一种醋酸菌的快速扩培工艺的制作方法

1.本技术涉及菌种培养技术领域，尤其涉及一种醋酸菌的快速扩培工艺。


背景技术：

2.菌种是发酵工业化生产的核心，而在果醋的工业化生产中，需要使用大量的醋酸菌来进行发酵，这就需要将醋酸菌菌种逐级扩大培养，以提供充足的菌源用于生产制备果醋。果醋生产所用的醋酸菌一般使用固态斜面法进行保藏，此种保藏方法的保存期短，需定期接种至新斜面以继续传代，而频繁的传代会使醋酸菌退化，这样制成的果醋风味稳定性就很难得到保证，生产进程也会受到影响。另一方面，醋酸菌扩培过程的控制与菌种传代活性也有着直接的关联，同时也会影响后续发酵的生产性能。
3.一般来说，在将醋酸菌菌种逐级扩大培养时，醋酸菌斜面菌种接种至液体培养基，经摇瓶扩大培养后，再转接至车间线上的扩培罐进行逐级扩培的过程中，由于生长环境条件的变化，醋酸菌在线上扩培罐中的适应期较长，甚至扩培失败的几率也高。现有的专利中提到：采用酒醋对扩培罐进行蒸汽酸蒸，可缩短种子进入新环境后的延滞期，但此种方式存在一定缺陷，酒醋中的糖类物质经过高温会焦糖化而附着罐壁，能耗高且设备清洗成本也会相应提高，并且无法评估焦糖化反应所产生的物质对醋酸菌活性和果醋成品风味的影响。
4.因此，急需开发一种醋酸菌的扩大培养工艺，更好地满足果醋工业化生产需求。


技术实现要素：

5.为克服现有技术中的不足，本技术的目的在于提供一种醋酸菌的快速扩培工艺，通过在实验室的液体培养基中添加发酵果酒作为底物进行摇瓶培养，可让醋酸菌提前适应扩培底物的切换，大大缩短了车间线上生产菌种的延滞期以及提高了扩培的成功率，使醋酸菌在车间线上的扩培阶段能快速生长繁殖，提高了生产性能。
6.为实现以上目的，本技术的技术方案如下：
7.本技术提供的醋酸菌的快速扩培工艺，包括：
8.将经实验室培养的醋酸菌菌种转移至种子扩培罐培养时，向液体培养基中添加发酵果酒进行果酒液体培养基摇瓶培养。
9.可选地，所述快速扩培工艺满足以下条件中的至少一个：
10.a.所述液体培养基包括：糖源10g/l-35g/l、酵母提取粉10g/l-35g/l和无水乙醇20g/l-45g/l；
11.b.所述液体培养基的ph为5.5-6.0；
12.c.所述发酵果酒的糖度为7.5
°
bx-9.0
°
bx，酒度为7.0％vol-8.5％vol；
13.d.所述发酵果酒的添加量为100g/l-150g/l；
14.e.所述果酒液体培养基的糖度3.9
°
bx-4.7
°
bx，酒度为3.0％vol-5.0％vol；
15.f.所述果酒液体培养基摇瓶培养时，还包括：使用摇床提供溶氧，所述摇床的转速
为180rpm-250rpm；
16.g.所述果酒液体培养基摇瓶培养的温度为25℃-28℃；
17.h.所述种子扩培罐的扩培底物中包括所述发酵果酒；
18.i.所述种子扩培罐的扩培底物的糖度为4.5
°
bx-5.5
°
bx，酒度为4.0％vol-5.5％vol。
19.可选地，所述种子扩培罐培养之后，还包括：进行一级扩培罐培养和二级扩培罐培养；
20.所述一级扩培罐和所述二级扩培罐的扩培底物中各自独立地包括车间原酒，所述车间原酒中的残余糖含量低于所述发酵果酒的残余糖含量。
21.进一步优选地，所述快速扩培工艺还满足以下条件中的至少一个：
22.j.进行所述种子扩培罐培养之前，包括：将所述种子扩培罐、所述一级扩培罐和所述二级扩培罐进行罐体空消，之后加入无菌原醋至少浸泡12h，排空后再压入所述扩培底物；
23.k.所述种子扩培罐培养的温度为25℃-30℃，风量为0.08vvm-0.15vvm；
24.l.所述车间原酒的糖度为6.0
°
bx-8.0
°
bx，酒度为8.0％vol-10.0％vol；
25.m.所述一级扩培罐的扩培底物中的糖度为3.2
°
bx-4.5
°
bx，酒度为4.0％vol-5.5％vol；
26.n.所述一级扩培罐培养的温度为25℃-30℃，风量为0.08vvm-0.15vvm；
27.o.所述二级扩培罐的扩培底物中的糖度为3.2
°
bx-4.5
°
bx，酒度为5.0％vol-6.5％vol；
28.p.所述二级扩培罐培养的温度为30℃-38℃，风量为0.08vvm-0.15vvm。
29.优选地，所述快速扩培工艺还包括：
30.依次经过所述果酒液体培养基摇瓶培养、所述种子扩培罐培养、所述一级扩培罐培养之后，得到第0代醋酸菌菌液，将一部分的所述第0代醋酸菌菌液转移至所述种子扩培罐中进行传代培养，得到第1代醋酸菌菌液，另一部分转移至所述二级扩培罐培养；
31.所述第1代醋酸菌菌液依次经过所述种子扩培罐的所述传代培养和所述一级扩培罐培养之后，一部分菌液再次转移至所述种子扩培罐中进行回接传代培养，得到第2代醋酸菌菌液，另一部分菌液转移至所述二级扩培罐培养；
32.循环进行所述回接传代培养，得到第3-15代醋酸菌菌液。
33.进一步优选地，进行所述传代培养和所述回接传代培养时，还包括：
