用于细胞或组织培养或在体外测试肌肉组织的设备的制作方法

1.本发明涉及用于细胞培养、组织培养的设备或用于在体外测试细胞或组织的设备。特别地，本发明涉及用于在体外测试肌肉组织对外部电刺激的反应的设备。


背景技术：

2.在药物研究的领域中，许多药物进行心脏毒性测试。许多(新的)药物影响心肌收缩和轮廓，因此产生毒性作用。药物诱导的心脏毒性是一些临床上重要的药物已经遇到的主要副作用。这种毒性先前已经导致许多药理学活性药物上市后退出，并限制了其他临床上有用的药物的功效。由于心血管安全问题，过去四十年中几乎10％的药物已经从全世界临床市场召回。
3.药物诱导的心脏毒性是临床前和临床开发中排斥化合物的重要原因。其表示与新型药物开发相关联的最严重副作用之一，并且已知其是由几种类型的药物诱导的主要毒性作用之一。评估药物诱导的心脏毒性风险(包括qt间期延长)目前被认为是新化学实体的标准临床前评价的组成部分。
4.心脏毒性可以在动物模型中(例如在大鼠中)测试。然而，这些模型具有缺点，并且不总是很好地预测在人类中的作用。这可能导致丢弃潜在的有益药物，但也导致在对人类的现场试验中接受潜在的毒性药物。
5.评估心脏毒性的另一种方法是在体外测试药物的作用。将药物加入到体外生长的心肌细胞的集合体中。此后，研究对电刺激的作用。
6.这种现有技术设备的示例是heartdyno(商标)设备。该设备由在底部处有两个小柱的椭圆形孔组成。这些设备使用薄膜技术来产生。模具是经由su-8光刻法在晶片上制成的，产生700μm深的特征。pdms浇铸在这些特征上并固化。在从晶片移除pdms之后，对6mm直径的样品进行冲压。
7.例如，将这些样品置于96孔板的孔内，并使用硅酮胶粘合到底部。将心肌细胞、心肌成纤维细胞、胶原、dmem、naoh和基质胶的混合物添加到孔中。在几天内形成心肌细胞组织。组织表现出自发收缩，但是在电刺激期间也收缩。在收缩期间，两个柱偏转，并使用视频分析算法分析偏转。
8.us2019/316068公开了一种与生成3d心脏组织有关的设备。


技术实现要素：

9.将设备粘合在孔板的孔内是一个繁琐的过程。难以以无菌方式实现这一点，并且其需要额外的制造步骤。此外，设备需要以使得柱在每个孔中以相同的方式取向的方式对准，这需要额外的小心。所提出的解决方案是将设备“夹”在孔细胞板的孔内。这可以通过由弹性体材料产生设备来完成，该设备具有比孔稍微更大的外径，因此它将通过剪切应力保持就位。然而，以这种方式，设备的负空间将变形，并且这可能致使它不可用。
10.本发明由权利要求限定。
11.根据依据本发明的一个方面的示例，提供了一种用于在体外测试肌肉组织的设备，所述设备包括：
12.基部部分；
13.两个柱，每个柱从所述基部部分突起；以及
14.壁部分，其具有围绕所述柱的内壁表面以及外壁表面，其中，所述壁部分包括从所述外壁表面向外延伸到所述设备的外周边的至少两个肋元件。
15.可以电刺激体外心肌组织收缩，以便模拟体内心脏组织的行为。组织可以在两个柱之间和周围生长，使得当组织收缩时，两个柱偏转。可以测量由偏转引起的柱的位移，以确定来自组织收缩的力。
16.通常，将用于在体外测试肌肉组织的设备放入微孔板的孔中。为了将设备保持在孔中，可以将测试单元的外周边制成为稍微大于孔的直径，使得剪切应力将设备保持就位。然而，这可能引起壁部分的内径变形。
17.为了避免或减少内壁表面变形，将肋元件添加到壁部分以避免或减少内壁表面变形，同时在不使用胶水的情况下保持足够高的剪切应力以在设备使用期间将设备保持就位。肋元件的外径(在设备的外周边处)可以大于基部部分的外径，以便进一步减少设备的变形。
18.柱可以比壁部分更高，或壁部分可以比柱更高。替代地，柱和壁部分具有相同的高度。类似地，壁部分可以具有与肋元件相同的高度，或肋元件可以具有与壁部分不同的高度(例如，更高或更短)。每个肋元件可以具有相同的高度或不同的高度。
19.可以存在在包括所述基部部分的虚拟平面内的至少两个非平行方向上延伸的两个、三个、四个或更多个肋元件。然而，在一个优选示例中，存在四个肋元件。对称设计具有彼此间隔开90度的径向延伸的肋元件。
20.然而，不对称设计可以与两对直径上相对的肋元件一起使用，但是其中，两对彼此不正交(因此形成非垂直交叉)。
21.这形成了肋元件的交叉形状，以提供在来自任何方向的剪切应力下不会变形的结构。
