基冷却到40℃左右，加入蜡样芽孢杆菌atcc14579菌液(调菌液浓度至5-6log cfu/ml左右)。贴上8mm纸片。吸取菌株ljl7m20的菌液及无菌上清液(8000
×
g，离心10min，0.2μm过膜)50μl到纸片上。培养12h左右，测量抑菌圈直径。加入菌液的抑菌圈直径为20mm，而加入无菌上清液的抑菌圈直径为18mm。
[0081]
(4)16s分子鉴定：将lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20用m17培养基连
续活化2次，30℃培养24h。采用细菌dna提取试剂盒提取基因组dna，使用16s rdna通用引物(27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'和1492r：5'-ggttaccttgttacgactt-3')进行pcr扩增，pcr扩增体系为50μl，包括：dna 1μl、引物27f和引物1492r各2μl，2
×
pcr mix 20μl，超纯水25μl。pcr扩增程序设定为：94℃预变性3min；94℃变性30s，42℃退火30s，72℃延伸1min，30次循环；72℃延伸10min。在1.5％琼脂糖凝胶中加入goldview染料制胶，电泳检验条带，送至生工生物工程(广州)公司进行测序，获得16srdna序列(见序列表seq.id.no1)。序列结果在ncbi的基因库上进行比对，找出与该菌株亲缘相近的标准菌株lactococcus lactis subsp.lactis strain uc77，将该菌株的16s rdna的部分序列与标准菌株进行相似度分析，发现该菌株与乳酸乳球菌序列同源性超过99％(见表3)，应为同一种。
[0082]
表3为本发明lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20菌株根据16s rdna序列所做的blast序列比对情况表。
[0083]
表3 lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20菌株16s rdna序列比对情况
[0084][0085]
该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地点为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc no.62711，保藏日期为2022年8月23日。
[0086]
实施例2：抗生素敏感性
[0087]
(1)乳酸乳球菌菌悬液制备：取100ml锥形瓶，加入50mlmh液体培养基，121℃灭菌15min，接种lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20，30℃培养2天，调菌至0.5麦氏浊度(8log cfu/ml左右)。
[0088]
(2)抗生素稀释液制备：采用抗生素氨苄西林、克林霉素、氯霉素、红霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、四环素和万古霉素，配制浓度为5120μg/ml的抗菌药物贮存液，临用时按稀释液配制法稀释至所需浓度的使用液。
[0089]
(3)抗生素敏感性分析：分别在96孔板中加入100μl抗生素稀释液和100μl菌液，设置空白培养基对照和菌液对照，30℃培养2天。使用酶标仪测定孔板中菌液在600nm下的od值，实验设置3个平行。结果表明，lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20菌株对efsa规定的9种抗生素均敏感，具体结果如表4：
[0090]
表4 lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20菌株的耐药性情况
[0091][0092][0093]
实施例3：毒性代谢物分析
[0094]
(1)活化菌株：取100ml锥形瓶，加入50mlm17液体培养基，121℃灭菌15min，接种lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20，30℃培养24h。
[0095]
(2)产生物胺情况：制备生物胺诱导培养基，在m17液体培养基中分别添加0.1％的前体氨基酸(酪氨酸盐酸盐、鸟氨酸盐酸盐、组氨酸、赖氨酸)以及0.005％vb6，121℃灭菌15min。将活化好的lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20按3％的比例接种至生物胺诱导培养基，连续诱导5代。制备显色液体培养基(配方：蛋白胨30g，牛肉膏粉9g，氯化钠15g，磷酸吡哆醛0.05g，溴甲酚紫0.06g，氨基酸5g，水1000ml)，调节ph为5.2