34.所述种子扩培罐、所述一级扩培罐和所述二级扩培罐中的扩培底物中各自独立地包括所述车间原酒；
35.所述种子扩培罐、所述一级扩培罐中的温度为25℃-30℃，所述二级扩培罐中的温度为30℃-38℃。
36.进一步优选地，所述快速扩培工艺还包括：
37.选取所述一级扩培罐培养后的第2-5代醋酸菌菌液，放置在0℃-4℃下进行保存，之后控制在20天之内升温活化，并重新投入所述种子扩培罐中进行扩大培养。
38.可选地，所述经果酒液体培养基摇瓶培养之前，还包括：在固体斜面培养基中进行培养。
39.优选地，所述固体斜面培养基包括：糖源10g/l-35g/l、酵母提取粉10g/l-35g/l、琼脂10g/l-20g/l、碳酸钙5g/l-25g/l和无水乙醇25g/l-45g；
40.所述固体斜面培养基的ph为6.0-6.5。
41.可选地，所述醋酸菌菌种的保藏方式包括：
42.使用磁珠冻存管在-20℃的条件下对所述醋酸菌菌种进行保藏，所述保藏的时间不小于1年。
43.本技术的有益效果：
44.本技术通过在实验室中的摇瓶培养阶段，向液体培养基添加发酵果酒作为底物培养，可让醋酸菌提前适应扩培底物的切换，适应实验室培养至车间线上扩培罐的环境切换，大大减少了因扩培底物以及线上扩培罐生长环境条件的同时变化致使菌种适应期延长甚至扩培失败情况的发生，缩短了车间线上菌种扩培的延滞期，提高了扩培的成功率，使得醋酸菌在车间线上的扩培阶段能快速生长繁殖，提高了果醋工艺化过程中的生产性能。
45.进一步优选地，除了在摇瓶培养环节添加发酵果酒之外，种子扩培罐的扩培底物中也包括发酵果酒，发酵果酒中的残余糖含量高于车间发酵生产的车间原酒，为醋酸菌生长繁殖提供了充足的碳源，有助于快速激活醋酸菌活性，让醋酸菌尽快适应车间生产线上扩培罐的生长环境，也避免了其他粮食及其副产物、糖类、酒精、有机酸及其他碳化合物类辅料的补充，使车间扩培周期明显缩短。
附图说明
46.为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本技术的某些实施例，因此不应被看作是对本技术范围的限定。
47.图1为醋酸菌扩培生产中常用的生产流程图；
48.图2为本技术醋酸菌的快速扩培工艺中一种优选的生产流程图。
具体实施方式
49.如本文所用之术语：
[0050]“由
……
制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。连接词“由
……
组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。
[0051]
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
[0052]
在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。
[0053]“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说a组分的质量份为a份，b组分的质量份为b份，则表示a组分的质量和b组分的质量之比a：b。或者，表示a组分的质量为ak，b组分的质量为bk(k为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
[0054]“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，a和/或b包括(a和b)和(a或b)。
[0055]
现有技术中，常见的醋酸菌扩培生产流程包括实验室扩培与车间扩培两个阶段，如图1所示。其中，实验室扩培阶段包括：固体斜面试管培养、三角瓶液体培养基摇瓶培养；车间扩培阶段包括：种子扩培罐培养、一级扩培罐培养和二级扩培罐培养。
[0056]
每次醋酸菌种从实验室的斜面培养开始、扩培至线上的二级扩培罐扩培完成，用时一般需5至6天。尤其，从斜面培养基中活化扩培的菌种，也就是第0代菌种，在车间线上扩培的延滞期较长，这主要是因为生长环境的切换导致的，比如实验室培养基中可供醋酸菌利用的营养成分是全面并充足的，而且不含任何抑制作用的物质，但线上所用的果酒氮含量少且含有抑制微生物生长的物质，如单宁等，刚活化的菌种并不适应这种环境，这就使得从液体的摇床培养转接至车间线上种子罐扩培的扩培成功率较低。
[0057]
此外，醋酸菌在车间线上的传代方式为：取部分一级扩培罐扩培完成后的菌液，回接至种子扩培罐中，以实现菌种的传代。在线上传代过程中菌种会逐渐衰老退化，每次实验室扩培出来的液体醋酸菌菌种在车间线上传代至高代数(》15代)时，菌种的产酸速率下降，醋酸发酵用时变长，此时需重新启动实验室扩培阶段，这就会影响生产进度的推进及产品的供货。因此，如何提高从实验室扩培阶段转移至车间线上种子罐中的扩培成功率，以及如何减少启动实验室扩培操作，使得即使在生产旺季也能使各项工序衔接紧密，并确保果醋风味的稳定性，是本技术的研究重点。