22.内壁表面可以是椭圆形的或甚至矩形的，因此是具有非统一纵横比的形状。
23.这种非统一纵横比促使组织在与柱之间的分开间隙一致的收缩方向上生长。
24.收缩方向是组织收缩的方向。因此，通过具有与柱之间的间距一致的收缩方向，组织将使柱朝向两个柱之间的中心点偏转。
25.所述肋元件的高度可以至多与所述壁部分的高度相同。所述壁部分的所述高度可以至多为2000μm。
26.所述柱的高度可以为至少500μm且至多2000μm。
27.所述设备可以基于以下来制造：
28.注射成型；
29.注射压缩；
30.转送成型；或
31.压花。
32.当与手工铸造相比时，使用这些方法中的一种来批量制造柱，以便减少来自制造
方法的柱刚度的扩展并增加生产率。
33.该设备(或仅柱、基部部分和/或肋元件)可以由硅橡胶制成。硅橡胶可以包括elastosil 3040/30。
34.柱可以朝向远端渐缩，并且柱的远端可以是圆形的或部分圆形的。
35.使柱渐缩允许(制造过程的)脱模步骤更可靠。类似地，柱的圆形远端进一步增加脱模步骤的可靠性。
36.用于制造柱的材料的杨氏模量可以为至少0.5mpa且至多5mpa。例如，杨氏模量在1mpa和2mpa之间。柱的刚度将取决于柱的杨氏模量和几何结构。
37.然而，还存在也与柱的功能有关的其他材料性质。拉伸强度(例如9.0n/mm2)和最大伸长率(例如断裂时600％)是两种这样的相关性质。这些性质的组合使得可以脱模具有接近5(或甚至更高)的纵横比的柱结构，并且还允许蘑菇几何结构的脱模。
38.因此，使用可注射成型等级的硅树脂给予了制造之后的可靠最终性能，具有容易放大的可能性，并且也适用于纵横比为5或更高的几何形状以便从工业模具释放。这在其他铸造解决方案的情况下是不可能的。
39.本发明还提供了用于在微孔板中在体外测试肌肉组织的设备集合，其中，所述设备集合使用多腔注射成型来制造，其中，每个腔对应于一个设备。
40.多次注射成型将增加设备的生产率，以及确保足够的模具流动和壁厚比。
41.本发明还提供了一种用于在体外测试肌肉组织的系统，所述系统包括：
42.阵列基部；
43.在所述阵列基部上的设备的阵列，其用于在微孔板中在体外测试肌肉组织，其中，所述阵列基部和设备的阵列被形成为单个单元。
44.例如，设备可以在阵列基部上以矩形阵列等间距排列。这允许在不需要多腔注射成型机的情况下制造多个设备。
45.所述系统还包括具有多个孔的微孔板，其中，所述阵列基部上的所述多个设备被定位成使得每个设备装配在所述孔中的相应孔内。
46.例如，使用开放底部微孔板，可以将具有设备的阵列的系统放置在微孔板下方，使得设备都装配在微孔板的孔内。该系统将被制造为装配在微孔板内(即，设备的外径将装配在孔内，并且设备的间距将与孔之间的间距相同)。
47.然后，肌肉组织可以在微孔板的孔中在设备的柱周围和壁部分内生长。
48.所述设备可以由弹性材料制成，并且每个设备的外周边可以比所述微孔板的孔的内周边大至多5％。
49.如果设备具有稍微大于孔的尺寸并且由柔性材料制成，则设备将能够装配在孔内，但是由于直径的差异将向设备提供剪切应力。直径的差异取决于用于制造设备的材料、在肌肉收缩期间将设备保持在孔中所需的剪切应力等。
50.所述系统还可以包括用于刺激肌肉组织的一对电极。
51.本发明还提供了一种制造用于在体外测试肌肉组织的设备的方法，所述方法包括：
52.使用模具来注射成型所述设备，所述模具限定：
53.基部部分；
54.两个柱，每个柱从所述基部部分突起；以及
55.壁部分，其具有围绕所述柱的内壁表面以及外壁表面，其中，所述壁部分包括从所述外壁表面向外延伸到所述设备的外周边的至少两个肋元件。
56.本发明的这些和其他方面将根据下文描述的(一个或多个)实施例而显而易见并将参考下文描述的(一个或多个)实施例得到阐述。
附图说明
57.为了更好地理解本发明并且为了更清楚地示出它可以如何被实施，现在将仅通过示例的方式参考附图，其中：
58.图1示出了具有两个渐缩柱的设备的表示；
59.图2示出了用于计算渐缩柱由于所施加的力的位移的模型柱；
60.图3示出了具有渐缩和圆形顶部的模拟柱；
61.图4示出了具有柱的设备的3d表示；
62.图5示出了利用注射成型制造的设备的俯视图；
63.图6示出了具有心肌组织的注射成型设备；
64.图7示出了第一实验的结果；
65.图8示出了第二实验的结果；
66.图9示出了设备的俯视图；
