一株党参内生细菌的分离方法及其应用

1.本发明涉及微生物应用技术领域，特别是党参根内生菌c.p-8及其应用。


背景技术：

2.在最近的研究中，从党参根中分离出的结构化合物具有多种药用和治疗特性，例如免疫调节作用、抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎，还用作胃保护、益生元、降血糖、保肝、雷诺保护和神经保护元素。内生菌在药用植物中发挥着重要作用，因为它们积累了次生代谢物。这些内生菌能够转化药用植物中的活性代谢物。然而，没有关于党参内生菌及其对人类病原体的抗菌活性的信息。


技术实现要素：

3.本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一株党参内生细菌的分离方法及其应用。
4.本发明内生细菌经鉴定为固氮假单胞菌（pseudomonas azotoformans），简称c.p-8。该菌株已于2022年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmcc no .25215。该内生菌是从党参根中分离得到的产氮假单胞菌pseudomonas azotoformans。本发明是通过如下技术方案实现的：一种党参内生细菌的分离方法，包括以下步骤：s1从健康植物中采集党参根部完好的样品，放入无菌拉链袋中，立即移至实验室，置于4℃冰箱中备用；s2：将采集的党参根部清洗干净，依次乙醇、naocl、无菌蒸馏水对根部进行表面消毒，然后在超净工作台中用用无菌蒸馏水冲洗若干次；s3:取最终冲洗无菌水接种到营养琼脂培养基（nam）上以检查表面消毒情况；s4:用无菌手术刀将根样品切成小块并放置营养琼脂培养基，然后在 37℃下孵育24小时；s5:根据菌落形态，将不同形态的内生菌分离到nam上，并按上述方法孵育，直到获得单一培养；s6: 根据菌落形态分离内生菌，进行形态鉴定和分子鉴定。
5.进一步的，所述党参内生细菌在抗菌活性中的应用。
6.进一步的，所述党参内生细菌在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌中抗菌活性的应用。
7.与现有技术相比，本发明的有益之处为：1、本发明首次从党参根中分离的内生菌c.p-8，即固氮假单胞菌，对人类病原体，例如枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，具有广谱和显著的抗菌活性；2、本发明从党参根中分离的内生菌c.p-8，通过分泌到胞外的酶如淀粉酶、纤维素
酶、几丁质酶和蛋白酶，对其它微生物（如人体致病细菌）的细胞结果产生破坏作用，从而抑制致病细菌的活性。
附图说明
8.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
9.图1为党参内生细菌c.p-8在显微镜下的形态。
10.图2为党参内生细菌c.p-8对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性图谱。
11.图3为对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈半径长度（mm）。
具体实施方式
12.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
13.实施例1实施党参内生菌c.p-8的采集、分离、纯化和鉴定。
14.样品采集从健康植物中采集党参根样品，放入无菌拉链袋中，立即移至实验室，置于便携式 4℃ 冷藏室中，置于4℃冰箱中备用。
15.内生菌的分离采集的党参根部用自来水冲洗，直至根部的泥土完全去除，根部完好无损。然后，用70% (v/v)乙醇对根部进行表面消毒1分钟，然后用5%naocl（次氯酸钠）消毒10分钟，然后在超净工作台中用无菌蒸馏水冲洗5次。将大约100 μl 的最终冲洗水接种到营养琼脂培养基(nam)上以检查表面消毒情况。用无菌手术刀将根样品切成0.5
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0.5 cm 的小块并放置nam，然后在37℃ 下孵育24小时。根据菌落形态，将不同形态的内生菌分离到nam上，并按上述方法孵育，直到获得单一培养，将获得的单一菌种保存以供进一步研究。
16.形态鉴定根据菌落形态分离内生菌，使用标准程序对细菌分离物进行革兰氏染色，以分析细菌细胞结构并使用复合显微镜的100倍放大镜区分革兰氏阳性或阴性细菌，结果显示内生细菌c.p-8是革兰氏阴性菌（图1）。
17.分子鉴定按照说明书，使用细菌dna提取试剂盒（epicenter，madison，usa）分离细菌 dna。真菌dna也按照制造商的说明使用植物/真菌dna 分离试剂盒（norgen，biotex，thorold，canada）分离。细菌分离物的 16s its 区域通过27f (5' agagtttgatcctggctcag 3')和1492r (5'tacggctaccttgttacgactt 3') 扩增。pcr扩增通过以下步骤进行：在95℃，预变性5分钟，然后在95℃变性 1 分钟，然后在56℃退火， 72℃继续延伸10分钟。随后，将扩增的基因进行凝胶电泳，并使用axy prep dna凝胶提取试剂盒（axygen，usa）纯化基因并测序。其16s序列如seq id no .1所示。
18.通过blast程序（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）将该序列与参考序列比对并在形态学上进行比较，然后确认细菌c.p-8的鉴定为固氮假单胞菌。
19.内生菌分类鉴定c.p-8鉴定为固氮假单胞菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no: 25215，日期为2022.06.29。
20.实施例2抗菌活性分析为了进一步分析分离的内生菌对人致病菌大肠杆菌（atcc700728）、金黄色葡萄球菌（atcc6538）和枯草芽孢杆菌（atcc6033）的抗菌活性，购自宁波明舟生物科技有限公司.并按照实验室指南进行维护和保存。
21.细菌内生菌c.p-8在nam上生长24小时，然后将充满细菌培养物的环状培养基放置在已经扩散有人类病原菌的nam板的中心，并孵育24小时，通过抑制区的形成来分析抗菌活性。
22.具体的说，将党参内生菌c.p-8在nam培养基上培养，37℃培养24小时。接着，将切下来新鲜的带菌培养基，放置在预先铺有上述人类病原体的nam 板的中心，并在37℃下孵育24-48小时。最后，内生菌c.p-8的抗菌活性是通过菌落周围的清除区直径来计算的。