±
0.2。分别取100μl诱导后的菌液加入到显色培养基中，培养24h。所有试管均显示淡紫色或黄色，判定为阴性。
[0096]
(3)明胶酶活性分析：制备明胶培养基(蛋白胨5.0g，牛肉粉3.0g，明胶120.0g，蒸馏水1000.0ml)，加热溶解，调ph至7.4-7.6，过滤分装，121℃灭菌15min。将活化好的lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20按3％接种于明胶培养基中，30℃培养24h。然后放入4℃冰箱5h。所有试管无液化现象，判定为阴性。
[0097]
(4)溶血活性分析：将将活化好的lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20划线于血琼脂平板上，30℃培养48h，观察溶血现象，然后在4℃下静置24h再次观察。结果显示血平板无现象，判定为γ-溶血。
[0098]
(5)产靛基质情况：将活化好的lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20按3％接种于胰蛋白胨水培养基，30℃培养72h。然后向培养液中加入少量乙醚，震荡均匀，待乙醚浮于培养基表面时缓慢滴加8-10滴kovacs氏试剂。以大肠杆菌atcc25922作为质控菌株。结果显示无红色圆环，判定为阴性。
[0099]
实施例4：菌株生长特性
[0100]
(1)活化菌株：取100ml锥形瓶，加入50mlm17液体培养基，121℃灭菌15min，接种lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20，30℃培养24h。
[0101]
(2)温度适应性：将活化好的菌液按2％(v/v)接种于m17液体培养基中，分别在25℃,30℃,35℃,40℃,45℃下恒温培养24h后，测其od600nm值。菌株在30℃生长情况最好，od值为1.4956。在45℃时，菌株基本停止生长(如图3中a所示)。
[0102]
(3)生长特性测定：将活化好的菌液按2％(v/v)接种于m17液体培养基中，于30℃培养，在0-12h，每隔2h测一次od600nm值，在13-48h，每隔4小时测一次od600nm值。结果显示，菌株在8-16h为生长对数期，在28h达到最大值，生长速度较快，最大活菌数为12.64log cfu/ml(如图3中b所示)，符合商业菌株的生产需求。
[0103]
(4)ph耐受性：将活化好的菌液按2％接种量分别接种于初始ph值为1，2,3,4,5,6,7,8,9,10的m17液体培养基中，30℃培养24h后，测其od600nm值。菌株在ph3-10之间均能生长，且在ph6-9之间生长情况最好(如图3中c所示)。
[0104]
(5)nacl耐受性：将活化好的菌液按2％接种量分别接种于naci浓度为0,1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％的m17液体培养基中，30℃培养24h后，测其od600nm值。菌株在6-8％质量浓度nacl的培养液中能生长，耐盐性较好(如图3中d所示)。
[0105]
实施例5：抑制腐乳工厂代表性蜡样芽孢杆菌菌株生长的效果
[0106]
(1)菌种活化：取100ml锥形瓶，加入50mlm17液体培养基，121℃灭菌15min，接种lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20，30℃培养24h。将活化好的菌液按2％(v/v)接种于m17液体培养基中，30℃培养24h。另取100ml锥形瓶13份，分别加入50mlbhi液体培养基，121℃灭菌15min，分别接种腐乳工厂中13株代表性蜡样芽孢杆菌(菌株编号：mp6、djf3、s3、slk5、dj5、xp2、dff5、yzj7、slk1、df5、mp8、glc1、djg5)，30℃培养12h。将活化好的菌液按2％(v/v)分别接种于bhi液体培养基中，30℃培养12h。
[0107]
(2)抑菌试验：制备13份100ml lb固体培养基(在液体培养基的基础上加0.7％琼脂)，121℃灭菌15min，冷却到40℃左右，分别加入13株蜡样芽孢杆菌菌液(调菌液浓度至5-6log cfu/ml左右)。贴上8mm纸片，在超净台内吹干平板。吸取筛选菌株的菌液、无菌上清液(8000
×