67.图10示出了具有围绕设备的外周边的肋元件的设备；
68.图11示出了具有利用注射成型制造的肋元件的设备；
69.图12示出了用于集成在孔细胞板中的设备的阵列；
70.图13示出了具有开放底部的96孔细胞板；
71.图14示出了利用多腔注射成型制造的多个设备；
72.图15示出了倒置柱设备；
73.图16示出了具有用于确定肌肉组织的高度定位的阶梯状结构的设备；
74.图17示出了图16的设备的平面视图；并且
75.图18示出了具有用于高度确定的锥形结构的设备。
具体实施方式
76.将参考附图来描述本发明。
77.应当理解，详细描述和具体示例在指示装置、系统和方法的示例性实施例时，仅旨在用于图示的目的，而不旨在限制本发明的范围。根据以下描述、所附权利要求和附图将更好地理解本发明的装置、系统和方法的这些和其他特征、方面和优点。应当理解，附图仅仅是示意性的，并未按比例绘制。还应当理解，在整个附图中使用相同的附图标记来表示相同或相似的部件。
78.本发明提供了一种用于例如在微孔板中在体外测试肌肉组织的设备，所述设备包括基部部分和两个柱，每个柱从所述基部部分突起。所述设备还包括壁部分，所述壁部分具有围绕所述柱的内壁表面以及外壁表面，其中，所述壁部分包括从所述外壁表面向外延伸到所述设备的外周边的至少两个肋元件。
79.图1示出了具有两个渐缩柱102的设备100的表示。柱102由柔性材料制成，柱102的形状被设计用于批量产生，并且柱102的形状和高度被调节为具有用于测试组织108的样品所需的材料性质。柱102的设计适于确保脱模。柱102是渐缩的，具有更宽的基部和更小的顶部。
80.柱102从基部部分104延伸并被包围在壁部分106的内表面内。柱102被设计为使得心脏组织108可以在柱102之间和周围生长。心脏组织108然后可以利用电极来收缩，并且心脏组织108由于电信号的收缩可以通过柱102的位移来测量。
81.图1a)示出了设备100的横截面，其中，心脏组织108在柱102之间没有收缩。图1b)示出了相同设备100，但是其中，心脏组织108收缩。柱102由于心脏组织108的收缩而位移。
82.图1c)从俯视图示出了当心脏组织108尚未收缩时的相同设备100。在该示例中，内壁表面是椭圆形的。通过在椭圆体腔中生长心脏细胞，组织108形成与柱102之间的间距一致的收缩方向。
83.设备100可以通过注射成型、3d打印、氨基甲酸乙酯铸造或压模铸造来制造。渐缩柱102允许用于注射成型、氨基甲酸乙酯铸造和压模铸造的更鲁棒的脱模方法，并且还允许从3d打印方法打印更稳定的结构。这些方法允许设备100的批量产生。将结合注射成型描述以下示例。然而，所公开的任何特征或优点也可以应用于其他制造方法。
84.在该示例中，基部部分被示出为在底部处。然而，情况并不总是如此，并且基部部分可以具有任何取向。
85.柱102可以具有长方体形状，并且在其一个、二个、三个或四个侧面上渐缩。例如，柱102的两个侧面(例如，向内面向组织和向外背向组织)可以是渐缩的，并且其他两个侧面可以垂直于基部部分104。柱102的精确锥度将取决于柱102本身的尺度，但是可以相对于基部部分104的垂直线在从1度锥度到20度锥度的范围内。
86.柱102可以替代地是圆柱形的，并且这样一来一个侧面将是渐缩的。类似地，柱102的精确锥度将取决于柱102本身的尺度，但是可以相对于基部部分104的垂直线在1度锥度至20度锥度的范围内。示例锥度将在0.5度和2度之间。
87.另外，渐缩柱102的远离基部部分的远端(即渐缩柱的顶端)也可以具有头部部分。柱头部将具有比柱102的其余部分更大的直径(在一个或两个维度上)，并且将阻止组织朝向柱的远端滑动并阻止其自身与柱断开。
88.对于注射成型的具有头部部分的设备100，柱102(在头部下方)再次优选地是渐缩的。柱的渐缩减小了在设备100脱模时柱102和模具之间的摩擦。用于制造柱的材料(即硅橡胶)的拉伸强度(例如7n/mm2至11n/mm2，优选地9.0n/mm2)和最大伸长率(例如断裂时400％至800％，优选地600％)使得可能脱模具有头部部分的柱结构。
89.由于渐缩柱102和模具之间的摩擦减小，移除具有头部部分的渐缩柱102所需的唯一显著的力是使柱头部弹性变形以装配穿过模具的最小截面所需的力。硅橡胶的性质(例如拉伸强度和最大伸长率)允许它以这种方式弹性变形，并且因此一旦它已经从模具移除就保持原始形状。也可以使用具有类似性质的其他材料。