23.结果显示党参内生细菌c.p-8对上述三种人致病菌具有显著抗性（图2，图3）。c.p-8对金黄色葡萄球菌的抑菌区半径为26 mm，对枯草芽孢杆菌的抑菌区半径为21mm，而对大肠杆菌的抑菌区半径为4 mm，远远小于其他细菌（图2）；而阳性对照氨苄青霉素5
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g/ml对枯草芽孢杆菌的抑制效果为35 mm，对金黄色葡萄球菌的抑制效果为42.5mm，对大肠杆菌的抑制效果为17.5(见图3)。
24.实施例3c.p-8酶活分析淀粉酶活性采用标准dnsa(二硝基水杨酸)法进行定量分析。
25.将1.4g 3,5
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二硝基水杨酸加热溶解在70 ml 0.5n naoh溶液中制备dns试剂。然后，加入30克酒石酸钾钠(nakc4o6)加入4h2o)，将溶液调至1000 ml。随后，在试管中加入麦芽糖标准溶液和试验溶液(内生菌肉汤培养无细胞提取液)0.5 ml,0.5 ml 1% w/v的可溶性淀粉溶液和1 mldns试剂，在40℃下孵育15分钟，之后加入5 ml蒸馏水，冷却至室温，在540 nm处记录吸光度。本发明测定了淀粉中还原糖的量。
26.蛋白酶活性用酪蛋白溶液降解法对蛋白酶进行定量分析。细菌和真菌的培养液以5000转/分离心30分钟，无细胞上清视为酶溶液。0.5 ml酶溶液在5 ml 1% (w/v)酪蛋白溶液中(tris
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hcl，ph8.0)在80℃下孵育20分钟。然后，加入1.5 ml 0.3m三羧酸(tca)停止反应。随后，通过folin法和ciocalteu法测定酪氨酸氨基酸含量测定酪蛋白降解。
27.纤维素酶活性纤维素酶的定量分析采用羧甲基纤维素(cmc)法。细菌和真菌生长培养的无细胞培养液作为酶液。在ph
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5.8的磷酸盐缓冲液中加入1% cmc作为底物。取50
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l的酶液加入100
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l的cmc溶液中，40℃孵育20 min。然后在540 nm处用二硝基水杨酸(dns)法测定溶液中还原糖的含量。
28.几丁质酶活性采用以下方法制备胶体甲壳素：将80 g甲壳素慢慢加入1000 ml的浓盐酸中，室温
下连续搅拌2小时。然后加入2 l蒸馏水，在4℃下孵育过夜，过滤得到沉淀。3 l的水被传递到胶状甲壳素饼中以获得ph=7.0。然后，将胶体几丁质饼冻干成粉。以300
ꢀµ
l 0.1%的甲壳素胶体粉为底物，150
ꢀµ
l的细菌和真菌无细胞培养液作为酶液，150
ꢀµ
l的0.1m磷酸缓冲液对甲壳素进行定性分析。反应混合物在55℃下孵育10分钟，在10,000 rpm下离心5分钟。随后，加入200
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l的反应混合物+ 500
µ
l的蒸馏水+ 1000
µ
l的schale’s 试剂，90℃孵育10 min。然后，冷却后的还原糖量在420 nm处测定吸光度。
29.对分泌到胞外的酶如淀粉酶、纤维素酶、几丁质酶和蛋白酶产量进行定量分析，本发明中c.p-8所产淀粉酶、纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶活分别为：0.36 u/ml、1.3 u/ml、1.13u/ml和0.05u/ml。这些酶会对其它微生物（如人体致病细菌）的细胞结果产生破坏作用。对酶学的研究将更清楚地支持其抑菌活性。因此，本发明的外泌酶的活性可以与c.p-8抗菌圈产生关联。
30.seq id no .1tgcagtcgagcggtagagagaagcttgcttctcttgagagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggataacgttcggaaacggacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtggggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggttgtagattaatactctgcaattttgacgttaccgacagataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggtttgttaagttggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcaaaactgactgactagagtatgtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactaatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttggaagccttgagcttttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatccaatgaactttccagagatggattggtgccttcgggaacattgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgtaatggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggtgccaagccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagctagtctaaccttcgggaggcacaggta本发明中使用的所有技术和科学术语在本发明所涉及的领域内具有常规含义。在本发明中，虽然仅描述了优选的方法和材料，但与此处描述的方法和材料相似或等效的任何方法和材料也可以用于本发明中提到的实践或测试。公开和描述方法和材料供参考。如果文件之间发生冲突，以本规范的内容为准。
31.在不脱离本发明的范围和领域的情况下描述了本发明。从本发明的描述和实施例中得出的事实对于本领域技术人员来说将是显而易见的。描述和规范仅仅是示例性的。

