一种活性多肽CATH-AW2及其编码基因与应用

一种活性多肽cath-aw2及其编码基因与应用
技术领域
1.本发明涉及一种活性多肽cath-aw2及其编码基因与应用，属于生物医学技术领域。


背景技术：

2.近年来，随着传统抗生素的大规模和不恰当使用，微生物对传统抗生素产生了越来越强的耐药性。目前应对微生物耐药的唯一手段是使用新型或者替代性的抗生素药物，这就需要持续开发新型抗微生物剂。但是临床对新抗生素的需求和新药研发之间存在越来越大差距，发现新抗生素并引入市场越来越有挑战。尽可能保护既有抗生素，如研发抗菌佐剂，为减少这样的矛盾提供了新路径。抗菌佐剂是本身不具有抗菌活性，但是能提高其他抗菌药物活性的化合物，它们要么阻止耐药性的产生，要么促进宿主对感染的响应。
3.两栖类动物皮肤裸露，易于受到周围环境中病原菌的攻击，与此同时，两栖类动物获得性免疫系统不健全，更多的依赖先天免疫系统抵御病原菌侵袭。活性多肽作为先天免疫系统的重要分子，在两栖类动物体内种类多样，且含量丰富。到目前为止已从各种两栖类动物体内发现数百种结构和功能不同的活性多肽分子，并且其数目还在不断增加。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供一种从武夷湍蛙体内提取所得的具有显著的抗菌佐剂活性和极低的溶血活性的新型活性多肽cath-aw2，以及编码这条多肽的核酸序列。
5.本发明的第一个目的是提供一种活性多肽cath-aw2，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
6.本发明的第二个目的是提供一种所述活性多肽cath-aw2的编码基因。
7.进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明的第三个目的是提供一种携带所述编码基因的表达载体。
9.本发明的第四个目的是提供一种表达所述活性多肽cath-aw2的重组细胞。
10.进一步地，所述重组细胞为微生物细胞、动物细胞或植物细胞。
11.本发明的第五个目的是提供所述活性多肽cath-aw2作为抗菌佐剂的应用。
12.进一步地，所述的应用是将所述活性多肽cath-aw2添加至含有抗菌活性物质的抗菌剂中，与抗菌活性物质联用。
13.进一步地，所述抗菌活性物质为抗菌肽和/或抗生素。
14.本发明的第六个目的是提供一种抗菌组合物，所述抗菌组合物中含有所述活性多肽cath-aw2和抗菌活性物质。
15.进一步地，所述抗菌活性物质为抗菌肽和/或抗生素。
16.进一步地，所述抗菌组合物可用于制备药物、杀菌剂、抗微生物制剂、动物饲料、化妆品和防腐保鲜剂。
17.本发明的有益效果是：
18.本发明的武夷湍蛙活性多肽cath-aw2和含有该多肽的组合物可以用作协同抗菌和抑制细菌生长的药物、杀菌剂、抗微生物制剂、动物饲料、化妆品和防腐保鲜等领域。
19.本发明的武夷湍蛙活性多肽cath-aw2的编码基因，可以应用于多肽重组表达、转基因动物、植物、植物部分、动物细胞或植物细胞中。
20.本发明的武夷湍蛙活性多肽cath-aw2可以显著提升抗生素和抗菌肽的杀菌效果，且具有较小的细胞毒性和溶血活性，因此具有广泛的应用前景。
具体实施方式
21.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
22.实施例1：武夷湍蛙活性多肽cath-aw2编码基因克隆
23.(1)武夷湍蛙皮肤总rna提取：
24.①
取200mg武夷湍蛙背部皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到ep管中，加入1ml总rna提取缓冲液(trizol，美国life公司产品)，充分混匀，而后于4℃，12000rpm离心10min。
25.②
离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。
26.③
上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75％(v/v)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为武夷湍蛙皮肤总rna。
27.(2)武夷湍蛙皮肤cdna二链合成：采用clontech公司in-fusion smarter
tm directional cdna library construction kit合成。
28.1)cdna第一链合成(mrna反转录)：
29.①
rnase-free的pcr管中加入1μl武夷湍蛙皮肤总rna、1μl 3’端一链合成引物(3’in-fusion smarter cds primer)和2.5μl rnase-free水使总体积达到4.5μl，混匀后短暂离心(2000rpm，30s)，离心后于72℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。
30.②
在上述离心管中加入以下试剂(均为clontech公司in-fusion smarter
tm directional cdna library construction kit建库试剂盒中配备)，2.0μl 5
×
第一链缓冲液、0.25μl 100mm dtt、1.0μl 10mm dntp mix、1.0μl smarter v oligonucleotide、0.25μl rnase inhibitor和1.0μl smartscribe reverse transcriptase反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心(2000rpm，30s)，在42℃保温90min，然后68℃保温10min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cdna第一链备用。