90.头部部分的形状也可以设计为减小将它从模具中拉出所需的力。头部部分的形状也将取决于材料的性质、柱102的形状和柱上使用的锥度。例如，头部部分可以是圆形形状，例如甚至是直径大于(或等于)柱102的最大侧面的宽度的球形。具有头部部分的柱也可以
具有蘑菇状几何结构。
91.因此，使用可注射成型等级的硅树脂给予了制造之后的可靠最终性能，具有容易放大的可能性，并且也适用于具有头部部分的渐缩柱102。这在其他铸造解决方案的情况下是不可能的。
92.图2示出了用于计算渐缩柱102由于所施加的力的位移的模型柱102。柱102的渐缩影响柱102的刚度和弹性，并且这应当被补偿。在将设计转换成注射成型设计时，材料和几何结构的变化应当被补偿以保持柱102的正确刚度和弹性。改变柱102设计的设计的影响可以用模拟技术计算。
93.用于注射成型的普通软材料是具有肖氏硬度40a的elastosil 3040/30。用这种材料产生设备100影响柱102的弹性特性。已经执行模拟以估计这些效应，并提出了优化的设计。
94.使用注射成型增加了刚度的再现性，并且硬度好得多。来自sylgard 184的硅树脂由于固化的温度变化与两种组分以硅树脂a和交联剂b的期望比率(例如9：1)的混合的差准确性(并且因此重量差异)的组合而不太可靠。对于注射成型，组分a和b以1：1比率以大得多的量混合，并且化学计量不匹配最小。它也可以容易地放大。
95.在注射成型之后，elastosil 3040/30的反应将在模具中加热到150c或更高之后开始。sylgard 184的问题在于它在室温下开始固化。空闲时间对于sylgard 184来说也短，使得它更快变硬，使得在小腔中浇铸它可能是不可能的。在注射成型的情况下，混合物在加热的模具中加热并且在高压(即30mpa至60mpa)下具有低粘度，使得柱102的所有腔将被填充。
96.图2a)示出了用于测量当施加力时柱102上的应变的渐缩柱102的模拟。sylgard 184的典型弹性模量为1.45mpa，并且对于elastosil为1.4mpa。对于两种材料，使用2.2gpa的体积模量。在计算中采用neo-hookian近似。
97.图2b)示出了位移测量204的简化表示。柱102上的测量点202在3/4高度处。使用slygard184的设备在100μm位移下具有500um/n的刚度，因此elastosil柱102相对于sylgard 184柱的刚度在100μm位移下进行估计。
98.在图2a)的模拟中，在柱102的限定区域处施加分布力，并且柱102高度的1/2和3/4之间的区域经受该力。增加该力直到监测点(在柱102的3/4高度处)的水平位移达到100μm。柱102高度为800μm。
99.sylgard 184柱的刚度在100μm位移下导出，并且与elastosil 3040/30柱102的刚度进行比较。渐缩柱设计的刚度比slygard184柱高约2倍。这可以利用新的柱形状(即更高的柱102，不同的锥度角等)来解决。刚度的选择将取决于任何特定用户的需要。
100.例如，可以使用更高的柱102来补偿改变的刚度，使得柱102可以利用注射成型技术产生，使得设计适合于批量产生。
101.图3示出了具有渐缩和圆形顶部的模拟柱102。图3a)示出了具有800μm的高度的一对柱102。图3b)示出了具有900μm的高度的柱102。
102.圆形顶部设计比图2所示的参考配置硬15％。然而，因为这可以批量制造，所以刚度的扩展将低得多。为了完全补偿刚度变化，已经发现950-970μm高度的柱102是合适的。圆形顶部柱102能够更好地分布局部应力。矩形柱102具有更高的应力集中，这给出更大的变
化。
103.已经设计和制作了用于具有渐缩和圆形顶部的设备100的模具，并且设备100已经由该模具制成。发现以elastosil 3040/30材料脱模900μm柱102是成功的。
104.模具具有用于限定基部部分104的外壁(下侧)和壁部分106的外壁(径向面向外的外壁)的基部部分。顶部部分用于限定基部部分104的内壁(顶侧)、壁部分106的内壁(径向面向内的壁)和柱102，其中，顶部部分包括用于形成两个柱102的两个腔。
105.这些腔装配有插入件以限定柱，因此可以容易地改变形状以满足变化的产品要求。此外，这种生产方式确保了柱102的良好限定的顶部形状。可以在腔中使用不同的插入件以产生不同的柱形状(并且因此不同的刚度值)。