g，离心10min，0.2μm过膜)及调至ph7.0的无菌上清液50μl到纸片上。培养12h左右，测量抑菌圈直径。表5为lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20菌株对腐乳工厂代表性蜡样芽孢杆菌的抑制情况表，从表5可见，lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20菌株对在不同介质表面产生物膜能力不同(od595为0.0212-3.534)的蜡样芽孢杆菌均有显著的抑制效果。
[0108]
表5
[0109][0110]
实施例6：菌株全基因组分析、亚型鉴定及产细菌素nisin验证
[0111]
(1)全基因组分析：使用m17肉汤培养基活化lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20，30℃培养24h，连续传代二次，收集菌体并用液氮速冻，使用ctab法提取基因组dna，将dna样品进行建库，使用长读测序平台oxford nanopore promethion进行三代测序，在illumina novaseq 6000测序仪上使用双端技术(pe 150)进行二代测序。使用三代测序数据进行基因组组装，并使用二代测序数据进行校正。使用ncbi原核基因组注释管道(pgap)进行组装基因组的注释(ncbi bioproject accession：prjna879920)。
[0112]
(2)亚种鉴定：结合表型实验及全基因组注释分析(见表6)，将菌株进一步鉴定为乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)。
[0113]
表6 lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20菌株的典型表型特征情况
[0114][0115][0116]
(3)耐药基因分析：将全基因组序列比对到card数据库，未发现相关抗生素耐药基因。
[0117]
(4)毒力基因分析：通过kegg数据库注释，未发现产生4种生物胺相应的氨基酸脱羧酶编码基因(赖氨酸脱羧酶ec 4.1.1.18、组氨酸脱羧酶ec 4.1.1.22、鸟氨酸脱羧酶ec 4.1.1.17、酪氨酸脱羧酶ec 4.1.1.25)，未发现明胶酶、溶血素以及色氨酸酶等相关编码基
因。通过vfdb数据库注释，设置序列覆盖度＞90％，在染色体基因簇中发现了5个非典型的毒力基因，序列相似度＜90％，安全性较好。
[0118]
(5)应对高渗胁迫分析：通过kegg数据库注释，发现了3种应对高渗胁迫的编码基因(见表7)及8种不同的双组分系统(见图4)。
[0119]
表7 l.lactis subsp.lactis ljl7m20菌株应对高渗胁迫的编码基因
[0120][0121]
(6)次级代谢物分析：使用bagel4数据库注释到lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20产i类细菌素nisin z，相似性100％(见图5)。使用antismash数据库注释到lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20产i类细菌素nisina/q，相似性100％(见图6)。在kegg代谢通路注释到完整的nisin代谢通路，包括群体感应、双组分系统、abc转运代谢途径(见图7)。
[0122]
(7)细菌素验证：将lactococcus lactis subsp.lactis ljl7m20接种于m17液体培养基中，于30℃培养24h，制备无菌上清液(8000
×
g，离心10min，0.2μm过膜)。经elisa试剂盒测定，无菌上清液nisin浓度为214.55μg/l。
[0123]
实施例7：菌株在腐乳制备中的应用1
[0124]
(1)菌种制备：取100ml锥形瓶，加入50mlm17液体培养基，121℃灭菌20min，接种l.lactis subsp.lactis ljl7m20菌株，32℃培养24h。离心，取菌泥用生理盐水稀释到5log cfu/g备用。
[0125]
(2)发酵试验：在腐乳工厂取豆腐白坯，在喷洒接种毛霉菌液后同时接种l.lactis subsp.lactis ljl7m20菌液，再置于25-29℃温度下发酵26h。同时将仅接种毛霉的豆腐白坯置于相同环境下培养25-29℃温度下发酵26h作为对照例。其他工艺同腐乳的制备工艺。经测定，对照样的蜡样芽孢杆菌数量为4.78log cfu/g，而接种了l.lactis subsp.lactis ljl7m20的腐乳毛坯其蜡样芽孢杆菌数量为3.30log cfu/g。
[0126]
实施例8：菌株在腐乳制备中的应用2
[0127]
(1)菌种制备：取250ml锥形瓶，加入100mlm17液体培养基，121℃灭菌15min，接种l.lactis subsp.lactis ljl7m20菌株，30℃培养28h。离心，取菌泥用生理盐水稀释到6log cfu/g备用。
