多肽注射系统及其用途

1.本发明涉及用于将多肽注射到细胞中的多肽注射系统及其用途。
背景技术：
：：2.自然界中的微生物在进化的过程中获得了多种多样的分子机制，使其在复杂的生物环境中得以生存。其中，可伸缩注射系统(contractileinjectionsystems，ciss)便是微生物适应环境生存竞争的“武器”之一。该系统是大型的蛋白复合体，可以将多种效应分子装载至复合体中并帮助微生物将这些效应分子注射到细胞中，使微生物获得生存优势。ciss在自然界中广泛存在，最典型的ciss如t4、p2和mu噬菌体的可伸缩尾部，其结构、装配和作用机制已经得到了研究。除噬菌体的尾部，细菌中也存在多种ciss以调节与宿主的相互作用并抵御外敌，例如细菌的vi型分泌系统(typevisecretionsystem，t6ss)(s.wettstadt,a.filloux,manipulatingthetypevisecretionsystemspiketoshuttle378passengerproteins.plosone15,(2020)；e.deltordello,o.danilchanka,a.j.mccluskey,j.j.mekalanos,typevisecretionsystemsheathsasnanoparticlesforantigendisplay.pnatlacadsciusa113,3042-3047)。t6ss的组分和结构都与t4噬菌体的尾部高度相似，横跨细菌的内膜和外膜，能够针对不同的对象转运多种效应分子(毒力因子)来达到产生毒性的作用。3.在细菌和古细菌中，还发现有一种细胞外可伸缩注射系统(extracellularcontractileinjectionsystems，eciss)。eciss自身可被释放至细菌或古细菌外，并将装载在其中的效应分子注射到靶细胞中发挥作用。已知的eciss有发光杆菌属(photorhabdusspp.)中的毒力装置pvc(photorhabdusvirulencecassette)(g.yang,a.j.dowling,u.gerike,r.h.ffrench-constant,andn.r.waterfield,photorhabdusvirulencecassettesconferinjectableinsecticidalactivityagainstthewaxmoth.jbacteriol,2006.188(6):p.2254-61.)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)所分泌的r-绿脓杆菌素(r-typepyocin)(p.ge,d.scholl,p.g.leiman,x.yu,j.f.miller,andz.h.zhou,atomicstructuresofabactericidalcontractilenanotubeinitspre-andpostcontractionstates.natstructmolbiol,2015.22(5):p.377-82.)、沙雷氏菌(serratiaentomophila)中的afp(serratiaantifeedingprophage)(j.b.heymann,j.d.bartho,d.rybakova,h.p.venugopal,d.c.winkler,a.sen,m.r.hurst,anda.k.mitra,three‑ꢀdimensionalstructureofthetoxin-deliveryparticleantifeedingprophageofserratiaentomophila.jbiolchem,2013.288(35):p.25276-84.)、藤黄紫假交替单胞菌(pseudoalteromonasluteoviolacea)中与个体变态发育相关的可伸缩装置mac(metamorphosis-associatedcontractilestructure)(n.j.shikuma,m.pilhofer,g.l.weiss,m.g.hadfield,g.j.jensen,andd.k.newman,marinetubewormmetamorphosisinducedbyarraysofbacterialphagetail-likestructures.science,2014.343(6170):p.529-33.)等。4.蛋白质类药物因具有较高的特异性和较低的毒性，在疾病治疗领域具有独特的治疗潜力。然而，由于大分子蛋白质与小分子药物相比难以透过细胞膜进入细胞质内，目前大多数基于蛋白质类药物的治疗集中于靶向细胞外的靶点，这极大地限制了蛋白质类药物在疾病治疗中的应用。因此，需要开发有效地向细胞内递送蛋白质的方法，以扩大蛋白质类药物的应用范围。5.目前，本领域已开发出一些将蛋白质递送至细胞内的方法。借助物理原理开发的电穿孔法、显微注射法等，能够将蛋白质递送至胞内。但这些方法需要特殊的装置在细胞膜上造成穿孔，不适合在临床中应用。用细胞穿透肽或其他脂质对蛋白质类药物进行修饰，能够提高蛋白质的膜穿透性，但其制备过程及后续的纯化过程繁琐，不利于大规模生产。目前，应用较为广泛的蛋白质胞内递送方法是利用纳米载体包被蛋白质类药物，通过细胞的内吞作用将蛋白质递送至胞内。然而，进入胞内的蛋白质被截留在内体中，最终大多数的蛋白质类药物被内体中的蛋白酶降解，无法释放至细胞质发挥功能，严重限制了该蛋白质递送方法的效力。技术实现要素：6.发明人发现了信号肽，其位于非共生发光杆菌atcc43949的pvc-i、pvc-ii、pvc-iv或pvc-v基因簇下游的效应因子序列的n末端。当与待被注射到细胞中的多肽融合时，该信号肽能够稳定待被注射的多肽，并且能够引导待被注射的多肽以将待被注射的多肽装载到pvc装置中。通过将该信号肽融合到待被注射的多肽的n末端，形成的融合蛋白可以被pvc复合物识别并且切除信号肽，进而将待被注射的多肽装载到pvc鞘管内腔中，从而形成多肽注射系统，该多肽注射系统进而将该多肽注射到细胞内。7.令人意外的是，发明人发现，与对于待被注射到细胞中的多肽具有严格限制的其他纳米注射系统不同，该pvc复合物能够装载大范围的多肽，而不考虑它们的种类、尺寸、净电荷和构象，只要这些多肽的n末端与该信号肽融合。8.相应地，在第一方面，本发明提供了一种信号肽，该信号肽能够指导与其融合的多肽装载到发光杆菌毒力盒(pvc)的鞘管内腔中。该信号肽衍生自非共生发光杆菌(photorhabdusasymbiotic)的pvc基因簇下游的效应因子。9.在一些实施方案中，该非共生发光杆菌为photorhabdusasymbioticaatcc43949。10.非共生发光杆菌photorhabdusasymbiotica的基因组中包含五个发光杆菌毒力盒基因簇，分别为pvc-i、pvc-ii、pvc-iii、pvc-iv和pvc-v。每个pvc基因簇下游存在一个或多个编码潜在的效应因子的基因。具体地，pvc-i基因簇下游的编码潜在的效应因子的基因为pau_02009和pau_02010，pvc-ii基因簇下游的编码潜在的效应因子的基因为pau_02098和pau_02096，pvc‑ꢀiv基因簇下游的编码潜在的效应因子的基因为pau_02806基因，pvc-v基因簇下游的基因pau_03337和pau_03332别表达效应因子pdp1和pnf。11.在一些实施方案中，所述信号肽衍生自发光杆菌毒力盒pvc-i基因簇下游的效应因子cif(由pau_02009编码)的n末端40-70个氨基酸，例如50-70个氨基酸，50-60个氨基酸，50-55个氨基酸，或50-52个氨基酸，或者n末端40-60个氨基酸，例如n末端45-60个氨基酸、n末端40-55个氨基酸、n末端45-55个氨基酸、n末端47-53个氨基酸、n末端48-52个氨基酸、n末端49-51个氨基酸，最优选n末端50个氨基酸。优选的，所述信号肽衍生自编码所述发光杆菌毒力盒pvc-i基因簇下游的效应因子cif的n末端40个氨基酸、41个氨基酸、42个氨基酸、43个氨基酸、44个氨基酸、45个氨基酸、46个氨基酸、47个氨基酸、48个氨基酸、49个氨基酸、50个氨基酸、51个氨基酸、52个氨基酸、53个氨基酸、54个氨基酸、55个氨基酸、56个氨基酸、57个氨基酸、58个氨基酸、59个氨基酸、60个氨基酸、61个氨基酸、62个氨基酸、63个氨基酸、64个氨基酸、65个氨基酸、66个氨基酸、67个氨基酸、68个氨基酸、69个氨基酸，或70个氨基酸。所述效应因子cif的氨基酸序列如seqidno:2所示。12.在一些实施方案中，所述信号肽衍生自编码所述发光杆菌毒力盒pvc-i基因簇下游的效应因子tccc3(由pau_02010编码)的n末端40-70个氨基酸，例如50-70个氨基酸，50-60个氨基酸，50-55个氨基酸，或50-52个氨基酸，或者n末端40-60个氨基酸，例如n末端45-60个氨基酸、n末端40-55个氨基酸、n末端45-55个氨基酸、n末端47-53个氨基酸、n末端48-52个氨基酸、n末端49‑ꢀ51个氨基酸，最优选n末端50个氨基酸。优选的，所述信号肽衍生自编码所述发光杆菌毒力盒pvc-i基因簇下游的效应因子tccc3的n末端40个氨基酸、41个氨基酸、42个氨基酸、43个氨基酸、44个氨基酸、45个氨基酸、46个氨基酸、47个氨基酸、48个氨基酸、49个氨基酸、50个氨基酸、51个氨基酸、52个氨基酸、53个氨基酸、54个氨基酸、55个氨基酸、56个氨基酸、57个氨基酸、58个氨基酸、59个氨基酸、60个氨基酸、61个氨基酸、62个氨基酸、63个氨基酸、64个氨基酸、65个氨基酸、66个氨基酸、67个氨基酸、68个氨基酸、69个氨基酸，或70个氨基酸。所述效应因子tccc3的氨基酸序列如seqidno:6所示。13.在一些实施方案中，所述信号肽衍生自编码所述发光杆菌毒力盒pvc-ii基因簇下游的效应因子rrsp(由pau_02098编码)的n末端40-70个氨基酸，例如50-70个氨基酸，50-60个氨基酸，50-55个氨基酸，或50-52个氨基酸，或者n末端40-60个氨基酸，例如n末端45-60个氨基酸、n末端40-55个氨基酸、n末端45-55个氨基酸、n末端47-53个氨基酸、n末端48-52个氨基酸、n末端49‑ꢀ51个氨基酸，最优选n末端50个氨基酸。