[0058]
基于此，本技术提供一种醋酸菌的快速扩培工艺，包括：
[0059]
将经实验室培养的醋酸菌菌种转移至种子扩培罐培养时，向液体培养基中添加发酵果酒进行果酒液体培养基摇瓶培养。
[0060]
在本技术的一种可选实施方式中，醋酸菌菌种在进行果酒液体培养基摇瓶培养之前，还包括：在固体斜面培养基中进行培养。
[0061]
需要说明的是，醋酸菌菌种从磁珠冻存管的休眠状态被活化之后，可接种至液体培养基中进行摇瓶培养，也可以在茄形培养瓶、平板或者是试管中进行固体斜面繁殖培养，该过程需要多种不同的营养成分，其中糖类物质恰好是微生物生长繁殖所需要的碳源，糖类不足则会影响醋酸菌微生物的存活能力，因此培养基的组分对菌种的扩培成活率也有一定的影响。
[0062]
在一种优选的实施方式中，固体斜面培养基包括：糖源10g/l-35g/l、酵母提取粉10g/l-35g/l、琼脂10g/l-20g/l、碳酸钙5g/l-25g/l和无水乙醇25g/l-45g/l。其中，固体斜面培养基的ph为6.0-6.5。
[0063]
在本技术的一种可选实施方式中，还未加入发酵果酒的液体培养基包括：糖源10g/l-35g/l、酵母提取粉10g/l-35g/l和无水乙醇20g/l-45g/l。其中，液体培养基的ph为5.5-6.0。
[0064]
通过在固体斜面培养基和液体培养基上采用逐级ph调整，这有利于避免扩培初始时环境的ph偏差过大，致使醋酸菌菌种不适应，进而影响扩培成功率。
[0065]
在本技术的一种可选实施方式中，在进行果酒液体培养基摇瓶培养时，可以在液体培养基中加入100g/l-150g/l的发酵果酒，来使醋酸菌菌种在实验室阶段提前适应线上扩培环境的变化，提高线上扩培的成功率。
[0066]
在本技术的一种可选实施方式中，发酵果酒的糖度为7.5
°
bx-9.0
°
bx，酒度为7.0％vol-8.5％vol。
[0067]
需要说明的是，本技术的发酵果酒是使用小型发酵罐单独进行发酵得到的果酒，与使用大型发酵罐规模化生产得到的果酒不同，本技术的发酵果酒的糖度高、酒度低，可提供充足的碳源来激活醋酸菌的生长能力，可用在摇瓶培养的底物中，用以激活0代醋酸菌的生长能力，使其更好地适应实验室扩培至车间线上扩培时环境的切换，提高扩培成功率。
[0068]
在对醋酸菌菌种进行扩培时，尤其是在车间线上的扩培罐中扩培时，一般会添加一些营养成分，如氨基酸、维生素类等物质，以促进菌种的繁殖活性，达到提高扩培成功率及缩短扩培周期的效果。然而，营养物质的过量添加，一方面会增加生产成本或操作的复杂性，另一方面在一定程度上也会影响果醋的纯正风味。
[0069]
在一种优选的实施方式中，在进行种子扩培罐培养时，种子扩培罐的扩培底物中包括发酵果酒。这是因为发酵果酒中含有比较充足的碳源，供菌种进行繁殖，而且实验室的果酒液体培养基摇瓶培养时，培养底物中也已经含有发酵果酒，这样会使菌种所处的环境差异小，也更有利于提高菌种的成活率。
[0070]
在一种优选的实施方式中，在经过种子扩培罐培养之后，还包括：进行一级扩培罐培养和二级扩培罐培养；其中，一级扩培罐和二级扩培罐的扩培底物中各自独立地包括车间原酒，车间原酒中的残余糖含量低于发酵果酒的残余糖含量。
[0071]
在果醋工业化发酵生产阶段，一般会使物料中的糖分尽量转化成乙醇，所以车间线上发酵制成的车间原酒的残糖会很低，酒度则偏高，糖转酒的转化率高，进入醋酸阶段就可以转化为更多的果醋。那么，经过碳源充足的环境培养的醋酸菌菌种则很难能直接适应这种车间发酵环境，因此0代菌种需要在种子罐扩培完毕后转移至后续各级扩培罐时，使用车间原酒调配出不同浓度的扩培底物，来促使扩培的醋酸菌菌种逐渐适应后续车间发酵罐中进行发酵的环境。
[0072]
在本技术的一种可选实施方式中，车间原酒的糖度为6.0
°
bx-8.0
°
bx，酒度为8.0％vol-10.0％vol。
[0073]
需要说明的是，如果减少车间发酵罐的发酵时间，那么制得的车间原酒的糖度、酒度，也能达到糖度为7.5
°
bx-9.0
°
bx，酒度为7.0％vol-8.5％vol，而且还原糖的含量也能很高。也就是说，在某种情况下，是可以使用在一定发酵工艺下制成的车间原酒，来作为果酒液体培养基摇瓶培养阶段和种子扩培罐培养阶段的扩培底物。然而，车间发酵罐主要是为了进行大规模工业化生产的，每个发酵罐中发酵制成的车间原酒的量很大，如果仅是为了取少量果酒来进行醋酸菌菌种的扩培，这很容易造成资源浪费，而且在取用少量果酒后，即使继续延长发酵罐中的发酵时间，也存在发酵后的产物风味不一致性的风险。因此，在添加发酵果酒进行扩培时，优先选用小型发酵设备制备的发酵果酒。
[0074]
为了缩短醋酸菌菌种从实验室阶段移接至车间线上进行扩培的适应期，同时减少