106.通过在椭圆体腔中生长细胞，肌肉组织108形成与柱102之间的间距一致(即，平行于连接两个柱中心的线)的收缩方向，但是最初细胞可能不附着于柱102。在该设备100中细胞外基质上的均匀细胞增殖成细胞的汇合层以形成肌肉组织108是关键步骤。
107.为了解决这个问题，可以用羧基修饰硅树脂柱102，使得细胞直接附着到柱102上是可能的。通过用亚油酸对硅树脂进行大量修饰，羧基被引入并在表面上具有活性，使得细胞可以粘附到柱102上。以这种方式，心肌细胞可以更好地生长到两个柱102之间的肌肉组织108中。
108.图4示出了具有柱102的设备100的3d表示。在该示例中，壁部分106的内表面具有椭圆形状。设备100可以被描述为具有腔，其中，腔内具有两个柱102(即，腔由壁部分106限定)。
109.另外，可以将柱头部添加到柱102的远端(顶端)，以避免肌肉组织108由于由收缩引起的肌肉组织108的移动而与柱102断开。如果选择合适的尺度，则不管柱头部如何，材料的弹性都将允许柱102脱模。
110.图5示出了利用注射成型制造的设备100的俯视图。可以在柱102附近和周围看到来自注射成型过程的标记。类似地，在该示例中，壁表面106的内表面是椭圆形的。
111.图6示出了具有心肌组织108的设备100。腔填充有凝胶(细胞外基质)，并且心肌细胞在凝胶的顶部上生长到肌肉组织108中。当组织108收缩时，柱102将移动，并且当柱102的顶部被提供有合适的指示物(例如，施加到柱顶部的颜色以使得显微镜能够更精确地聚焦)时，可以监测肌肉功能。
112.图7示出了第一实验的结果。该图形示出了跳动频率(y轴)与起搏(刺激)频率的曲线图。起搏频率是用于刺激肌肉组织108的电信号的频率，并且跳动频率是观察到肌肉组织108收缩的频率。
113.该实验涉及刺激设备100中的心肌组织108并将结果与其他设备进行比较。所形成的组织108用35v、10ms的脉冲持续时间和具有0.2hz的增量的起搏频率范围进行电刺激。使用以下等式计算肌肉收缩力：
[0114][0115]
等式1：其中：f＝力，e＝杨氏模量，b＝柱长度，h＝柱宽度，x＝柱上的组织在z方向上的位置，l＝柱的高度，δ＝位移。
[0116]
在图7a)和7b)中示出了获得的结果。图7a)示出了利用注射成型制造的五个渐缩
柱设备100的作为起搏频率(x轴)的函数的跳动频率(y轴)。图7b)示出了五个heartdyno设备上的作为起搏频率(x轴)的函数的跳动频率(y轴)。
[0117]
观察到渐缩设备与heartdyno设备相当或性能甚至更好，因为心肌细胞组织108更一致地响应于更高频率的起搏。用于图7a)中结果的渐缩设备也是圆形的。
[0118]
图8示出了第二实验的结果。该实验再次涉及刺激设备100中的心肌组织108。图8a)示出了七个渐缩柱状设备100的作为起搏频率(x轴)的函数的跳动频率(y轴)。图8b)示出了七个渐缩柱状设备100的归一化跳动频率(y轴)对比起搏频率(x轴)。可以看出，收缩幅度上升，这指示正力-频率关系。这是成熟心肌细胞的标志。
[0119]
这些结果表明，渐缩柱设备100的表现与heartdyno设备相当或比heartdyno设备稍微更好。此外，它们具有如下优点：由于使用了批量产生技术，所以刚度扩展更低。而且，由于使用了批量产生技术，所以成本可以较低。
[0120]
图9示出了设备100(柱102未示出)的俯视图。图9a)示出了适当地插入微孔板(即，孔细胞板)的孔中的设备100。图9b)示出了当设备100由于不适当地插入孔细胞板的孔中而变形时的设备100。如果使设备稍微大于孔细胞板中的孔(以避免使用胶水)，则能够发生这种变形。
[0121]
变形在图9b)中被夸大，并且可以在设备100以非理想的孔形状定位之后引起，从而引起内表面的不可预测的变形，并且因此影响细胞生长性能和再现性方面的部件间差异。
[0122]
图10示出了具有基部部分104、壁部分106和围绕设备100的外周边的肋元件1002(柱102未示出)的设备100。这使得可以使用与孔细胞板的孔的内表面相比稍微更大的设备100的外径，同时不使设备100的内表面变形。以这种方式，设备100相对于孔细胞板的剪切应力可以增加到不再需要将设备100粘合在孔细胞板中的这种点。因此，肋元件1002(在这种情况下，横肋)可以增加剪切应力并减少设备100的变形，特别是内表面的变形。