优选的，所述信号肽衍生自编码所述发光杆菌毒力盒pvc-ii基因簇下游的效应因子rrsp的n末端40个氨基酸、41个氨基酸、42个氨基酸、43个氨基酸、44个氨基酸、45个氨基酸、46个氨基酸、47个氨基酸、48个氨基酸、49个氨基酸、50个氨基酸、51个氨基酸、52个氨基酸、53个氨基酸、54个氨基酸、55个氨基酸、56个氨基酸、57个氨基酸、58个氨基酸、59个氨基酸、60个氨基酸、61个氨基酸、62个氨基酸、63个氨基酸、64个氨基酸、65个氨基酸、66个氨基酸、67个氨基酸、68个氨基酸、69个氨基酸，或70个氨基酸。所述效应因子rrsp的氨基酸序列如seqidno:10所示。14.在一些实施方案中，所述信号肽衍生自编码所述发光杆菌毒力盒pvc-ii基因簇下游的效应因子lopt(由pau_02096编码)的n末端40-70个氨基酸，例如50-70个氨基酸，50-60个氨基酸，50-55个氨基酸，或50-52个氨基酸，或者n末端40-60个氨基酸，例如n末端45-60个氨基酸、n末端40-55个氨基酸、n末端45-55个氨基酸、n末端47-53个氨基酸、n末端48-52个氨基酸、n末端49‑ꢀ51个氨基酸，最优选n末端50个氨基酸。优选的，所述信号肽衍生自编码所述发光杆菌毒力盒pvc-ii基因簇下游的效应因子lopt的n末端40个氨基酸、41个氨基酸、42个氨基酸、43个氨基酸、44个氨基酸、45个氨基酸、46个氨基酸、47个氨基酸、48个氨基酸、49个氨基酸、50个氨基酸、51个氨基酸、52个氨基酸、53个氨基酸、54个氨基酸、55个氨基酸、56个氨基酸、57个氨基酸、58个氨基酸、59个氨基酸、60个氨基酸、61个氨基酸、62个氨基酸、63个氨基酸、64个氨基酸、65个氨基酸、66个氨基酸、67个氨基酸、68个氨基酸、69个氨基酸，或70个氨基酸。所述效应因子lopt的氨基酸序列如seqidno:14所示。15.在一些实施方案中，所述信号肽衍生自编码所述发光杆菌毒力盒pvc‑ꢀiv基因簇下游的效应因子hrpn(由pau_02806编码)的n末端40-70个氨基酸，例如50-70个氨基酸，50-60个氨基酸，50-55个氨基酸，或50-52个氨基酸，或者n末端40-60个氨基酸，例如n末端45-60个氨基酸、n末端40-55个氨基酸、n末端45-55个氨基酸、n末端47-53个氨基酸、n末端48-52个氨基酸、n末端49-51个氨基酸，最优选n末端50个氨基酸。优选的，所述信号肽衍生自编码所述发光杆菌毒力盒pvc-iv基因簇下游的效应因子hrpn的n末端40个氨基酸、41个氨基酸、42个氨基酸、43个氨基酸、44个氨基酸、45个氨基酸、46个氨基酸、47个氨基酸、48个氨基酸、49个氨基酸、50个氨基酸、51个氨基酸、52个氨基酸、53个氨基酸、54个氨基酸、55个氨基酸、56个氨基酸、57个氨基酸、58个氨基酸、59个氨基酸、60个氨基酸、61个氨基酸、62个氨基酸、63个氨基酸、64个氨基酸、65个氨基酸、66个氨基酸、67个氨基酸、68个氨基酸、69个氨基酸，或70个氨基酸。所述效应因子hrpn的氨基酸序列如seqidno:18所示。16.在一些实施方案中，所述信号肽衍生自编码所述发光杆菌毒力盒pvc-v基因簇下游的效应因子pdp1(由pau_03337编码)的n末端40-70个氨基酸，例如50-70个氨基酸，50-60个氨基酸，50-55个氨基酸，或50-52个氨基酸，或者n末端40-60个氨基酸，例如n末端45-60个氨基酸、n末端40-55个氨基酸、n末端45-55个氨基酸、n末端47-53个氨基酸、n末端48-52个氨基酸、n末端49‑ꢀ51个氨基酸，最优选n末端50个氨基酸。优选的，所述信号肽衍生自编码所述发光杆菌毒力盒pvc-v基因簇下游的效应因子pdp1的n末端40个氨基酸、41个氨基酸、42个氨基酸、43个氨基酸、44个氨基酸、45个氨基酸、46个氨基酸、47个氨基酸、48个氨基酸、49个氨基酸、50个氨基酸、51个氨基酸、52个氨基酸、53个氨基酸、54个氨基酸、55个氨基酸、56个氨基酸、57个氨基酸、58个氨基酸、59个氨基酸、60个氨基酸、61个氨基酸、62个氨基酸、63个氨基酸、64个氨基酸、65个氨基酸、66个氨基酸、67个氨基酸、68个氨基酸、69个氨基酸，或70个氨基酸。所述效应因子pdp1的氨基酸序列如seqidno:22所示。17.在一些实施方案中，所述信号肽衍生自编码所述发光杆菌毒力盒pvc-v基因簇下游的效应因子pnf(由pau_03332编码)的n末端40-70个氨基酸，例如50-70个氨基酸，50-60个氨基酸，50-55个氨基酸，或50-52个氨基酸，或者n末端40-60个氨基酸，例如n末端45-60个氨基酸、n末端40-55个氨基酸、n末端45-55个氨基酸、n末端47-53个氨基酸、n末端48-52个氨基酸、n末端49-51个氨基酸，最优选n末端50个氨基酸。优选的，所述信号肽衍生自编码所述发光杆菌毒力盒pvc-v基因簇下游的效应因子pnf的n末端40个氨基酸、41个氨基酸、42个氨基酸、43个氨基酸、44个氨基酸、45个氨基酸、46个氨基酸、47个氨基酸、48个氨基酸、49个氨基酸、50个氨基酸、51个氨基酸、52个氨基酸、53个氨基酸、54个氨基酸、55个氨基酸、56个氨基酸、57个氨基酸、58个氨基酸、59个氨基酸、60个氨基酸、61个氨基酸、62个氨基酸、63个氨基酸、64个氨基酸、65个氨基酸、66个氨基酸、67个氨基酸、68个氨基酸、69个氨基酸，或70个氨基酸。所述效应因子pnf的氨基酸序列如seqidno:26所示。18.在一些实施方案中，所述信号肽包含与如seqidno:2、seqidno:6、seqidno:10、seqidno:14、seqidno:18、seqidno:22、seqidno:26所示的氨基酸序列内的n末端40-70个氨基酸(例如50-70个氨基酸，50‑ꢀ60个氨基酸，50-55个氨基酸，或50-52个氨基酸，或者n末端40-60个氨基酸，例如n末端45-60个氨基酸、n末端40-55个氨基酸、n末端45-55个氨基酸、n末端47-53个氨基酸、n末端48-52个氨基酸、n末端49-51个氨基酸)具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、或100％同一性的氨基酸序列。19.在一些实施方案中，所述信号肽包含与seqidno:3、seqidno:7、seqidno:11、seqidno:15、seqidno:19、seqidno:23、seqidno:27所示的氨基酸序列具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、或100％同一性的氨基酸序列。20.在一些实施方案中，本发明的信号肽包含与如seqidno:2、seqidno:6、seqidno:10、seqidno:14、seqidno:18、seqidno:22、或seqidno:26所示的氨基酸序列内的n末端40-70个氨基酸(例如50-70个氨基酸，50-60个氨基酸，50-55个氨基酸，或50-52个氨基酸，或者n末端40‑ꢀ60个氨基酸，例如n末端45-60个氨基酸、n末端40-55个氨基酸、n末端45-55个氨基酸、n末端47-53个氨基酸、n末端48-52个氨基酸、n末端49-51个氨基酸)相比具有1-5个，例如1个、2个、或3个氨基酸取代的氨基酸序列。21.在一些实施方案中，本发明的信号肽包含与seqidno:3、seqidno:7、seqidno:11、seqidno:15、seqidno:19、seqidno:23或seqidno:27相比具有1-5个，例如1个、2个、或3个氨基酸取代的氨基酸序列。22.在第二方面，本发明提供了一种核酸，其编码本发明所述的信号肽。23.在一些实施方案中，本发明的核酸包含与seqidno:4、seqidno:8、seqidno:12、seqidno:16、seqidno:20、seqidno:24、或seqidno:28的核苷酸序列具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、或100％同一性的核苷酸序列。24.在第三方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含多肽和本发明所述的信号肽，其中所述信号肽与所述多肽的n末端融合。在一些实施方案中，所述信号肽与所述多肽直接连接。在另一些实施方案中，所述信号肽与所述多肽通过接头连接。25.在一些实施方案中，接头可以是融合蛋白领域常用的接头。在一些优选的实施方案中，接头可以具有选自以下的序列：(ggggs)n、(gly)n、(eaaak)n、(xp)n(x可以是e、k或a等)、kesgsvsseqlaqfrsld、egkssgsgseskst、a(eaaak)4alea(eaaak)4a、gsagsaagsgef、papap、a(eaaak)na等。26.本发明的融合蛋白中的多肽可以通过信号肽的指导被导入pvc复合物的鞘管内腔，并且通过pvc复合物被注射到靶细胞的细胞质中。27.在一些实施方案中，本发明的融合蛋白是非天然存在的。即，在天然状态下，自然界中不存在如本发明所述的信号肽和多肽的融合形成的融合蛋白。换言之，该融合蛋白是通过重组技术人工合成的。28.