扩培底物中营养成分的添加，本技术发明人除了考虑到醋酸菌菌种需要适应从斜面培养基转移到液体培养基的环境变化，还考虑到从实验室摇瓶环节到种子发酵罐的环境变化，以及从种子发酵罐到一级扩培罐、二级扩培罐的环境变化。尤其是经二级扩培罐培养后的醋酸菌是需要直接进入车间发酵罐中用于果醋发酵的，那么在逐级扩大培养的过程中，也需要不断调整各级扩培底物的糖度及酒度，使得醋酸菌在此扩培过程中逐渐适应从实验室斜面到车间线上的扩培罐、再到车间发酵罐中的环境切换，提高醋酸菌的生产性能，缩短醋酸菌在车间发酵罐中的生长延滞期，达到提高生产效率的效果。
[0075]
在一些优选实施方式中，在果酒液体培养基摇瓶培养时，通过向液体培养基中添加发酵果酒之后，果酒液体培养基中的糖度为3.9
°
bx-4.7
°
bx，例如可以是3.9
°
bx、4.0
°
bx、4.2
°
bx、4.5
°
bx或4.7
°
bx，酒度为3.0％vol-5.0％vol，例如可以是3.0％vol、3.2％vol、3.5％vol、3.8％vol、4.0％vol、4.3％vol、4.5％vol、4.7％vol或5.0％vol。
[0076]
在一些优选实施方式中，在进行种子扩培罐培养时，通过在扩培底物中添加发酵果酒，种子扩培罐的扩培底物中的糖度为4.5
°
bx-5.5
°
bx，例如可以是4.5
°
bx、4.8
°
bx、5.0
°
bx、5.2
°
bx或5.5
°
bx，酒度为4.0％vol-5.5％vol，例如可以是4.0％vol、4.2％vol、4.5％vol、4.8％vol、5.0％vol、5.3％vol或5.5％vol。
[0077]
醋酸菌菌种从酒精含量25g/l-45g/l的斜面培养基中进行培养，逐渐在酒度为3.0％vol-5.0％vol的果酒液体培养基中进行摇瓶培养，进而再转移至酒度为4.0％vol-5.5％vol的扩培底物中进行种子扩培罐培养，因为逐渐适应了不同酒度的生长环境，提高了醋酸菌的耐酒性能，进而很容易提高菌种的扩培成功率。
[0078]
进一步优选地，在进行一级扩培罐培养时，可以在扩培底物中添加更接近车间发酵罐环境的车间原酒，使得一级扩培罐扩培底物中的糖度为3.2
°
bx-4.5
°
bx，例如可以是3.2
°
bx、3.5
°
bx、3.8
°
bx、4.0
°
bx、4.2
°
bx或4.5
°
bx，酒度为4.0％vol-5.5％vol，例如可以是4.0％vol、4.2％vol、4.5％vol、4.8％vol、5.0％vol、5.3％vol或5.5％vol。
[0079]
一级扩培罐中的糖度低于种子扩培罐的糖度，而酒度则基本保持不变，这样更有利于调节醋酸菌在低营养环境下的生长。
[0080]
在进行二级扩培罐培养时，继续调整车间原酒的加入量，即调整扩培底物中的糖度和酒度，使得二级扩培罐扩培底物中的糖度为3.2
°
bx-4.5
°
bx，例如可以是3.2
°
bx、3.5
°
bx、3.8
°
bx、4.0
°
bx、4.2
°
bx或4.5
°
bx，酒度为5.0％vol-6.5％vol，例如可以是5.0％vol、5.2％vol、5.5％vol、5.8％vol、6.0％vol、6.3％vol或6.5％vol。
[0081]
与一级扩培罐进行对比，二级扩培罐的糖度基本不变，但是酒度提高，可以进一步提高醋酸菌在低营养环境下的耐酒性能。
[0082]
在本技术的一些可选实施方式中，在果酒液体培养基摇瓶培养时还包括：使用摇床提供氧气，所述摇床的转速为180rpm-250rpm，例如可以是180rpm、200rpm、220rpm或250rpm。
[0083]
可以理解的是，果酒液体培养基摇瓶培养环节属于实验室阶段，不同于线上的扩培罐中具有专用的通风设备，果酒摇瓶时通过使用摇床来调整溶氧量。
[0084]
在本技术的一些可选实施方式中，在车间线上的种子扩培罐培养、一级扩培罐培养、二级扩培罐培养的过程中，风量变化不大，基本都是在0.08vvm-0.15vvm的范围内。
[0085]
在本技术的一些可选实施方式中，果酒液体培养基摇瓶培养的温度为25℃-28℃。
[0086]
除了扩培底物中糖度、酒度对醋酸菌生长的影响，扩培环境的温度对醋酸菌的生长繁殖也有很大影响。醋酸菌最适宜的生长温度为28-35℃，适度的高温在一定程度上可加快醋酸菌的繁殖，但是也会带来菌种的快速老化，尤其是经过多次线上传代之后，其产酸活性会出现明显的下降，此时需更换新的菌种，即重新启动实验室扩培。然而每次实验室扩培的重新启动到线上扩培完成需要5-6天，这样带来的是繁琐的操作和低下的生产效率。本技术为减缓菌种在传代过程中的老化速度，延长线上菌种的使用周期，在传代过程采用一定程度的低温方式。
[0087]
在本技术的一些可选实施方式中，线上的种子扩培罐培养、一级扩培罐培养的温度控制在25℃-30℃，减少高温对菌种的损害，而二级扩培罐则控制在30℃-38℃之间，更优选为30℃-35℃，来让醋酸菌提前完成发酵罐环境的适应，使其接种至发酵罐后尽快开始醋酸的发酵反应。