31.2)采用长末端聚合酶链式反应(ld-pcr)方法扩增第二链(所用试剂均为clontech公司in-fusion smarter
tm directional cdna library construction kit建库试剂盒中配备)
32.①
将2μl cdna第一链(mrna反转录)、80μl去离子水、10μl 10
×
advantage 2pcr缓冲液、2μl 50
×
dntp混合物、2μl 5’pcr引物、2μl cds iii/3’pcr引物以及2μl50
×
advantage 2polymerase mix在95℃预热的pcr管中进行混合。
33.②
在pcr仪中按以下程序扩增：
34.95℃，1min；18个循环：95℃，15sec，65℃，30sec，68℃，6min。循环结束后，将离心
管中合成的cdna双链－80℃保存。
35.(3)武夷湍蛙活性多肽cath-aw2编码基因克隆：
36.根据两栖类动物皮肤活性多肽信号肽区的保守序列，人工设计合成正向引物5
’‑
atggagatctggcagtgtgtgatat-3’(seq id no.3)，反向引物为clontech公司in-fusion smarter
tm directional cdna library construction kit中的3
’‑
pcr引物，其序列为5
’‑
cggggtacgatgagacaccat-3’(seq id no.4)。pcr反应在如下条件下进行：95℃4min，95℃30sec，57℃30sec和72℃1min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pmd19-t载体(takara,大连)，转化dh5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素筛选，挑取单菌落用m13引物pcr检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用applied biosystems dna sequencer,model abi prism 377进行核苷酸测序。
37.测定结果：
38.编码武夷湍蛙活性多肽cath-aw2前体的编码基因自5’端至3’端序列为(seq id no.2)：
39.atggagatct ggcagtgtgt gatatggatc tgcgcagtca cattggaggt ggctcactct 60
40.cagtctccag atcaggaag gacggatcag agaggctctgg atctctacaa cctgagggag 120
41.gatgtcctct atttctataa acctctggag gaccttccag ccatacctgt gcaggaggaa 180
42.acaaaggatg aaatcctgag atttggaata atggagacgag gtgtctgaag tcggaggga 240
43.ggtgacgcag cgcggtgtga atataaatcg gatggggaag ttaaaatctg tgatctgaac 300
44.ctgactgcac ccggcaaaga gaacctgcag tgtgacatca taaccaagat ttcaagggtg 360
45.agacgagctg gcagatcccg tggcagatcc cgcggcagac cccccggcag accacgcctt 420
46.ccaggcctta acaaccccat tgcaggcata ccaggcagaa aatagtgggc ggtccttcaa 480
47.tgaagagaag agaaatggat tccatggaac gttctctatg aaatgtcaca taaaggagta 540
48.aaataaagaa tgaaaatgat gccaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 593
49.武夷湍蛙活性多肽cath-aw2前体的编码基因核苷酸序列表为：序列长度为593个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cdna，来源：武夷湍蛙皮肤。编码武夷湍蛙cath-aw2成熟肽的为第361-462位核苷酸。
50.实施例2：cath-aw2的制备
51.(1)cath-aw2的化学合成方法：根据编码基因推导的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433a,applied biosystems)合成其全序列，通过hplc反相柱层析脱盐纯化。
52.(2)分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)。
53.(3)纯化的多肽用高效液相色谱hplc方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
54.cath-aw2是基因编码的一种小分子多肽，由34个氨基酸残基组成，分子量3687.24da，等电点12.95，其氨基酸序列为(seq id no.1)：
55.arg
1-arg
2-ala
3-gly
4-arg
5-ser