在一些实施方案中，装载到pvc-v复合物的鞘管内腔中的多肽的分子量为5kda-200kda，例如10kda-200kda，15kda-200kda，20kda-200kda，25kdaꢀ‑200kda，30kda-200kda，40kda-200kda，5kda-180kda，10kda-180kda，15kda-180kda，20kda-180kda，25kda-180kda，30kda-180kda，40kda‑ꢀ180kda，5kda-160kda，10kda-160kda，15kda-160kda，20kda-160kda，25kda-160kda，30kda-160kda，40kda-160kda，5kda-150kda，10kda‑ꢀ150kda，15kda-150kda，20kda-150kda，25kda-150kda，30kda-150kda，40kda-150kda，5kda-140kda，10kda-140kda，15kda-140kda，20kda‑ꢀ140kda，25kda-140kda，30kda-140kda，或40kda-140kda。29.在一些实施方案中，装载到pvc-v复合物的鞘管内腔中的多肽的等电点为2至12。在一些优选的实施方案中，装载到pvc-v复合物的鞘管内腔中的多肽的等电点为2-11.5，例如2-11，2-10.5，2-10，2-9.5，2-9.10，2.5-11.5，2.5-11，2.5-10.5，2.5-10，2.5-9.5，2.5-9.10，3-11.5，3-11，3-10.5，3-10，3‑ꢀ9.5，3-9.10，3.5-11.5，3.5-11，3.5-10.5，3.5-10，3.5-9.5，3.5-9.10，4-11.5，4-11，4-10.5，4-10，4-9.5，4-9.10，4.5-11.5，4.5-11，4.5-10.5，4.5-10，4.5‑ꢀ9.5，4.5-9.10，4.6-11.5，4.6-11，4.6-10.5，4.6-10，4.6-9.5，或4.6-9.10。30.在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是信号通路调节蛋白。31.在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是结构蛋白。32.在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是转运蛋白。33.在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是激素或激素调节分子，该激素调节分子可以调节激素的表达和/或分泌。34.在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是细胞毒素(cytotoxin)。通过与信号肽融合，该细胞毒素可以被装载到pvc-v复合物的鞘管内腔中，并且被pvc-v复合物注射到细胞内，从而对细胞产生毒性和杀伤作用。在一些实施方案中，所述细胞可以是肿瘤细胞。在一些实施方案中，可用于本发明的细胞毒素可以选自exou、exotoxina、saporin、trichosanthin、nlec、caga和来自栝楼(trichosantheskirilowii)的tcst。35.在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是抗血管生成抑制剂，其可以被pvc-v复合物转入肿瘤组织的细胞中，从而抑制血管生成，实现抑制肿瘤生长的目的。36.在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是抗原或免疫原。37.在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是病原体特异性抗原。所述病原体特异性抗原可以是细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体、寄生虫等病原体特异性抗原。本发明的多肽注射系统可以用于在体外与细胞孵育以将多肽注射系统中的病原体特异性抗原注射到该细胞中，从而制成与该病原体特异性抗原相对应的的疫苗。在施用于受试者后，该疫苗可以用于在受试者体内诱导针对该病原体特异性抗原多肽的免疫应答，从而预防或治疗该病原体感染及其相关疾病。38.在一些具体的实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是疟原虫特异性抗原，例如镰状疟原虫(plasmodiumfalciparum)特异性抗原pfsir2a、pfrh5。39.在一些实施方案中，本发明所述融合蛋白中的多肽可以是生物体自身某种类型细胞的特异性抗原或相关抗原。在一些实施方案中，本发明所述融合蛋白中的多肽可以是肿瘤特异性抗原(tumorspecificantigen，tsa)或肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，taa)。本发明的多肽注射系统可以用于在体外与细胞孵育以将多肽注射系统中的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原注射到该细胞中，从而制成与该肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原相对应的肿瘤的疫苗。在施用于受试者后，该疫苗可以在受试者体内诱导针对该多肽的免疫应答，从而预防或治疗相关肿瘤。所述细胞可以是人胚胎肾细胞hek293、抗原呈递细胞(例如树突状细胞)等。40.例如，被装载到pvc-v的鞘管内腔中并且注射到细胞中的多肽可以是黑素瘤抗原trp2，从而制成抗黑素瘤的疫苗或药物，用于施用至受试者从而在受试者体内诱导产生抗trp2的免疫应答，从而用于预防或治疗黑素瘤。所述多肽还可以是例如spi2、癌胚抗原(cea)等。41.在一些实施方案中，本发明所述融合蛋白中的多肽可以是来源于导致某种疾病形成或进展的蛋白质的抗原。可以通过本发明的多肽注射系统将该抗原注射到抗原呈递细胞中，从而制成疫苗。在施用于受试者后，该疫苗可以引起针对该导致某种疾病形成或进展的蛋白质的免疫应答。在一些具体的实施方案中，本发明所述融合蛋白中的多肽可以是导致肾小管损伤的参与细胞焦亡(或炎性凋亡)的蛋白gsdmd(gasdermind)或gsdmd-nt(将gsdmd在asp276和asp275后切割而获得的)。在一些具体的实施方案中，本发明所述融合蛋白中的多肽可以是来源于导致肿瘤形成或进展的蛋白质的抗原。例如rhoa，其可以调控肌动蛋白聚合、细胞粘附、细胞转化、和参与与肿瘤细胞的浸润和转移密切相关的细胞移动、增殖、迁移。42.在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是标签蛋白或报告蛋白。该标签蛋白或报告蛋白可以被本发明的多肽注射系统注射到细胞中，通过检测该标签蛋白或报告蛋白的信号而表征该细胞。例如，所述标签蛋白或报告蛋白可以是blam、荧光素酶、cyaa、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶(cat)、分泌型践行磷酸酶(seap)、荧光蛋白等。在一些实施方案中，装载到pvc-v复合物的鞘管内腔中的多肽可以是标签蛋白或报告蛋白例如blam、renillaluciferase或mrfp。43.在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是抗菌肽。抗菌肽可以被本发明的多肽注射系统注射到细胞中，从而在细胞中发挥抗病原体的作用。例如，所述抗菌肽可以是防御素(defensins)、cecropina及其类似物、蛙皮素(magainins)、melitiin、天蚕素(cecropins)、cathelicidin、apidaecins、drosocin、coleoptericin和半翅肽(hemiptericin)、bactenecin、cecropin、人中心粒细胞肽-1(hnp-1)、hbd-1、hepcidin25、e50-52、pk34等。44.在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是酶。该酶可以被本发明的多肽注射系统注射到细胞中从而在该细胞中发挥相应的催化作用。在一些实施方案中，所述酶是参与细胞代谢的酶。45.在一些实施方案中，所述酶可以选自aritilysin、重组噬菌体裂解酶lyssap26、核糖核酸酶rnase3和rnase7。46.在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是基因编辑蛋白。该基因编辑蛋白可以被本发明的多肽注射蛋白注射到待编辑基因的细胞中，从而在该细胞中发挥基因编辑的功能。基因编辑蛋白可以是，例如，锌指核酸酶、talen核酸酶、cas9、cas12(以前被称为cpf1)、cas12a、cas13、cas13a、cas13b等。47.在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是细菌分泌系统的效应因子。在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是t3ss效应因子，例如ecespn、eccif、paexou、ecnlec、sfospb、sfospf、ypyopt。在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是t4ss效应因子，例如lpankb、babspb、hpcaga。在另一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白中的多肽可以是t6ss效应因子，例如etevpp、bcteca、pptge2、ypyezp、patse1、patse3、paplda、papldb。48.在第四方面，本发明提供了一种核酸，其编码本发明所述的融合蛋白的核苷酸序列。49.在第五方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明所述的编码融合蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明的载体可以是质粒。50.