[0088]
针对每次线上复产时，需要对扩培罐等设备进行三步或五步法的清洗，而这些清洗后残留的碱性清洗液容易影响扩培成功率。对此，本技术还针对扩培设备的环境酸化进行了优化，制定了扩培设备的浸泡工艺。
[0089]
在本技术的一些可选实施方式中，在进行种子扩培罐培养之前，包括：将种子扩培罐、一级扩培罐和二级扩培罐进行罐体空消，之后加入无菌原醋至少浸泡12h，排空后再压入扩培底物。
[0090]
进一步优选地，进行罐体空消的温度不低于120℃，时间大约10min。通过原醋浸泡之后，为醋酸菌生长繁殖提供酸性无菌环境，也可避免因为使用高温酸蒸技术产生一些附在罐壁的焦糖化物质，进而影响果醋风味不一致的情况发生。
[0091]
在本技术的一些可选实施方式中，本技术的快速扩培工艺包括：依次经过果酒液体培养基摇瓶培养、种子扩培罐培养、一级扩培罐培养之后，得到第0代醋酸菌菌液；将一部分的第0代醋酸菌菌液转移至种子扩培罐中进行传代培养，得到第1代醋酸菌菌液，另一部分则转移至二级扩培罐中培养；第1代醋酸菌菌液依次经过种子扩培罐的传代培养和一级扩培罐培养之后，其中的一部分菌液再次转移至种子扩培罐中进行回接传代培养，得到第2代醋酸菌菌液，另一部分菌液则转移至二级扩培罐培养；循环进行回接传代培养，即可得到第3-15代醋酸菌菌液。
[0092]
具体地，如图2所示，将休眠的醋酸菌菌种在实验室阶段进行了斜面试管培养、果酒液体培养基培养之后，转移至车间线上进行扩培，依次为种子扩培罐培养、一级扩培罐培养、二级扩培罐培养，这个过程中的菌种可以称为第0代菌种。其中，可以将经过小型发酵设备发酵得到的发酵果酒添加到液体培养基中，用于进行果酒液体培养基摇瓶培养环节以及添加到种子扩培罐的扩培底物中，保证菌种从实验室转移至线上生长环境的稳定。
[0093]
图2中的注1表示为：在特殊情况下，经过短时间发酵后，车间原酒发酵至糖度7.5
°
bx-9.0
°
bx，酒度7.0％vol-8.5％vol时，可取代小型发酵设备中的发酵果酒用作扩培底物，进行果酒液体培养基摇瓶培养和种子扩培罐培养。
[0094]
为了尽量减少实验室扩培的启动，将一级扩培罐培养得到的一部分第0代醋酸菌菌种，转移至二级扩培罐中继续进行扩培后，再转移至车间大型发酵罐中；而另一部分第0代醋酸菌菌种则转移至种子扩培罐中进行传代培养，这部分的菌种经过种子扩培罐培养、一级扩培罐培养、二级扩培罐培养之后，得到大量的第1代醋酸菌菌种，可继续送入车间发
酵罐中进行工业化发酵。
[0095]
进一步优选地，在将第0代醋酸菌菌种转移至种子扩培罐中进行传代培养时，因为醋酸菌菌种是从含有车间原酒扩培底物的一级扩培罐中转移的，因此进行传代培养的种子扩培罐、一级扩培罐、二级扩培罐的扩培底物中同样需要添加车间原酒。
[0096]
图2中的注2表示：在车间原酒发酵至糖度6.0
°
bx-8.0
°
bx，酒度8.0％vol-10.0％vol时，可用作第0代菌种的一级扩培罐、二级扩培罐的扩培底物，以及第1-15代菌种种子扩培罐、一级扩培罐、二级扩培罐的扩培底物。
[0097]
在得到第1代的醋酸菌菌种后，此时菌种传代次数少，产酸活性高，因此可以继续进行第2代菌种的传代。具体的，通过将一级扩培罐培养的一部分第1代醋酸菌菌种再次转移至种子扩培罐中进行回接传代培养，即可得到第2代醋酸菌菌种；而另一部分第1代菌种转移至二级扩培罐中继续进行扩培后，用于车间发酵罐的发酵使用。
[0098]
循环重复回接传代的这一步骤，可使得醋酸菌菌种的传代次数增多，进而得到3-15代的醋酸菌菌种，而每代菌种通过一级、二级扩培罐的逐级扩培，得到大量的醋酸菌，可用于满足果醋工业化生产需求。
[0099]
其中，在第1-15代的线上扩培阶段，种子扩培罐以及一级扩培罐作为菌种的传代，两者的底物指标范围相同，即糖度为3.2
°
bx-4.5
°
bx，酒度为4.0％vol-5.5％vol。而二级扩培罐作为菌种扩培过渡至发酵阶段，糖度依然可以为3.2
°
bx-4.5
°
bx，酒度需升至5.0％vol-6.5％vol。
[0100]
在线上传代的过程中，菌种会逐渐衰老退化，每次实验室扩培出的液体醋酸菌菌种在线上传代至高代数(》15代)时，菌种产酸速率下降，醋酸发酵用时变长。如果重新启动实验室扩培，这就会影响生产进度的推进以及一定生产周期内果醋产品的风味稳定性，毕竟不能完全保证两次实验室扩培之后的醋酸菌菌种进行发酵后得到的果醋产品风味完全一致。
[0101]
在一种优选地实施方式中，通过选取一级扩培罐培养得到的第2-5代的醋酸菌菌液，将其放置在0℃-4℃下进行保存，之后控制在20天之内进行升温活化，并重新投放进入种子扩培罐中进行扩大培养，则可减少重新启动实验室扩培操作。
[0102]
通过使用这种传代工艺，大大减少了重新启动实验室扩培的操作，且菌种也能很快适应线上的生长环境，适应性及扩培成功率均比实验室的第0代菌种要高，醋酸菌菌种的扩培延滞期大大缩短，在生产旺季也能使各项工序衔接更紧密。