技术特征：
1.一种党参内生细菌的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：s1从健康植物中采集党参根部完好的样品，放入无菌拉链袋中，立即移至实验室，置于4℃冰箱中备用；s2：将采集的党参根部清洗干净，依次乙醇、naocl、无菌蒸馏水对根部进行表面消毒，然后在超净工作台中用用无菌蒸馏水冲洗若干次；s3:取最终冲洗无菌水接种到营养琼脂培养基上以检查表面消毒情况；s4:用无菌手术刀将根样品切成小块并放置营养琼脂培养基，然后在 37℃下孵育24小时；s5:根据菌落形态，将不同形态的内生菌分离到nam上，并按上述方法孵育，直到获得单一培养；s6: 根据菌落形态分离内生菌，进行形态鉴定和分子鉴定。2.根据权利要求1所述的党参内生细菌在抗菌活性中的应用。3.根据权利要求1所述的党参内生细菌在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌中抗菌活性的应用。

技术总结
本发明公开了一株党参内生细菌的分离方法及其应用，该方法包括党参内生菌C.P-8的采集、分离、纯化和鉴定，首次从党参根中分离的内生菌C.P-8，即固氮假单胞菌，该党参内生菌C.P-8对人类病原体，例如枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，具有广谱和显著的抗菌活性；此外，从党参根中分离的内生菌C.P-8，可以分泌到胞外的酶如淀粉酶、纤维素酶、几丁质酶和蛋白酶，酶活分别为：0.36U/ml，1.3U/ml，1.13U/ml，0.05U/ml，推测这些酶会对其它微生物（如人体致病细菌）的细胞结果产生破坏作用，从而抑制致病细菌的活性。制致病细菌的活性。制致病细菌的活性。


技术研发人员：洛迪
受保护的技术使用者：山东省农业科学院
技术研发日：2022.11.14
技术公布日：2023/8/5