在一些实施方案中，本发明的载体还包含编码非共生发光杆菌的发光杆菌毒力盒v(pvc-v)结构蛋白的核苷酸序列，优选地，所述pvc-v结构蛋白包括pvc1、pvc2、pvc3、pvc4、pvc5、pvc6、pvc7、pvc8、pvc9、pvc10、pvc11、pvc12、pvc13、pvc14、pvc15和pvc16。51.在第六方面，本发明提供了一种宿主细胞。52.在一些实施方案中，本发明的宿主细胞包含载体，所述载体包含本发明所述的编码融合蛋白的核苷酸序列和编码非共生发光杆菌的发光杆菌毒力盒v(pvc-v)结构蛋白的核苷酸序列。优选地，所述pvc-v结构蛋白包括pvc1、pvc2、pvc3、pvc4、pvc5、pvc6、pvc7、pvc8、pvc9、pvc10、pvc11、pvc12、pvc13、pvc14、pvc15和pvc16。本发明的宿主细胞能够表达pvc-v结构蛋白并且组装成完整的pvc-v复合物，还能够表达本发明所述的融合多肽。在该宿主细胞中，所述融合多肽中的信号肽被切除，并且去除了信号肽的多肽被装载到pvc-v复合物的鞘管内腔中。在优选的实施方案中，所述宿主细胞还能够表达lysr调控子。53.在一些实施方案中，所述宿主细胞包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码根据本发明第三方面所述的融合蛋白，所述第二核苷酸序列编码非共生发光杆菌的pvc-v结构蛋白的核苷酸序列，优选地，所述pvc-v结构蛋白包括pvc1、pvc2、pvc3、pvc4、pvc5、pvc6、pvc7、pvc8、pvc9、pvc10、pvc11、pvc12、pvc13、pvc14、pvc15和pvc16，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列在相同或不同的载体上。54.本发明的宿主细胞能够表达pvc-v结构蛋白并且组装成完整的pvc-v复合物，还能够表达本发明所述的融合多肽。在该宿主细胞中，所述融合多肽中的信号肽被切除，并且去除了信号肽的多肽被装载到pvc-v复合物的鞘管内腔中。在优选的实施方案中，所述宿主细胞还能够表达lysr调控子。55.在进一步优选的实施方案中，所述宿主细胞包含：56.a.第一载体，所述第一载体包含编码lysr调控子的基因，优选该基因在其天然启动子的控制下，所述第一载体优选为质粒，更优选为pbr60；57.b.第二载体，所述第二载体包含编码非共生发光杆菌的发光杆菌毒力盒v(pvc-v)结构蛋白的核苷酸序列，所述载体优选为质粒，更优选为pcnm3质粒，优选地，所述pvc-v结构蛋白包括pvc1、pvc2、pvc3、pvc4、pvc5、pvc6、pvc7、pvc8、pvc9、pvc10、pvc11、pvc12、pvc13、pvc14、pvc15和pvc16；和58.c.第三载体，所述第三载体包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。59.在一些实施方案中，本发明的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞可以是细菌、真菌细胞、动物细胞或植物细胞。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞是原核细胞，更优选为大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌epi300菌株细胞。60.在第七方面，本发明提供了一种多肽注射系统，其包含pvc-v复合物和装载在所述pvc-v复合物中的多肽。所述多肽通过在其n端与本发明的信号肽融合从而装载至所述pvc-v复合物中。61.在一些实施方案中，装载到pvc-v复合物中的多肽的分子量为5kda‑ꢀ200kda，例如10kda-200kda，15kda-200kda，20kda-200kda，25kda‑ꢀ200kda，30kda-200kda，40kda-200kda，5kda-180kda，10kda-180kda，15kda-180kda，20kda-180kda，25kda-180kda，30kda-180kda，40kda‑ꢀ180kda，5kda-160kda，10kda-160kda，15kda-160kda，20kda-160kda，25kda-160kda，30kda-160kda，40kda-160kda，5kda-150kda，10kda‑ꢀ150kda，15kda-150kda，20kda-150kda，25kda-150kda，30kda-150kda，40kda-150kda，5kda-140kda，10kda-140kda，15kda-140kda，20kda‑ꢀ140kda，25kda-140kda，30kda-140kda，40kda-140kda。62.在一些实施方案中，装载到pvc-v复合物的鞘管内腔中的多肽的等电点为2至12。在一些优选的实施方案中，装载到pvc-v复合物的鞘管内腔中的多肽的等电点为2-11.5，2-11，2-10.5，2-10，2-9.5，2-9.10，2.5-11.5，2.5-11，2.5-10.5，2.5-10，2.5-9.5，2.5-9.10，3-11.5，3-11，3-10.5，3-10，3-9.5，3‑ꢀ9.10，3.5-11.5，3.5-11，3.5-10.5，3.5-10，3.5-9.5，3.5-9.10，4-11.5，4-11，4-10.5，4-10，4-9.5，4-9.10，4.5-11.5，4.5-11，4.5-10.5，4.5-10，4.5-9.5，4.5‑ꢀ9.10，4.6-11.5，4.6-11，4.6-10.5，4.6-10，4.6-9.5，4.6-9.10。63.在一些实施方案中，所述多肽选自信号通路调节蛋白、结构蛋白、转运蛋白、激素或激素调节分子、细胞毒素、抗原或免疫原、标签蛋白或报告蛋白、抗菌肽、参与细胞代谢的酶和基因编辑蛋白，例如如上文中所述。64.在第八方面，本发明提供了一种制备本发明所述的多肽注射系统的方法，包括培养本发明所述的宿主细胞，以使所述宿主细胞表达并组装pvc-v复合物以及包含信号肽和多肽的融合蛋白，并且将所述多肽装载到pvc-v复合物中而制成所述多肽注射系统。在一些实施方案中，所述宿主细胞将制成的多肽注射系统分泌到细胞外。在一些实施方案中，所述方法还包括从培养的宿主细胞或其上清液分离所述多肽注射系统。65.在第九方面，本发明提供了一种将多肽转入靶细胞的方法，其包括：将本发明所述的多肽注射系统与靶细胞接触，使得所述多肽注射系统将装载的多肽注射到所述靶细胞中。66.在第十方面，本发明提供了一种组合物，其包含根据本发明的第一方面的信号肽、第二方面的核酸、第三方面的融合蛋白、第四方面的核酸、第五方面的载体、第六方面的宿主细胞、或第七方面的多肽注射系统。67.在第十一方面，本发明提供了一种调节细胞中的信号传导的方法，所述方法包括使所述细胞与多肽注射系统接触，所述多肽注射系统包含非共生发光杆菌的pvc-v和装载在所述pvc-v中的信号通路调节蛋白，其中所述信号通路调节蛋白通过在其n端与本发明的信号肽融合从而装载至所述pvc-v中。68.在第十二方面，本发明提供了一种调节细胞中的代谢的方法，所述方法包括使所述细胞与多肽注射系统接触，所述多肽注射系统包含非共生发光杆菌的pvc-v和装载在所述pvc-v中的参与细胞代谢的酶，其中所述参与细胞代谢的酶通过在其n端与本发明的信号肽融合从而装载至所述pvc-v中。69.在第十三方面，本发明提供了一种调节细胞中的分子的转运和/或分泌的方法，所述方法包括使所述细胞与多肽注射系统接触，所述多肽注射系统包含非共生发光杆菌的pvc-v和装载在所述pvc-v中的转运蛋白，其中所述转运蛋白通过在其n端与本发明的信号肽融合从而装载至所述pvc-v中。70.在第十四方面，本发明提供了一种诱导对细胞的杀伤的方法，所述方法包括使所述细胞与多肽注射系统接触，所述多肽注射系统包含非共生发光杆菌的pvc-v和装载在所述pvc-v中的细胞毒素，其中所述细胞毒素通过在其n端与本发明的信号肽融合从而装载至所述pvc-v中。71.在第十五方面，本发明提供了一种对细胞进行基因编辑的方法，所述方法包括使所述细胞与多肽注射系统接触，所述多肽注射系统包含非共生发光杆菌的pvc-v和装载在所述pvc-v中的基因编辑蛋白，其中所述基因编辑蛋白通过在其n端与本发明的信号肽融合从而装载至所述pvc-v中。72.在第十六方面，本发明提供了一种对细胞进行标记的方法，所述方法包括使所述细胞与多肽注射系统接触，所述多肽注射系统包含非共生发光杆菌的pvc-v和装载在所述pvc-v中的标签蛋白或报告蛋白，其中所述标签蛋白或报告蛋白通过在其n端与本发明的信号肽融合从而装载至所述pvc-v中。73.在第十七方面，本发明提供了一种提高细胞的抗病原体能力的方法，所述方法包括使所述细胞与多肽注射系统接触，所述多肽注射系统包含非共生发光杆菌的pvc-v和装载在所述pvc-v中的抗菌肽，其中所述抗菌肽通过在其n端与本发明的信号肽融合从而装载至所述pvc-v中。74.在第十七方面，本发明提供了一种制备细胞疫苗的方法，所述方法包括使细胞与多肽注射系统接触，所述多肽注射系统包含非共生发光杆菌的pvc‑ꢀv和装载在所述pvc-v中的抗原或免疫原，其中所述抗原或免疫原通过在其n端与本发明的信号肽融合从而装载至所述pvc-v中。75.在第十八方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，其包括肿瘤内注射本发明所述的多肽注射系统，其中所述多肽注射系统为pvc-v复合物，其中所述pvc-v的鞘管内腔中装载有多肽型抗癌药剂。76.在一些实施方案中，装载在pvc-v复合物的鞘管内腔中的多肽型抗癌药剂为细胞毒素，优选为exou、exotoxina、saporin、trichosanthin、nlec、caga、或tcst等。77.在一些实施方案中，所述癌症可以是鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌癌症、肝癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、白血病等淋巴组织增生性疾病和各种类型的头颈癌。