[0103]
图2中的注3表示：将低温保存的某一菌液进行升温活化后，置于种子扩培罐扩培，菌种代数按取样时代数加1计算，用至15代则不再回接传代，而后更换另一低温保存的菌液重新进行扩培。
[0104]
进一步优选地，在不同的扩培罐中进行菌种的扩培时，罐内液体中如果出现了中等数量的泡沫，可适当地补充一定的消泡剂，这样有助于提高扩培过程中成功率。其中，消泡剂的加入符合gb2760的规定，具体的消泡剂种类为聚二甲基硅氧烷及其乳液等。
[0105]
为维持菌种的活性，斜面菌种一般需要隔一段时间传代依次，这样很容易导致菌种退化，对此本技术还开发了一种新的菌种保藏方式以减少传代次数。
[0106]
在一种可选的实施方式中，使用磁珠冻存管在-20℃的条件下对醋酸菌菌种进行保藏，-20℃条件下的菌种保藏时间至少为1年。可以通过定期将磁珠冻存管保藏的菌种复
苏至固体斜面培养基进行扩培，即可减少因持续的斜面传代带来的菌种变异、退化等现象，使菌种始终保持良好的生产性能，保持果醋风味稳定性。
[0107]
下面将结合具体实施例对本技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本技术，而不应视为限制本技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0108]
实施例1
[0109]
本实施例提供一种醋酸菌的快速扩培工艺，具体包括：
[0110]
(1)将休眠的醋酸菌菌种依次进行固体斜面试管培养、果酒液体培养基摇瓶培养、种子扩培罐培养、一级扩培罐培养和二级扩培罐培养，得到大量的0代醋酸菌；
[0111]
(2)将一级扩培罐培养的部分0代醋酸菌转移至种子扩培罐中进行传代培养，通过依次进行种子扩培罐培养、一级扩培罐培养和二级扩培罐培养，得到大量的1代醋酸菌；
[0112]
(3)重复将一级扩培罐培养的部分醋酸菌转移至种子发酵罐中进行回接传代培氧，再通过一级扩培罐和二级扩培罐的扩培，得到大量的2-15代醋酸菌。
[0113]
其中，在步骤(1)进行种子扩培罐培养之前，将所有的扩培罐在120℃进行罐体空消10min，之后加入无菌原醋浸泡12h之后排空，再加入扩培底物。
[0114]
步骤(1)的斜面试管培养基：糖源35g/l，酵母提取粉35g/l，琼脂20g/l，碳酸钙25g/l，无水乙醇35g/l，ph约为6.5。
[0115]
步骤(1)的液体培养基：糖源35g/l，酵母提取粉35g/l，无水乙醇35g/l，ph约为6.0，然后向液体培养基中添加发酵果酒100g/l(该发酵果酒的糖度为7.5-9.0
°
bx、酒度为7.0-8.5％vol)，使得果酒液体培养基中的糖度为4.7
°
bx、酒度为4.0％vol，之后在25℃下进行摇瓶培养，该发酵果酒是单独使用小型发酵设备发酵得到的果酒。
[0116]
步骤(1)在进行种子扩培罐培养时，扩培底物中同样添加了发酵果酒，最终扩培底物中的糖度为5.5
°
bx、酒度为5.0％vol，还原糖含量在0.5g/100ml-1.5g/100ml的范围内，种子扩培罐的扩培温度为28℃。
[0117]
步骤(1)在进行一级扩培罐培养和二级扩培罐培养时，扩培底物中分别添加了车间原酒(该车间原酒为生产车间的大型发酵罐进行发酵后制备的果酒，糖度为6.0-8.0
°
bx、酒度为8.0-10.0％vol)，使得一级扩培罐扩培底物中的糖度为4.5
°
bx、酒度为5.5％vol；二级扩培罐扩培底物中的糖度为3.5
°
bx、酒度为6.5％vol；一级扩培罐和二级扩培罐的扩培温度依次为30℃、35℃。
[0118]
步骤(2)和步骤(3)的第1-15代菌种扩培时的种子扩培罐、一级扩培罐和二级扩培罐的扩培底物中分别添加了车间原酒，其中种子扩培罐扩培底物中的糖度为4.3
°
bx，酒度为5.3％vol；一级扩培罐扩培底物中的糖度为4.3
°
bx，酒度为5.2％vol；二级扩培罐扩培底物中的糖度为4.2
°
bx，酒度为6.4％vol；种子扩培罐、一级扩培罐和二级扩培罐的扩培温度依次为28℃、30℃、35℃，风量均为0.1vvm。
[0119]
实施例2
[0120]
本实施例提供一种醋酸菌的快速扩培工艺，具体工艺同实施例1，所不同的是：保留步骤(3)中进行回接传代培养后、经过一级扩培罐培养得到的部分生长活性较好的第2-5代醋酸菌菌种，放在4℃中进行保存，并在20天之内取出保存的菌种升温活化后，重新投入
步骤(3)的种子扩培罐中进行扩培。
[0121]
对比例1
[0122]
本对比例提供一种醋酸菌的快速扩培工艺，具体工艺同实施例1，所不同的是：步骤(1)中摇瓶培养阶段没有添加发酵果酒，而是直接将液体培养基摇瓶培养的醋酸菌菌种直接接入线上的种子扩培罐中进行扩培，且步骤(2)种子扩培罐的扩培底物中添加的是车间原酒。