[0123]
设备100由弹性材料制成，其在施加外力时可以变形。在该壁部分106周围设计横肋1002阻止内壁表面在插入孔中时变形，同时保持剪切力足够高以避免在设备100和孔之间需要任何形式的粘合剂。
[0124]
除了消除使用胶的必要性之外，额外的益处包括设备100的柔性材料和集成的横肋1002将克服设备100的形状的公差问题或阵列的公差(克服了部件间变化)。在一些制造方法中，设备100和/或孔细胞板的脱模方向可以有助于增加剪切力或提供完整的机械锁定。
[0125]
在该示例中，示出了具有四个横肋1002的设备100。然而，设备100也可以具有两个横肋1002、三个横肋1002或多于四个横肋1002。
[0126]
图11示出了用注射成型制造的具有肋元件1002的设备100。设备100经由wacker elastosil lr 3040/40(肖氏硬度a40)的注射成型制成。设备100利用6.4mm冲头进行冲压，并且可以放置在内径为6.4mm的孔细胞板(例如具有96个孔)的孔中。
[0127]
已经发现，在长达9天的持续时间的生长和测试心脏组织的完整方案期间，在孔细胞板的孔内的设备100的剪切应力足够高以将设备100保持就位。
[0128]
图12示出了用于集成在孔细胞板中的设备100的阵列1202。除了单个设备100之外，设备100还可以产生为集成在材料板上的阵列1202。为此目的，产生材料薄板，其中，设
备100的阵列具有横肋1002。该薄板可以放置在具有开放底部的孔细胞板下方。以这种方式，阵列1202封闭孔细胞板并提供用于细胞培养的设备100。阵列1202可以是圆形、矩形或其之间的任何其他比例，这取决于要求。
[0129]
图13示出了具有开放底部的96孔细胞板。该孔细胞板可以用于图12所示的设备的阵列1202。替代地，也可直接使用集成到材料薄板上的阵列1202中的设备100，而不需要孔细胞板。在这种情况下，外壁直接在共用基部上限定阵列1202的设备100，并且该结构可以以一件的方式产生。外壁将用作孔细胞板中的孔的替代物。
[0130]
图14示出了利用多腔注射成型制造的多个设备100。
[0131]
产生一个薄板材料(阵列1202中的设备)需要大的注射成型机来填充柱102的大体积和小细节。注射成型在均匀的壁厚(例如，壁和柱102的厚度)下最佳地工作。如果它们相差大比率，即使当模具没有被完全填充时，小细节也将更快地凝固，并且大体积将通过聚合最慢地凝固。如果最小细节已经被凝固而更大体积仍然需要被填充，则可能发生不希望的情况。这将引起缺陷，并且在这种情况下，引起用于柱102的模具部件没有被完全填充的风险。
[0132]
该问题使得难以在大薄板中产生小细节(即柱102)。这可以通过平衡材料量和壁厚来解决。图14示出了若干单独的设备100，每个设备具有优化的壁厚和流动路径。要凝固的更小体积也改进了生产周期时间。
[0133]
通过制造单独的设备100，与具有柱细节的设备100的阵列1202相比，可以克服孔细胞板内的公差差异。产生阵列1202可能由于公差和收缩差异而导致孔板中的泄漏，而产生单独的设备100可以克服这一点。设备可以手动或机器人地定位到例如96孔细胞板或任何其他目标中。
[0134]
这些设备100可能遇到的一个问题是知道肌肉组织108在柱102上的精确高度。如之前(在等式1中)所示，柱102的位移取决于肌肉组织108在柱102上的高度。而且，该位置在实验期间可能改变。已知肌肉组织108由于机械力而沿柱102向上蠕动。此外，在柱偏转期间，肌肉组织102能够从柱102脱落，使得实验不成功。
[0135]
为了避免这个问题，设备100可以被“倒置”，使得柱102向下突起(相对于孔细胞板)。
[0136]
图15示出了倒置柱设备。倒置柱设备具有从基部部分104突起的两个柱102。倒置柱设备装配在孔细胞板中的所谓的超低附着孔上。柱“悬挂”在孔中，并且肌肉组织108可以在它们周围生长。柱102移动分析可以从孔下方进行(如果孔细胞板由透明材料制成)。
[0137]
将细胞/胶原蛋白混合物沉积在超低附着孔的底部上。将基部部分104放置在孔的顶部上并作为孔的盖子，同时柱102突起到细胞/胶原蛋白混合物中。当心肌细胞组织108形成时，它在柱102周围生长。它不会粘附在孔上，因为使用超低附着孔。当细胞开始彼此接触时，柱102将开始移动。利用放置在孔下方的显微镜捕获这种运动。