附图说明78.图1示出了非共生发光杆菌(photorhabdusasymbiotica)的染色体中五个pvc基因座的示意图，每个pvc基因座中的左侧部分为结构基因，推定的效应因子基因为灰色。79.图2中的结果显示了来自pvc-i、pvc-ii、pvc-iv的效应因子(通过flag标签标记)能够分别被装载到pvc-v复合物中。80.图3示出了当与其同源物进行比对时pvc效应因子中额外的n末端肽的示意图。pa,非共生发光杆菌(photorhabdusasymbiotica)；bp,假鼻疽伯克霍尔德菌(burkholderiapseudomallei)；cn,奈氏西地西菌(cedeceaneteri)；ec,大肠杆菌(escherichiacoli)；cv,chromobacteriumvaccinii；ps,斯氏普罗威登斯菌(providenciastuartii)；pc,菊苣属假单胞菌(pseudomonascichorii)；md,moritelladasanensis；vv,创伤弧菌(vibriovulnificus)；ad,aeromonasdhakensis；yp,鼠疫耶尔森菌(yersiniapestis)；hd,杜克雷嗜血杆菌(haemophilusducreyi)；pm,多杀巴斯德菌(pasteurellamultocida)；se,肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)；bu,burkholderiaubonensis；ka,产气克雷伯氏杆菌(klebsiellaaerogenes)；bb,支气管炎博德特菌(bordetellabronchiseptica)；pau,photorhabdusaustralis；la,抗生素溶杆菌(lysobacterantibioticus)。81.图4：图4a示出了上载的pdp1和pnf蛋白与flag磁珠的免疫沉淀，可以清晰地观察到小的切割蛋白条带(框)。图4b示出了来自图4a中pdp1和pnf免疫沉淀物的切割条带n末端序列的质谱分析。82.图5：图5a示出了n末端序列在稳定pdp1/pnf方面是重要的，在缺失n末端50个氨基酸的pdp1或pnf的情况下，在氯霉素处理指定时间后，检测到pdp1或pnf变体的产生。图5b示出了在细菌裂解物和纯化的pvc中检测到具有或不具有n50末端氨基酸的效应因子，pvc16用作对照。显示了至少三个独立实验的代表性图片。图5c示出了缺失n末端70个氨基酸而非缺失n末端50个氨基酸完全不能产生pnf蛋白。83.图6示出了通过蛋白质免疫印迹检测到报告蛋白blam、mrfp、nanoluc和rluc在pnf或pdp1n50-sp的指导下被装载到pvc复合物中。pvc16用作对照。84.图7：图7a示出了在用系列浓度的含有水母荧光素酶(rluc)的pvc溶液处理的j774宿主细胞中光致发光的监测，pvc溶液的起始浓度为5mg/ml。误差棒表示三个独立实验(n＝3)的平均值和sd。图7b示出了在用系列pvc稀释液处理后，确定在j774细胞中的蓝色(450nm)与绿色(520nm)荧光之间的比率，指示通过pvc进行的sp指导的blam转移到宿主细胞中。误差棒显示三个独立实验(n＝3)的平均值和sd。85.图8示出了丙氨酸扫描的结果。探测pnfn50-rluc的丙氨酸置换突变对于装载到pvc复合体中的影响。显示了来自至少2个独立实验的代表性照片。86.图9示出了来自t3ss、t4ss和t6ss的效应因子的装载和转移。图9a示出了不同t3ss效应因子在pnf或pdp1n50-sp的指导下装载到pvc中。图9b示出了多种t4ss效应因子在sp的指导下装载到pvc复合物中。图9c示出了多种t6ss效应因子装载到pvc复合物中。图9d示出了多种t7ss效应因子装载到pvc复合物中。87.图10：图10a示出了用携带exou的pvc处理24小时后j774宿主细胞的细胞毒性测定。图10b示出了使用wst-8作为底物测量来自图10a的相对细胞存活力。误差棒显示三个独立实验(n＝3)的平均值和sd。88.图11：图11a示出了通过pvc递送的n1ec效应因子切割来自宿主细胞中nf-κb信号传导途径的p65蛋白。图11b示出了来自宿主细胞的akt蛋白被pvc递送的幽门螺杆菌caga效应因子激活。50μg/mllps用作阳性对照。89.图12示出了真核蛋白装载到pvc中。图12a示出了多种来自真核细胞的蛋白质被n50-sp融合指导进入pvc复合物中。图12b示出了具有抗肿瘤活性的核糖体失或蛋白tcst在pnfn50-sp的帮助下被装载到pvc中。90.图13示出了用pvc+tcst处理后还观察到显著的j664细胞死亡。误差棒显示三个独立实验(n＝3)的平均值和sd。91.图14示出了肿瘤接种和pvc施用的实验设计方案，红色箭头代表施用pvc的时间。92.图15：图15a示出了负荷j774肿瘤的小鼠模型中pvc递送后的tcst的肿瘤生长曲线。在pvc+tcst，而非单独pvc或pbs，注射后，肿瘤尺寸显著减小。误差棒显示平均值±sem。在pvc+tcst的样品和pbs之间进行统计学分析。图15b示出了在小鼠模型pvc处理之后的肿瘤重量，误差棒显示平均值±sem。93.图16示出了负荷j774肿瘤的小用多种pvc溶液和pbs处理的小鼠的体重变化。94.序列表：95.表1中示出了本发明中使用的核苷酸和氨基酸序列的信息。96.97.98.99.100.101.102.103.[0104][0105]定义：[0106]除非另有说明，否则本文中使用的术语的含义为本领域常用的含义。[0107]术语“可收缩注射系统(contractileinjectionsystem,cis)”是一系列多样但进化相关的利用可收缩鞘管的组件输送核酸和蛋白质的大分子装置。可收缩注射系统可以帮助微生物将多种效应分子转运至胞外以使其获得生存优势(n.m.i.taylor,m.j.vanraaij,andp.g.leiman,contractileinjectionsystemsofbacteriophagesandrelatedsystems.molmicrobiol,2018.108(1):p.6‑ꢀ15.)。可收缩注射系统包括典型的cis(包括噬菌体t4、p2和mu的可收缩尾部)。除了可收缩的噬菌体外，类似于于噬菌体尾部的可收缩注射系统也普遍存在于细菌及古细菌中。例如vi型分泌系统(typevisecretionsystem,t6ss)，其用于介导细胞间通信和发挥细胞防御作用(n.m.i.taylor,m.j.vanraaij,andp.g.leiman,contractileinjectionsystemsofbacteriophagesandrelatedsystems.molmicrobiol,2018.108(1):p.6-15.)。可收缩注射系统还包括细胞外可收缩注射系统(extracellularcis,ecis)。[0108]术语“细胞外可收缩注射系统”或“ecis”是一种可以被释放到胞外并从外部空间攻击靶细胞的可收缩注射系统。细胞外可收缩注射系统包括细菌的tailocin/pyocin，以及在发光杆菌属中发现的发光杆菌毒力盒(photorhabdusvirulencecassette)(简称为pvc)(g.yang,等人,photorhabdusvirulencecassettesconferinjectableinsecticidalactivityagainstthewaxmoth.jbacteriol,2006.188(6):p.2254-61.)、antifeedingprophage(afp)(a.desfosses,h.venugopal,t.joshi,j.felix,m.jessop,h.jeong,j.hyun,j.b.heymann,m.r.h.hurst,i.gutsche,anda.k.mitra,atomicstructuresofanentirecontractileinjectionsysteminboththeextendedandcontractedstates.naturemicrobiology,2019.4(11):p.1885-1894.)和metamorphosis-associatedcontractilestructure(mac)(n.j.shikuma等人，marinetubewormmetamorphosisinducedbyarraysofbacterialphagetail-likestructures.science,2014.343(6170):p.529‑ꢀ33.)等。[0109]非共生发光杆菌(photorhabdusasymbiotica)属于发光杆菌属(photorhabdus)。通常，发光杆菌属的细菌被认为是昆虫的病原体，但是非共生发光杆菌能够感染人(p.wilkinson,等人，comparativegenomicsoftheemerginghumanpathogenphotorhabdusasymbioticawiththeinsectpathogenphotorhabdusluminescens.bmcgenomics,2009.10:p.302)。[0110]术语“pvc”一般是指发光杆菌属产生的一种可收缩注射系统。非共生发光杆菌photorhabdusasymbioticaatcc43949的pvc是一种超过10-mda的蛋白质复合体装置，其结构类似于简化的t4噬菌体尾部，包含具有六根纤维的六边形底板复合体(baseplatecomplex)以及具有帽子结构的117nm长的鞘管(sheath)主干，鞘管内部包含内腔(innertube)，效应蛋白装载在内腔中。pvc能被细菌释放到胞外以起作用。pvc通常被认为能够对真核细胞起毒性作用，因为它可以将效应蛋白转移到昆虫血细胞中并促进肌动蛋白的聚集(g.yang,等人，photorhabdusvirulencecassettesconferinjectableinsecticidalactivityagainstthewaxmoth.jbacteriol,2006.188(6):p.2254-61.)