[0123]
对比例2
[0124]
本对比例提供一种醋酸菌的快速扩培工艺，具体工艺同实施例1，所不同的是：步骤(1)中的摇瓶培养时加入的是车间原酒，步骤(2)种子扩培罐的扩培底物同样也添加的是车间原酒。
[0125]
对比例3
[0126]
本对比例提供一种醋酸菌的快速扩培工艺，具体工艺同实施例1，所不同的是：步骤(1)进行种子扩培罐培养之前，所有的扩培罐中加入为罐体容量25％的原醋，加热至90℃搅拌25min，排空后加入扩培底物。
[0127]
对比例4
[0128]
本对比例提供一种醋酸菌的快速扩培工艺，具体工艺同实施例1，所不同的是：步骤(1)进行种子扩培罐培养之前，所有的扩培罐空消后，不进行酸蒸或浸泡。
[0129]
对比例5
[0130]
本对比例提供一种醋酸菌的快速扩培工艺，具体工艺同实施例1，所不同的是：保留步骤(1)中进行传代培养后、经过一级扩培罐培养得到的部分生长活性较好的第1代醋酸菌菌种，以及步骤(3)中进行回接传代培养后、经过一级扩培罐培养得到的部分生长活性较好的第6代以上的醋酸菌菌种，放在0℃中进行保存，并在20天之内取出保存的菌种升温活化后，重新投入步骤(3)的种子扩培罐中进行扩培。
[0131]
对比例6
[0132]
本对比例提供一种醋酸菌的快速扩培工艺，具体工艺同实施例1，所不同的是：保留步骤(3)中进行回接传代培养后、经过一级扩培罐培养得到的部分生长活性较好的第2-5代醋酸菌菌种，然后将其放在0℃环境中进行保存，并分别在第20-30天以及第30-40天取出保存的菌种升温活化后，重新投入步骤(3)的种子扩培罐中进行扩培。
[0133]
分别统计实施例1以及对比例1-4在线上各级扩培罐中的平均培养时间与扩培成功率的结果，如表1所示。
[0134]
表1
[0135][0136]
由表1可知：将实施例1和对比例1进行对比，说明在液体培养基摇瓶与线上种子罐培养时，添加发酵果酒进行培养，可让醋酸菌提前适应实验室摇瓶至线上扩培罐的环境切换，并逐步适应线上的各级扩培，减少因扩培底物及线上扩培罐生长环境条件的同时变化致使菌种适应期延长甚至扩培失败的情况发生。
[0137]
将实施例1和对比例2进行对比，说明因为发酵果酒为第0代醋酸菌实验室扩培及种子罐扩培专用的果酒，还原糖含量高于车间发酵罐生产的车间原酒，可为醋酸菌生长繁殖提供充足碳源，有助于快速激活醋酸菌活性，让醋酸菌尽快适应生产线上扩培罐生长环境，也避免了使用其他粮食及其副产物、糖类、酒精、有机酸及碳化合物类辅料的补充，使车间线上的菌种扩培周期明显缩短。另一方面，在车间原酒进行发酵阶段，实施例1的扩培周期中还能同时推进实验室扩培阶段及车间种子扩培罐的培养，待车间原酒发酵完毕后即可进入一级扩培罐中进行培养，相对于不使用果酒摇瓶培养的生产流程，实施例1的生产扩培工序衔接更为紧密，减少生产待机成本。
[0138]
将实施例1和对比例3-4进行对比，说明使用本技术的原醋浸泡工艺对扩培设备进行清洗，虽然与对比例3酸蒸工艺的扩培时长相差不大，但是更节省能耗，也能避免高温产生的焦糖化物质对醋酸菌的生长甚至产品风味的影响。
[0139]
记录实施例1、实施例2以及对比例5中不同代菌种在线上各级扩培罐中的平均培养时间，如表2所示；记录实施例2以及对比例6中不同保存时长后再升温活化后的菌种在线上各级扩培罐中的平均培养时间，如表3所示。
[0140]
表2
表3
[0141][0142][0143]
由表2和表3可知，在线上扩培阶段保留部分生长活性较好的第2-5代醋酸菌液于0-4℃进行保存，20天内升温活化重投于线上种子罐进行扩培，满足菌种于车间扩培线上持续传代应用，可减少实验室0代菌种扩培的启动次数，在生产旺季能持续生产，工序衔接更紧密，减少菌种生长适应期的等待时间。
[0144]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本技术的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本技术进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本技术各实施例技术方案的范围。
[0145]
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本技术的范围之内并且形成不同的实施例。例如，上述所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本技术的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

技术特征：