[0128]
(2)发酵试验：在腐乳工厂取豆腐白坯，在喷洒接种毛霉菌液后同时接种l.lactis subsp.lactis ljl7m20菌液，再置于24-28℃温度下发酵30h。同时将仅接种毛霉的豆腐白坯置于相同环境下培养24-28℃温度下发酵30h作为对照例。其他工艺同腐乳的制备工艺。所获得的腐乳毛坯加盐腌制后，装瓶后熟45天。经测定，腐乳对照样的蜡样芽孢杆菌数量为3.38log cfu/g，而接种了l.lactis subsp.lactis ljl7m20的腐乳样其蜡样芽孢杆菌数量为2.16log cfu/g。经感官品评，两者总体可接收度相近。
[0129]
由以上实施例可见，从毛豆腐中分离出来的菌株l.lactis subsp.lactis ljl7m20具有安全性较好的特点(实施例2、3和5)。且该菌株活力高、易于培养，具有耐酸、耐盐特性(实施例4和5)，具有应用到腐乳体系的价值。此外，该菌株产细菌素nisin，对腐乳工厂中分离的具有代表性的蜡样芽孢杆菌菌株具有显著的抑制效果(实施例5和6)。经腐乳工厂试验，发现菌株l.lactis subsp.lactis ljl7m20的应用可显著降低蜡样芽孢杆菌的数量，同时对腐乳风味没有不利影响(实施例7和8)。
[0130]
本发明不受上述实施例约束，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的替代方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)，其特征在于，保藏号为gdmcc no.62711。2.权利要求1所述的乳酸乳球菌乳酸亚种在腐乳制备中的应用。3.根据权利要求2所述的乳酸乳球菌乳酸亚种在腐乳制备中的应用，其特征在于，在灭菌后的培养基中接种乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactissubsp.lacti)，培育后离心，稀释到5-6log cfu/g，然后与毛霉菌液一起接种到豆腐白坯，25-30℃温度下发酵25-30h，加盐腌制，得腐乳。4.根据权利要求3所述的乳酸乳球菌乳酸亚种在腐乳制备中的应用，其特征在于，所述乳酸乳球菌乳酸亚种的培养基为m17、mrs和豆腐黄浆水，初始p h值为6-9。5.根据权利要求3所述的乳酸乳球菌乳酸亚种在腐乳制备中的应用，其特征在于，所述培养基的灭菌方法为120-125℃灭菌10-30min。6.根据权利要求3所述的乳酸乳球菌乳酸亚种在腐乳制备中的应用，其特征在于，所述培养基中乳酸乳球菌乳酸亚种的接种量为3-10wt％。7.根据权利要求3所述的乳酸乳球菌乳酸亚种在腐乳制备中的应用，其特征在于，所述的乳酸乳球菌乳酸亚种在培养基中接种的方法是25-35℃的温度下培养18-30h后，在3000-8000g的转速下离心10-30min，倾去上清液，加入0.85-2wt％的无菌食盐水，制成乳酸乳球菌乳酸亚种菌悬液。8.根据权利要求7所述的乳酸乳球菌乳酸亚种在腐乳制备中的应用，其特征在于，稀释后的乳酸乳球菌乳酸亚种菌悬液的浓度为5-6log cfu/g；毛霉菌悬液的浓度为5-6log cfu/g；乳酸乳球菌乳酸亚种菌悬液与毛霉菌悬液按1:1-2体积比接种到豆腐白坯。9.根据权利要求3所述的乳酸乳球菌乳酸亚种在腐乳制备中的应用，其特征在于，所述的乳酸乳球菌乳酸亚种在豆腐白坯中的接种量为1-3ml/100g。10.根据权利要求3所述的乳酸乳球菌乳酸亚种在腐乳制备中的应用，其特征在于，所述的腐乳毛坯加入8-12％的食盐腌制3-12h后装瓶，在15-32℃温度下后熟45-60天。

技术总结
本发明公开了一种乳酸乳球菌乳酸亚种及其在腐乳制备中的应用。该乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubsp.lactis)的保藏号为GDMCCNo.62711。该菌株对氨苄西林、万古霉素和氯霉素等9种抗生素敏感，安全性符合EFSA的要求，不产尸胺、腐胺等毒性代谢物。该菌株生长速度快，活力高，最大活菌数高达12.64LogCFU/mL，且具有较好的耐酸性、耐盐性。该菌株上清液对腐乳工厂中产生物膜能力不同的代表性蜡样芽孢杆菌均有较好的抑制效果，经模拟工厂发酵条件，接种该菌株发酵腐乳毛坯，测定表明蜡样芽孢杆菌菌数下降1.48LogCFU/g。孢杆菌菌数下降1.48LogCFU/g。孢杆菌菌数下降1.48LogCFU/g。


技术研发人员：李理 冼佳露 金泽坤 周朝晖 刘传运 李铁桥 卢丽玲
受保护的技术使用者：广东珠江桥生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/8/5