。在本发明的上下文中，pvc是指分离自非共生发光杆菌photorhabdusasymbioticaatcc43949或本文所述的宿主细胞的可收缩注射系统，其能够穿透人的细胞膜而将pvc的鞘管内的多肽或蛋白质输送到人类细胞的细胞质中。非共生发光杆菌中共有五种pvc，分别为pvc-i、pvc-ii、pvc-iii、pvc-iv、pvc-v。[0111]在本发明的上下文中，“pvc基因簇”是指存在于非共生发光杆菌photorhabdusasymbiotica(例如photorhabdusasymbioticaatcc43949)的基因组中的编码pvc的多个结构蛋白的基因簇。非共生发光杆菌的基因组中共有5个pvc基因簇，分别为pvc-i、pvc-ii、pvc-iii、pvc-iv、pvc-v。每个pvc基因簇下游还存在一个或多个潜在的编码效应因子的基因。[0112]“信号肽”一般是指引导合成的多肽或蛋白质向靶标转移的肽链。在本发明的上下文中，“信号肽”能够将待输送的多肽或蛋白质引导到pvc复合物的鞘管内腔中的肽链。[0113]“效应因子”在本发明中是细菌产生的通过分泌系统转运至植物或动物细胞内，起识别或致病作用的细菌分泌蛋白。效应因子从结构上可以分为信号区和功能区。[0114]术语“发光杆菌毒力盒基因簇下游的效应因子”是指在发光杆菌的基因组中的发光杆菌毒力盒(pvc)基因簇下游的能够被转运至目标细胞中的分泌蛋白。[0115]术语“衍生自”是指来源于亲本并且可以经过修饰(取代、缺失和/或插入)并且保持亲本序列的功能。在发明的上下文中，“信号肽衍生自pvc基因簇下游的效应因子的n末端信号肽”是指该信号肽是亲本pvc基因簇下游的效应因子的n末端信号肽、或在此基础上经过修饰(取代、缺失和/或插入)并且保持亲本信号肽功能的信号肽。[0116]如本文所用的术语“同一性百分比”是指两个氨基酸序列之间的同源性百分比等同于两个序列之间的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是所述序列共有的相同位置的数量的函数(即，％同源性＝相同位置的数量/位置总数×100)，要考虑需要为了最佳比对两个序列而引入的缺口的数量和每个缺口的长度。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成，如下面的非限制性实例中所述。可以使用e.meyers和w.miller(comput.appl.biosci.,4:11-17(1988))的算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已并入align程序(2.0版)，使用pam120加权残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。此外，可以使用needleman和wunsch(j.mol.biol.48:444-453(1970))算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已并入gcg软件包中的gap程序(可在www.gcg.com上获得)，使用blossum62矩阵或pam250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。[0117]术语“等电点”是指分子表面不带电荷时的ph值。是针对带电荷的物质而言，不只限于两性电解质如氨基酸和蛋白质。多肽或蛋白质是两性电解质，其等电点和它所含的酸性氨基酸和碱性氨基酸的数量比例有关。各种多肽或蛋白质因氨基酸残基组成不同，等电点也不一样。当溶液在某一特定ph值的条件下，多肽或蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等(总净电荷为零)时，在电场中既不向阳极移动，也不向阴极移动。因此利用电泳的方法可以确定多肽或蛋白质的等电点。[0118]术语“载体”(vector)，指在基因工程重组dna技术中将dna片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的dna分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。[0119]术语“pvc的结构蛋白”或“pvc的亚基”是指组成pvc复合物结构的单体蛋白。[0120]lysr型转录调节因子(lttr)家族从赖氨酸受体lysa的调控激活子lysr得名。它们高度保守，普遍存在于细菌，在古细菌和真核生物中也发现了它们的同源蛋白。通过序列相似性及dna结合域(dna-binding-domain)保守性比较，lttr家族至少有九个功能类似的转录调节蛋白(在escherichiacoli,salmonellaentericaserovartyphimurium，rhizobiumspp.和enterobactercloacae等细菌中均有鉴定)。最初lttr被描述为一个转录基因的转录激活因子。后续的研究表明它们是细菌的一类整体转录调控蛋白，作为转录基因的激活子或抑制子发挥作用。lysr调控子对pvc基因簇具有调控作用。lysr蛋白参与了p.asymbiotica的细胞侵染粘附等作用。[0121]本文中使用的术语“多肽”是指由三个或三个以上氨基酸分子以肽键连接在一起而形成的分子。“蛋白质”是由α-氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按照其特定方式结合而成的高分子化合物。在本发明的上下文中，术语“多肽”包括蛋白质。[0122]术语“癌症”或“肿瘤”通常是指以不受控制的细胞生长/增殖为特征的哺乳动物的生理状况。癌症的实例包括癌、淋巴瘤(例如霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病，但不限于此。癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、pau_02805(hrpn：核苷酸序列为seqidno:17，氨基酸序列为seqidno:18)；在pvc-v基因座下游的推定的效应因子为pau_03337(pdp1：核苷酸序列为seqidno:21，氨基酸序列为seqidno:22)和pau_03332(pnf：核苷酸序列为seqidno:25，氨基酸序列为seqidno:26)。[0133]发明人先前的研究已经表明，pvc-v基因簇下游的两个效应因子pnf和pdp1能够被装载到pvc-v复合物中并且被pvc-v复合物转移到靶细胞内，并且产生细胞毒性(x.wang等人，characterizationofphotorhabdusvirulencecassetteasacausativeagentintheemergingpathogenphotorhabdusasymbiotica,scichinalifesci,(2021))。[0134]为了确定photorhabdusasymbioticaatcc43949中其他推定的pvc效应因子是否也能够被装载到该pvc-v复合物中，发明人构建了大肠杆菌，其中共表达pvc-v复合物和c末端用flag标签标记的效应因子，并且用蛋白质免疫印迹分析检测上清液中效应因子的存在。具体方法如下。[0135]细菌菌株和培养方法[0136]大肠杆菌在lb培养基中在37℃培养。大肠杆菌菌株top10用于dna操作，并且大肠杆菌epi300用于pvc和效应因子表达。[0137]表达效应因子的质粒pbbrn的构建[0138]从广泛宿主范围的克隆载体质粒pbbr1mcs5(f.jiang等人，cryo-emstructureandassemblyofanextracellularcontractileinjectionsystem,cell177,370-383e315(2019))出发，通过将新的ndei位点引入laczα基因中用于去除质粒pbbr1mcs5中原来存在的n末端的20个氨基酸融合，以在laczα基因的起始位置产生起始密码子，从而产生pbbrn质粒。[0139]使用q5高保真dna聚合酶(购买自newenglandbiolabs)使用p.asymbioticaatcc43949的基因组dna作为模板，扩增pvc-i、pvc-ii、pvc‑ꢀiv和pvc-v下游的效应因子基因(分别为pau_02009(cif)、pau_02010(tccc3)、pau_02098(rrsp)、pau_02096(lopt)、pau_02805(hrpn)、pau_03337(pdp1)和pau_03332(pnf)))的dna序列。将flag标签序列引入每个效应因子编码序列的c末端。[0140]分别将扩增的效应因子基因片段(pau_02009、pau_02010、pau_02098、pau_02096、pau_02805、pau_02805、pau_03337(pdp1)和pau_03332(pnf)))克隆到pbbrn质粒中，在大肠杆菌top10中扩增。[0141]pvc的产生和纯化[0142]使用先前公开的文献(f.jiang等人，cryo-emstructureandassemblyofanextracellularcontractileinjectionsystem,cell177,370-383e315(2019))进行pvc的产生和纯化步骤，并进行了少许改动。简而言之，在组成型表达载体pbr322质粒的基础上引入lys-r调控子的编码基因，从而构建在其天然启动子下产生lys-r调控子的第一质粒pbr60。将第一质粒pbr60转化到大肠杆菌epi300菌株中，该大肠杆菌本身携带表达pvc-v结构基因的第二质粒pcnm3。再将从上述大肠杆菌top10中提取的表达效应因子-flag的第三pbbrn质粒转化到该epi300菌株中。将过夜培养物接种到200ml的lb肉汤培养基中，在30℃生长16小时。