[0138]
在倒置柱设备中，细胞培养物总是在柱102的末端，因此肌肉组织108的高度位置被很好地限定。这使得偏转柱102所需的力更可再现。而且，在柱102移动时，肌肉组织由于重力而不能自身从柱102分离。此外，两个柱102的相对位置被限定，并且不会添加额外的扩展。
[0139]
该示例的额外的优点是倒置柱设备可以再次经由注射成型批量产生。而且，可能
的材料刚度值的范围更大，因为柱102从基部部分104悬挂。在直立设备100设计中，柱102需要一定的刚度来保持直立。
[0140]
测量系统可以包括在孔细胞板下面向上看的显微镜。这相当于用于测量柱位移的当前系统。在任一系统中，在孔的底部上放置一些东西将干扰测量。
[0141]
在这种倒置设计中，基部部分可以用作孔的塞子，避免溢出或密封孔免受污染物(例如空气)的影响。
[0142]
心肌细胞肌肉组织108可以如上所述进行起搏。这是使用例如35v的电压以一定频率(例如模拟心跳)来实现的。心肌细胞将在刺激时收缩。可以在调整起搏频率时监测这种收缩。为了使细胞起搏，将两个电极1502放置在孔中。
[0143]
这些电极可以如图15所示的那样集成在倒置设备中。以这种方式，定位电极不会妨碍从孔底部的细胞可视化的视场。此外，电极1502总是充分定位，因为它们可以由基部部分104保持，并且孔不必为了刺激肌肉组织108而打开(即基部部分104不必移除)。这防止了细胞培养物的污染。
[0144]
对于常规的向上突起的柱，感兴趣的是能够确定肌肉组织108沿柱向上的高度。
[0145]
图16示出了具有位于腔区域外部的阶梯状结构1602的设备100。阶梯结构1602用于确定肌肉组织1602在柱102上的高度定位。在一个示例中，阶梯均具有50μm的台阶，但是该尺度当然可以根据设备100、柱102和/或细胞孔板的尺寸而改变。例如，如果使用注射成型制造具有结构1602的设备100，则可以通过使用不同的注射成型插入件来改变台阶尺寸。
[0146]
当使用显微镜来查看肌肉组织108时，显微镜必须聚焦在肌肉组织108本身上。当聚焦在柱102上的肌肉组织108上时，z位置(即高度)可以通过查看阶梯结构1602的也在焦点上的对应的台阶来确定。阶梯结构1602的每个台阶可以被标记(例如，用数字或字母或其他特性特征)以容易地读出对应的z位置。然后可以确定肌肉组织108的高度，并且因此可以通过计算(即，使用等式1)将柱102上的力归一化。
[0147]
在该示例中，壁部分106在限定腔的外壁外侧具有针对结构1602的单独外表面。结构1602可以替代地放置在外壁106的内表面内。然后高度确定结构可以在壁106的内侧上靠近柱，因此容易可见。
[0148]
图17示出了图16的设备的平面视图。
[0149]
图18示出了具有用于高度确定的锥形结构1602的设备100，在该示例中，圆锥直径随结构1602的高度而改变。因此，当使用显微镜时聚焦的该圆锥的横截面的直径对应于肌肉组织108的z位置。在该示例中，在高度测量中没有分立的台阶(如阶梯结构所经历的)，并且这样一来可以在任何位置处测量高度。
[0150]
结构1602可以是任何其他形状，其中，当从俯视图查看时，结构1602的横截面相对于结构1602距基部部分104的高度改变(例如，渐缩3d形状、基于台阶的形状等)。
[0151]
结构1602可以比柱102和/或壁部分106更高，或其可以是与它们中的任一个相同的高度。在结构1602比柱102更高的情况下，结构1602可以在其上具有将指示柱102的高度(或稍微短于柱的高度的高度)的高度标记，使得它可以用作警告标记，以供显微镜的用户意识到如果肌肉组织108和高度标记都对焦，则肌肉组织108可能有与柱102断开的危险。
[0152]
替代地，结构1602可以比柱102更短。在这种情况下，一旦显微镜的用户不再能够聚焦在结构1602上，这可以用作肌肉组织108可能有与柱102断开的危险的警告标志。在结
构1602上的不同高度位置处也可以有多个高度标记，以使高度测量更容易。
[0153]
已经描述了使用显微镜对柱102成像并且因此检测和测量柱102的位移的前述示例。然而，也可以使用能够测量柱102的任何其他成像系统(例如，相机等)。本领域技术人员通过研究附图、公开内容以及权利要求，在实践请求保护的本发明时能够理解并实现对所公开的实施例的变型。在权利要求中，“包括”一词不排除其他元件或步骤，并且词语“一”或“一个”不排除多个。