6-arg
7-gly
8-arg
9-ser
10-arg
11-gly
12-arg
13-pro
14-pro
15-gly
16-ar g
17-pro
18-arg
19-leu
20-pro
21-gly
22-leu
23-asn
24-asn
25-pro
26-ile
27-ala
28-gly
29-ile
30-pro
31-gly
32-arg
33-lys
34
。
56.实施例3：cath-aw2抗菌活性检测
57.微生物菌株接种到mh液体培养基(oxoid，英国)中，37℃振荡培养到对数生长期，用新鲜mh液体培养基将菌液稀释到2
×
105cfu/ml备用。在无菌96孔板(thermo，美国)各孔中预先加入100μl mh液体培养基，然后在第一孔中加入100μl用mh液体培养基稀释的cath-aw2样品溶液，混匀后取100μl加入第2孔，依次倍比稀释(参见表1)，自第9孔吸出100μl弃去，第10孔做为对照管。
58.表1稀释方法
[0059][0060]
将96孔板放置37℃培养箱中缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收，计算样品对不同微生物的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration)值。结果如表2所示。
[0061]
由表2可见，cath-aw2本身对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌无抗菌活性。mic值均大于100μg/ml。
[0062]
表2 cath-aw2抗菌活性
[0063][0064]
实施例4：cath-aw2增强抗菌肽抗菌活性
[0065]
本实验选用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌cmcc26003，cath-aw1是申请人从武夷湍蛙体内发掘的一种有效的广谱抗菌肽(cn104910266a)。金黄色葡萄球菌cmcc26003用mh液体培养基(苏州阿尔法生物实验器材有限公司)在37℃培养12小时，然后用新鲜的mh液体培养基稀释成1
×
106cfu/ml的菌悬液。将溶解于灭菌的去离子水中的cath-aw1样品加入到菌悬液中，使终浓度为0.5
×
mic(1.17μg/ml)，另外一组除了cath-aw1外加入cath-aw2，多肽终浓度为100μg/ml，加入样品的菌液放置于培养箱中37℃培养箱中震荡培养，分别在0、2、4、8、12小时取50μl菌液稀释1000倍，然后取50μl稀释的菌液涂布到mh固体培养基上，37℃培养箱培养过夜后菌落计数。该实验用灭菌的去离子水作为阴性对照。
[0066]
结果如表3所示，单独0.5
×
mic浓度的cath-aw1的杀菌能力有限，但是加入cath-aw2后，在4小时内即可有效杀灭所有细菌，表明无抗菌活性的cath-aw2对于cath-aw1具有显著的杀菌增效能力。
[0067]
表3 cath-aw2增强抗菌肽cath-aw1抗菌活性
[0068][0069]
实施例5：cath-aw2增强多肽类抗生素的抗菌活性
[0070]
多粘菌素b是一种临床抗生素，对绿脓杆菌、大肠杆菌、克雷伯氏杆菌及嗜血杆菌等多种革兰氏阴性菌有抑制作用，但对于革兰氏阳性菌的抑制效果略弱。万古霉素是针对革兰氏阳性菌的抗生素，但临床大量使用会诱导耐药性的出现。本实施例选用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌cmcc26003测定cath-aw2和多粘菌素b、万古霉素联用后的杀菌效果，菌液浓度调整为5
×
107cfu/ml，将溶解于灭菌的去离子水中的两种抗生素样品分组加入到菌悬液中，使终浓度为1
×
mic(分别为18.75μg/ml和0.29μg/ml)，另外两组除了抗生素外加入cath-aw2，多肽终浓度为100μg/ml，加入样品的菌液放置于培养箱中37℃培养箱中震荡培养，分别在0、2、4、8、10、12小时在多功能酶标仪(瑞士帝肯spark)上测定600nm下的吸光度。该实验同时设置pbs组(加菌不加药，加等体积的pbs缓冲液)和空白对照组(不加菌和药，只含灭菌的mh培养基)。
[0071]
药物的抑菌率％＝a
(pbs组-药物组)
/a
(pbs组-空白对照组)
×
100％
[0072]
结果如表4所示，单独1
×
mic浓度的多粘菌素b和万古霉素的杀菌能力有限，加入cath-aw2后，在12小时内可以提升一倍的抑菌效率，其中协同万古霉素的抑菌率可以接近99％，远超过单独作用组，因此可以表明无抗菌活性的cath-aw2对于两种抗生素具有显著的杀菌增效能力。
[0073]
表4 cath-aw2增强多肽类抗生素的抗菌活性
[0074][0075]
实施例6：cath-aw2增强临床研究阶段抗菌肽类药物的抗菌活性
[0076]
目前国内外处于临床研究阶段的抗菌肽类药物有30多种，我们选择其中3种用于本实验(omiganan、pleurocidin和msi-78)。选用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌cmcc26003测定cath-aw2和3种抗菌肽药物联用后的杀菌效果。实验方法同例5，该实验同时设置pbs组(加菌不加药，加等体积的pbs缓冲液)和空白对照组(不加菌和药，只含灭菌的mh培养基)。
[0077]
药物的抑菌率％＝a
(pbs组-药物组)
/a
(pbs组-空白对照组)
×
100％
[0078]
结果如表5所示，在较低的1
×