[0143]收集细菌沉淀物，并且在37℃在30ml缓冲液p(25mmtris,ph7.4,140mmnacl,3mmkcl,50μg/mldnasei,200μg/ml溶菌酶,0.5％tritonx-100,5mmmgcl2,1×蛋白酶抑制剂(medchemexpress))中裂解30分钟。将细胞裂解物离心(14,000rpm，10分钟)后，收集上清液，将上清液在150,000×g下在4℃超速离心60分钟。离心后将沉淀物重悬在1ml无菌pbs中。在14,000rpm下在4℃再次离心10分钟后，将上清液再次在150,000×g下在4℃超速离心60分钟，从而沉淀该pvc-v复合物。将沉淀物重悬于200μl冰冷的pbs中，并且在14,000rpm下在4℃离心10分钟。将含有该pvc-v复合物的上清液保存在4℃用于短期使用。[0144]蛋白质印迹分析[0145]将纯化的pvc颗粒在100℃用1xsds上载缓冲液中加热10分钟。然后将样品上载到novextm4-20％tris-甘氨酸蛋白质凝胶上用于分离。使用bio-rad半干转膜仪将凝胶转移到nc膜(millipore)。进行用于膜探针探测的标准程序，以检测感兴趣的蛋白质条带。通过使用抗-flag(克隆m2)单克隆抗体(sigma，f3165)作为一抗，和山羊抗小鼠二抗(hrp)和piercetmeclplus蛋白质印迹底物，然后通过tanon5200(tanon)可视化，以进行检测。[0146]结果[0147]如图2所示，在分离的pvc-v复合物中能够检测到pvc-i、pvc-ii、pvc‑ꢀiv下游的效应因子(分别为pau_02009、pau_02010、pau_02098、pau_02096、pau_02805)。这提示了pvc效应因子的装载存在共同机制。[0148]通过对pcv效应因子和来自其它菌种的其同源物进行比对，发现从pvc‑ꢀi、pvc-ii、pvc-iv和pvc-v的效应因子(分别为pau_02009、pau_02010、pau_02098、pau_02096、pau_02805、pau_03337和pau_03332)的蛋白质序列中显示出典型的额外的n末端片段(图3)。认为这些n末端片段的存在可能决定了效应分子是否能够装载进入pvc复合物。[0149]实施例2：效应因子装载过程发生切割事件[0150]为了探究效应因子装载的详细机制，在细菌菌株中对c末端用flag标记的pnf和pdp1蛋白进行免疫沉淀，该菌株产生装载了效应因子的pvc颗粒。[0151]表达pvc-v颗粒和其效应因子(pdp1和pnf)的pcnm12质粒的构建[0152]为了产生能够表达pvc颗粒和其效应因子pnf或pdp1的pcnm12质粒，如先前所记载的(w.jiang等人,cas9-assistedtargetingofchromosomesegmentscatchenablesone-461steptargetedcloningoflargegeneclusters.natcommun6,8101(2015))，使用cas9辅助的靶向染色体区段(cas9-assistedtargetingofchromosomesegments，简称为catch)从基因组中切割获得基因组dna片段(pau_03353至pau_03332)，并将该片段连接到prk404中用于在大肠杆菌top10中表达。通过pcr和酶切消化鉴定阳性克隆。[0153]免疫沉淀测定[0154]对于免疫沉淀测定，将来自指数期培养物的产生pvc和其伴侣分子效应因子pdp1或pnf的细菌的沉淀物在缓冲液p(25mmtris,ph7.4,140mmnacl,3mmkcl,50μg/mldnasei,200μg/ml溶菌酶,0.5％tritonx-100,5mmmgcl2,1×蛋白酶抑制剂(medchemexpress))中裂解，然后在离心(14,000rpm，10分钟)后收集上清液。将抗-flagm2磁珠(sigma)加入上清液中，在室温下旋转孵育1小时。用冰冷的pbs洗涤磁珠3次，使用flag肽溶液通过竞争性洗脱方式洗脱结合的蛋白。将样品加载到蛋白质凝胶上用于进行sds-page。[0155]结果显示，从免疫沉淀物中能够发现一条清晰的较小的条带，表明在效应分子装载过程中可能发生了切割事件(图4a)。[0156]质谱分析[0157]为了证实这个猜想，将上述较小的蛋白质条带切割下来并应用于质谱分析。从上述蛋白质凝胶上切除的蛋白质条带经常规处理凝胶后，用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶溶液消化。从凝胶上提取消化的肽，并进行冷冻干燥。将重悬于0.1％甲酸中的肽用于lc-ms/ms分析(biotechpackscientific,beijing)。将原始ms文件与p.asymbioticaatcc43949蛋白质数据库(uniprot)进行检索比对。从两种酶消化的结果中确定感兴趣的蛋白质的n末端。[0158]结果显示pdp1的n末端50个氨基酸和pnf的n末端70个氨基酸被删除了(图4b)，暗示了这些效应因子n末端序列可能参与效应分子装载过程。[0159]实施例3：验证n末端是否作为指导pvc装载的信号肽[0160]pbbrn-pdp1δn50、pbbrn-pnfδn50、pbbrn-pnfδn70的构建[0161]将缺失pdp1的n末端50个氨基酸的效应因子片段pau_03337(pdp1)(其c末端连接有flag标签)克隆到pbbrn质粒中，在大肠杆菌中表达。将缺失pnf的n末端70个氨基酸的效应因子片段pau_03332(pnf)(其c末端连接有flag标签)或缺失pnf的n末端50个氨基酸的效应因子片段pau_03332(pnf)(其c末端连接有flag标签)克隆到pbbrn质粒中，在大肠杆菌中表达。[0162]pvc效应因子的体内降解[0163]使用体内降解测定观察具有或不具有其各自的信号肽的pvc效应因子pdp1和pnf的稳定性。将携带相应质粒的细菌细胞的过夜培养物以1:50接种，并在37℃培养约2小时。然后添加氯霉素以阻断蛋白质翻译。在不同时间点采集样品，并且通过蛋白质免疫印迹检测pvc效应因子。[0164]如图5a所示，对于pdp1，n末端缺失的pdp1(pdp1δn50)的蛋白质稳定性只受到轻微的影响，但是截短的pdp1效应分子完全不能被装载到pvc复合物中(图5b)。[0165]对于pnf，n70的缺失(缺失n末端70个氨基酸)完全破坏了可检测蛋白的合成(图5c)。pnfδn50呈现出与pdp1δn50相似的特征，即蛋白质稳定性受到轻微影响(图5a)，并且pnfδn50也不能被装载进入pvc复合物中(图5b)。[0166]基于上述结果，预期pnf和pdp1的n末端50个氨基酸的功能可能是作为货物分子装载进入pvc颗粒的信号肽。[0167]实施例4:pvc复合物能够装载并转运融合n50-sp的报告蛋白[0168]由于pvc复合物与t4噬菌体尾部具有很高的相似性，并且能够在体外大量生产，因此探究pvc是否可以作为分子注射器在n末端信号肽的指导下用于多肽和蛋白质注射。[0169]选取生物学研究中广泛使用的灵敏的报告蛋白blam(β-内酰胺酶)、mrfp、nanoluc(纳米荧光素酶)和rluc(水母荧光素酶)。分别在这些报告蛋白的n末端融合pnfn末端50个氨基酸(pnfn50)或pdp1n末端50个氨基酸(pdp1n50)，并在其n末端添加flag标签，构建报告蛋白的融合蛋白。[0170]构建了pbbrn-blam、pbbrnpnfn50-blam、pbbrnpdp1n50-blam、pbbrn-mrfp、pbbrnpnfn50-mrfp、pbbrnpdp1n50-mrfp、pbbrn‑ꢀnanoluc、pbbrnpnfn50-nanoluc、pbbrnpdp1n50-nanoluc、pbbrn‑ꢀrluc、pbbrnpnfn50-rluc、pbbrnpdp1n50-rluc质粒，其中在报告蛋白的c末端连接有flag标签，并且转入大肠杆菌epi300菌株中，该大肠杆菌本身产生lysr的质粒并且携带表达pvc结构基因的质粒pcnm3。然后如上所述进行pvc的产生和纯化和蛋白质免疫印迹。[0171]结果表明，所有的融合蛋白均能够在pnf或pdp1n50-sp的指导下成功装载进入pvc复合物(图6)。[0172]实施例5：转载到pvc复合物中的外源蛋白能够被注射到细胞中[0173]发明人的先前研究已证明，pvc复合物能够将pnf和pdp1效应因子注射进入j774鼠巨噬细胞中(x.wang等人，characterizationofphotorhabdusvirulencecassetteasacausativeagentintheemergingpathogenphotorhabdusasymbiotica,scichinalifesci,(2021))。为了测试装载到pvc复合物中的外源蛋白是否能够被注射到细胞中，使用装载上述各种报告蛋白的pvc的溶液处理j774细胞并进行以下测量。[0174]j774细胞的pvc处理和蛋白质转移测定[0175]在96孔板中使100μl的j774细胞生长至70％汇合。如上所述，产生并纯化分别装载各个报告蛋白的pvc。使用nanodrop分光光度计(thermofisher)测定纯化的pvc溶液的浓度。[0176]一般地，对于不同货物分子通过pvc转移进入j774细胞，在每个孔中加入系列浓度的pvc溶液(起始浓度为5mg/ml，稀释倍数分别为1:20、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000和1:2000)，其中pvc复合物与不具有信号肽或具有pdp1n50信号肽或具有pnfn50信号肽的blam报告蛋白或rluc报告蛋白在大肠杆菌细胞epi300中共表达。取大肠杆菌培养物上清液在37℃与j774细胞孵育24小时，随后进行检测或成像。每个实验至少进行3次，并且显示代表性的图片。使用cellcountingkit-8(medchemexpress)确定细胞存活力。