[0154]
尽管在互不相同的从属权利要求中记载了特定措施，但是这并不指示不能有利地使用这些措施的组合。
[0155]
如果术语“适合于”用于权利要求书或说明书中，应注意术语“适合于”旨在相当于术语“被配置为”。
[0156]
权利要求中的任何附图标记都不应被解释为对范围的限制。

技术特征：
1.一种用于在体外培养肌肉组织(108)的由弹性材料制成的设备(100)，所述设备(100)包括：基部部分(104)；两个柱(102)，每个柱从所述基部部分(104)突起；以及壁部分(106)，其具有外壁表面以及围绕所述柱(102)的内壁表面，其中，所述壁部分(106)包括从所述外壁表面向外延伸到所述设备(100)的外周边的至少两个肋元件(1002)。2.根据权利要求1所述的设备(100)，其中，所述壁部分(106)包括在包括所述基部部分的虚拟平面内的至少两个非平行方向上延伸的至少三个肋元件(1002)，例如彼此间隔开90度的径向延伸的四个肋元件。3.根据权利要求1或2所述的设备(100)，其中，所述内壁表面具有非统一纵横比，例如所述内壁表面是椭圆形的或矩形的。4.根据权利要求1至3中的任一项所述的设备，其中，所述肋元件(1002)的高度至多与所述壁部分(106)的高度相同，并且其中，所述壁部分(106)的所述高度至多为2000μm。5.根据权利要求1至4中的任一项所述的设备(100)，其中，所述柱(102)的高度为至少500μm且至多2000μm。6.根据权利要求1至5中的任一项所述的设备(100)，其中，用于制造所述柱(102)的材料的杨氏模量为至少0.5mpa且至多5mpa。7.根据权利要求1至6中的任一项所述的设备(100)，其中，所述设备(100)能够通过以下方法中的任一种来获得：注射成型；注射压缩；转送成型；或者压花，并且优选地通过注射成型。8.根据前述权利要求中的任一项所述的设备(100)，其中，所述设备(100)或所述柱以及优选地所述基部壁部分和肋包括硅橡胶或由硅橡胶构成。9.根据权利要求7或8所述的设备(100)，其中，所述柱(102)相对于所述基部部分(104)朝向远端渐缩，并且所述柱(102)的所述远端在所述柱的一个或多个侧壁与所述柱(102)的所述远端之间的界面处是圆形的或部分圆形的。10.一种设备(100)集合，每个设备是根据权利要求7至9中的任一项所述的设备，其中，所述设备(100)集合是使用多腔注射成型来制造的，其中，每个腔对应于一个设备(100)。11.一种用于在体外测试肌肉组织的系统，所述系统包括：阵列基部；在所述阵列基部上的设备(100)的阵列(1202)，每个设备是根据权利要求7至9中的任一项所述的设备，其中，所述阵列基部和设备(100)的所述阵列(1202)被形成为单个单元。12.根据权利要求11所述的系统，还包括具有多个孔的微孔板，其中，在所述阵列基部上的设备(100)的所述阵列(1202)被定位为使得每个设备装配在所述孔中的相应孔内。13.根据权利要求12所述的系统，其中，所述设备(100)由弹性材料制成，并且其中，每个设备(100)的外周边比所述微孔板的所述孔的内周边大至多5％。
14.根据权利要求11至13中的任一项所述的系统，还包括用于刺激肌肉组织(108)的一对电极(1502)。15.一种制造用于在体外测试肌肉组织(108)的设备(100)的方法，所述方法包括：使用模具来对所述设备(100)进行注射成型，所述模具限定：基部部分(104)；两个柱(102)，每个柱从所述基部部分(104)突起；以及壁部分(106)，其具有外壁表面以及围绕所述柱(102)的内壁表面，其中，所述壁部分(106)包括从所述外壁表面向外延伸到所述设备(100)的外周边的至少两个肋元件(1002)。

技术总结
一种用于在微孔板中在体外测试肌肉组织的设备包括基部部分和两个柱，每个柱从所述基部部分突起。所述设备还包括壁部分，所述壁部分具有外壁表面以及围绕所述柱的内壁表面，其中，所述壁部分包括从所述外壁表面向外延伸到所述设备的外周边的至少两个肋元件。所述设备的外周边的至少两个肋元件。所述设备的外周边的至少两个肋元件。


技术研发人员：J
受保护的技术使用者：皇家飞利浦有限公司
技术研发日：2021.11.24
技术公布日：2023/8/5