mic浓度下单独的抗菌肽药物组对细菌的抑制率均
低于25％，加入cath-aw2后，短时间内抑菌率均能超过50％，是单独抗菌肽组的两倍以上，其中协同pleurocidin的抑菌率可以接近99％，远超过单独作用组，因此可以表明无抗菌活性的cath-aw2对于临床研究阶段抗菌肽类药物具有显著的杀菌增效能力。
[0079]
表5 cath-aw2增强临床研究阶段抗菌肽类药物的抗菌活性
[0080]
抗菌肽2h4h6h8h10h12homiganan12.87％28.81％16.99％16.57％18.80％15.50％omiganan+aw250.07％72.58％55.13％53.29％47.64％41.98％pleurocidin47.54％23.65％15.56％14.01％7.81％1.60％pleurocidin+aw285.53％92.63％96.89％98.31％99.86％99.42％msi-7851.77％12.24％23.29％25.68％18.61％9.80％msi-78+aw271.29％86.44％65.87％60.27％49.49％38.35％
[0081]
实施例7：cath-aw2溶血活性和细胞毒性测试
[0082]
(1)cath-aw2溶血活性测定：
[0083]
将采集的新鲜c57小鼠血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成10
7-108cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的cath-aw1样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用triton x-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比h％＝a
样品-a
阴性对照
/a
阳性对照
×
100％，当cath-aw2浓度为200μg/ml时溶血活性仅有1.47％，说明cath-aw2对哺乳动物红细胞具有极低的溶血活性。
[0084]
表6 cath-aw2溶血活性
[0085]
cath-aw2(μg/ml)溶血活性(％)12.51.18251.19501.401001.422001.47
[0086]
(2)cath-aw2细胞毒性测定：
[0087]
使用raw 264.7(小鼠巨噬细胞系)、4t1(小鼠乳腺癌系)、hepg2(人类肝细胞癌)和b16(小鼠黑色素瘤细胞系)通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(mtt)法测定cath-aw2的体外细胞毒性。细胞培养在含有10％胎牛血清(corning)和100u/ml链霉素-青霉素(上海碧云天生物有限公司)的dmem完全培养基中培养，正式实验前，将细胞接种在96孔板中(2
×
104/孔)并培养过夜，然后加入不同浓度的cath-aw2并在37℃5％的二氧化碳细胞培养箱孵育24小时。孵育结束后96板的每个孔添加20μl 5mg/ml mtt，再培养4h后丢弃上清液，并加入dmso于490nm波长处测定光吸收值。调零组只加了dmem培养基，阴性对照组仅加了细胞没有给药，细胞毒性百分比c％＝a
样品-a
调零组
/a
阴性对照-a
调零组
×
100％。实验结果如表7所示，当cath-aw2给药浓度为200μg/ml时，细胞存活率4t1细胞最低为59.7％，其余3株细胞均高于75％，表明使用cath-aw2在高浓度下对哺乳动物细胞毒性也非常弱，表现出巨大的应用潜力。
[0088]
表7 cath-aw2细胞毒性活性
[0089][0090][0091]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

技术特征：
1.一种活性多肽cath-aw2，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.1所示。2.一种权利要求1所述活性多肽cath-aw2的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。4.一种携带权利要求2或3所述编码基因的表达载体。5.一种表达权利要求1所述活性多肽cath-aw2的重组细胞。6.权利要求1所述活性多肽cath-aw2作为抗菌佐剂的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用是将所述活性多肽cath-aw2添加至含有抗菌活性物质的抗菌剂中，与抗菌活性物质联用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗菌活性物质为抗菌肽和/或抗生素。9.一种抗菌组合物，其特征在于，所述抗菌组合物中含有权利要求1所述活性多肽cath-aw2和抗菌活性物质。10.根据权利要求9所述的抗菌组合物，其特征在于，所述抗菌组合物用于制备药物、杀菌剂、抗微生物制剂、动物饲料、化妆品或防腐保鲜剂。

技术总结
本发明公开了一种活性多肽CATH-AW2及其编码基因与应用。本发明的武夷湍蛙来源多肽CATH-AW2分子量为3687.24Da，等电点为12.95，由34个氨基酸残基组成，该武夷湍蛙来源多肽CATH-AW2不具有直接抗菌活性，但是作为一种抗菌佐剂可以显著提升抗生素和抗菌肽的杀菌效果，且具有较小的细胞毒性和溶血活性，因此具有广泛的应用前景。有广泛的应用前景。


技术研发人员：王义鹏 叶子凡 汪旭 李双宇
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/8/5