1.一种醋酸菌的快速扩培工艺，其特征在于，包括：将经实验室培养的醋酸菌菌种转移至种子扩培罐培养时，向液体培养基中添加发酵果酒进行果酒液体培养基摇瓶培养。2.如权利要求1所述的快速扩培工艺，其特征在于，满足以下条件中的至少一个：a.所述液体培养基包括：糖源10g/l-35g/l、酵母提取粉10g/l-35g/l和无水乙醇20g/l-45g/l；b.所述液体培养基的ph为5.5-6.0；c.所述发酵果酒的糖度为7.5
°
bx-9.0
°
bx，酒度为7.0％vol-8.5％vol；d.所述发酵果酒的添加量为100g/l-150g/l；e.所述果酒液体培养基的糖度3.9
°
bx-4.7
°
bx，酒度为3.0％vol-5.0％vol；f.所述果酒液体培养基摇瓶培养时，还包括：使用摇床提供溶氧，所述摇床的转速为180rpm-250rpm；g.所述果酒液体培养基摇瓶培养的温度为25℃-28℃；h.所述种子扩培罐的扩培底物中包括所述发酵果酒；i.所述种子扩培罐的扩培底物的糖度为4.5
°
bx-5.5
°
bx，酒度为4.0％vol-5.5％vol。3.如权利要求1所述的快速扩培工艺，其特征在于，所述种子扩培罐培养之后，还包括：进行一级扩培罐培养和二级扩培罐培养；所述一级扩培罐和所述二级扩培罐的扩培底物中各自独立地包括车间原酒，所述车间原酒中的残余糖含量低于所述发酵果酒的残余糖含量。4.如权利要求3所述的快速扩培工艺，其特征在于，还满足以下条件中的至少一个：j.进行所述种子扩培罐培养之前，包括：将所述种子扩培罐、所述一级扩培罐和所述二级扩培罐进行罐体空消，之后加入无菌原醋至少浸泡12h，排空后再压入所述扩培底物；k.所述种子扩培罐培养的温度为25℃-30℃，风量为0.08vvm-0.15vvm；l.所述车间原酒的糖度为6.0
°
bx-8.0
°
bx，酒度为8.0％vol-10.0％vol；m.所述一级扩培罐的扩培底物中的糖度为3.2
°
bx-4.5
°
bx，酒度为4.0％vol-5.5％vol；n.所述一级扩培罐培养的温度为25℃-30℃，风量为0.08vvm-0.15vvm；o.所述二级扩培罐的扩培底物中的糖度为3.2
°
bx-4.5
°
bx，酒度为5.0％vol-6.5％vol；p.所述二级扩培罐培养的温度为30℃-38℃，风量为0.08vvm-0.15vvm。5.如权利要求3所述的快速扩培工艺，其特征在于，还包括：依次经过所述果酒液体培养基摇瓶培养、所述种子扩培罐培养、所述一级扩培罐培养之后，得到第0代醋酸菌菌液，将一部分的所述第0代醋酸菌菌液转移至所述种子扩培罐中进行传代培养，得到第1代醋酸菌菌液，另一部分转移至所述二级扩培罐培养；所述第1代醋酸菌菌液依次经过所述种子扩培罐的所述传代培养和所述一级扩培罐培养之后，一部分菌液再次转移至所述种子扩培罐中进行回接传代培养，得到第2代醋酸菌菌液，另一部分菌液转移至所述二级扩培罐培养；循环进行所述回接传代培养，得到第3-15代醋酸菌菌液。6.如权利要求5所述的快速扩培工艺，其特征在于，进行所述传代培养和所述回接传代培养时，还包括：
所述种子扩培罐、所述一级扩培罐和所述二级扩培罐中的扩培底物中各自独立地包括所述车间原酒；所述种子扩培罐、所述一级扩培罐中的温度为25℃-30℃，所述二级扩培罐中的温度为30℃-38℃。7.如权利要求5所述的快速扩培工艺，其特征在于，还包括：选取所述一级扩培罐培养后的第2-5代醋酸菌菌液，放置在0℃-4℃进行保存，之后控制在20天之内升温活化，并重新投入所述种子扩培罐中进行扩大培养。8.如权利要求1所述的快速扩培工艺，其特征在于，所述果酒液体培养基摇瓶培养之前，还包括：在固体斜面培养基中进行培养。9.如权利要求8所述的快速扩培工艺，其特征在于，所述固体斜面培养基包括：糖源10g/l-35g/l、酵母提取粉10g/l-35g/l、琼脂10g/l-20g/l、碳酸钙5g/l-25g/l和无水乙醇25g/l-45g/l；所述固体斜面培养基的ph为6.0-6.5。10.如权利要求1-9任一项所述的快速扩培工艺，其特征在于，所述醋酸菌菌种的保藏方式包括：使用磁珠冻存管在-20℃的条件下对所述醋酸菌菌种进行保藏，所述保藏的时间不小于1年。

技术总结
本申请提供一种醋酸菌的快速扩培工艺，涉及菌种培养技术领域。该快速扩培工艺包括：将经实验室培养的醋酸菌菌种转移至种子扩培罐培养时，向液体培养基中添加发酵果酒进行果酒液体培养基的摇瓶培养。通过添加果酒作为底物培养，可让醋酸菌提前适应扩培底物的切换，适应实验室培养至车间线上扩培罐培养的环境切换，大大减少了因扩培底物以及生长环境的同时变化，致使菌种适应期延长甚至扩培失败情况的发生，缩短了车间线上菌种扩培的延滞期，提高了扩培的成功率，使得醋酸菌在车间线上的扩培阶段能快速生长繁殖，提高了果醋工艺化过程中的生产性能。的生产性能。的生产性能。


技术研发人员：李炜炤 徐晓怡 熊贤平 刘瑞结
受保护的技术使用者：天地壹号饮料股份有限公司
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/8/5