使用细胞裂解试剂盒裂解细胞用于蛋白印迹测定和免疫沉淀测定(beyotimebiotechnology)，并且使用本文所述的一抗进行蛋白印迹测定。[0177]对于blam报告蛋白的转移，用pbs洗涤pvc处理的细胞，并且添加ccf2‑ꢀam(invitrogen)在室温下孵育60分钟。使用微板读取器在410nm的激发光下监测荧光。将转移确定为切割的(450nm)(代表转移进入的细胞)信号(蓝色)与未切割的(520nm)(代表未转移进入细胞)信号(绿色)之间的比率。还使用荧光显微镜观察样品。对于rluc蛋白的转移，进行相似的操作，并且通过使用水母ꢀ‑glo荧光素酶测定系统(promaga)检测荧光素酶。[0178]结果显示与信号肽融合的rluc(图7a)和blam(图7b)能够以剂量依赖的方式转运进入真核细胞，而没有n末端信号序列的rluc和blam不能进入真核细胞。[0179]实施例6：对信号肽的序列进行表征[0180]对pnfn50-sp进行丙氨酸扫描，依次将相邻的两个氨基酸突变为丙氨酸。具体地，下表显示了构建的质粒及其产生的突变蛋白。[0181]表2.用于丙氨酸扫描的质粒构建[0182]pbbrnpnfn50-rluc具有c末端flag的pnfn50-rluc融合蛋白pbbrnpnfn50-rlucl2ak3a具有c末端flag的pnfn50-rlucl2ak3a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rlucy4a具有c末端flag的pnfn50-rlucy4a突变蛋白pbbrnpnfn50-rlucn6ap7a具有c末端flag的pnfn50-rlucn6ap7a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rlucq8at9a具有c末端flag的pnfn50-rlucq8at9a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rlucv10a具有c末端flag的pnfn50-rlucv10a突变蛋白pbbrnpnfn50-rluct12aq13a具有c末端flag的pnfn50-rluct12aq13a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rlucr14at15a具有c末端flag的pnfn50-rlucr14at15a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rluck16an17a具有c末端flag的pnfn50-rluck16an17a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rluct18a具有c末端flag的pnfn50-rluct18a突变蛋白pbbrnpnfn50-rluck20ak21a具有c末端flag的pnfn50-rluck20ak21a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rlucp22ap23a具有c末端flag的pnfn50-rlucp22ap23a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rlucs24as25a具有c末端flag的pnfn50-rlucs24as25a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rluct26as27a具有c末端flag的pnfn50-rluct26as27a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rlucf28ad29a具有c末端flag的pnfn50-rlucf28ad29a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rlucg30ah31a具有c末端flag的pnfn50-rlucg30ah31a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rlucl32ae33a具有c末端flag的pnfn50-rlucl32ae33a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rlucl34as35a具有c末端flag的pnfn50-rlucl34as35a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rlucn36ag37a具有c末端flag的pnfn50-rlucn36ag37a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rluce38an39a具有c末端flag的pnfn50-rluce38an39a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rlucq40ap41a具有c末端flag的pnfn50-rlucq40ap41a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rlucy42ae43a具有c末端flag的pnfn50-rlucy42ae43a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rlucg44ah45a具有c末端flag的pnfn50-rlucg44ah45a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rluck46ai47a具有c末端flag的pnfn50-rluck46ai47a双突变蛋白pbbrnpnfn50-rlucr48ak49a具有c末端flag的pnfn50-rlucr48ak49a双突变蛋白[0183]如实施例4中所述的方法测试融合至具有不同丙氨酸突变的pnfn50信号肽的rluc蛋白质是否能被装载到pvc复合物中。结果表明，信号肽序列中具有非常稀少的保守残基，在pnfn50-sp内部的任何点突变都没有影响装载效率(图8)。因此，该结果表明，n末端sp能够指导货物分子装载进入pvc注射器中，并且装载的识别不会因为信号肽序列内任一个氨基酸残基或两个连续的氨基酸残基的突变而失效。[0184]实施例7:n50-sp指导的细菌效应因子的pvc装载和递送[0185]为了将pvc工程化改造为用于多种目的的有效递送系统，还探究了来自多个细菌分泌系统(t3ss、t4ss、t6ss和t7ss)的多种效应因子(参见表3)是否能够在本发明的sp指导下被装载到pvc-v复合物中。这些效应因子已被广泛地验证并且应用于不同的医药治疗。[0186]表3.测试的多肽和蛋白质信息[0187][0188][0189]如实施例1所述相似的方法构建pbbrn质粒，在大肠杆菌top10中表达。该质粒中包含不具有信号肽、具有pnfn50信号肽、或具有pdp1n50信号肽的细菌效应因子。[0190]测试的细菌效应因子分别为t3ss效应因子ecespn、eccif、paexou、ecnlec、sfospb、ypyopt；t4ss效应因子lpankb、babspb、hpcaga；t6ss效应因子etevpp、btteca、pptge2、ypyezp、patse1、patse3、paplda、papldb；t7ss效应因子mtespb、mmespb、mtesxa、mmesxa。将产生lys-r的第一质粒转化到大肠杆菌epi300菌株中，该大肠杆菌本身携带表达pvc-v结构基因的第二质粒pcnm3。再将表达货物分子(具有c末端flag标签)的第三pbbrn质粒转化到该epi300菌株中。如上所述进行pvc的产生和纯化，并进行蛋白质免疫印迹测定。图9a显示了t3ss效应因子的蛋白质免疫印迹测定结果；图9b显示了t4ss效应因子的结果；图9c显示了t6ss效应因子的结果；和图9d显示了t7ss效应因子的结果。上述结果表明，在n末端pnf或pdp1n50-sp的指导下，这些效应分子均能够装载进入pvc复合物。[0191]通过使用细胞计数试剂盒-8(medchemexpress)确定细胞存活力。用携带来自铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)的exou的pvc处理细胞，观察到显著的细胞死亡(图10a和图10b)。其中，图10a显示了示例性的细胞照片，并且图10b显示了统计结果。[0192]用装载有大肠杆菌nlec或幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori)caga蛋白的pvc溶液处理j774巨噬细胞后，用细胞裂解液破坏细胞后离心分离上清液，随后使用westernblot方法利用对细胞上清液中的nf-κb信号通路p65蛋白降解情况(p65蛋白n端或c端肽段一抗检测)或akt蛋白激活情况(总akt或磷酸化akt一抗检测)进行分析。结果显示细胞中的p65蛋白被pvc递送的nlec切割降解(图11a)，akt蛋白也被pvc递送的caga激活(图11b)。[0193]为了发掘pvc复合物中的装载货物分子的多样性，还测试了一些来自哺乳动物、植物、寄生虫和真菌的真核蛋白。这些真核蛋白具有广泛的分子量和等电点范围。参见以上表3。在n末端sp的指导下，所有测试的真核蛋白均能够由pvc装配并递送(图12a和图12b)。[0194]这些结果均证实了由sp指导的效应因子装载和pvc递送多种效应因子进入宿主细胞的有效性。因此，n末端sp是促进pvc蛋白质递送系统的构建以实现不同任务的有力的工具。[0195]实施例8：装载有tcst的pvc在小鼠模型中的抗肿瘤应用[0196]来自栝楼(trichosantheskirilowii)的天花粉蛋白(trichosanthin，tcst)是一种i型核糖体失活蛋白，在前期的研究中已被证实可用于抗癌治疗。融合pnfn50-sp的tcst能够成功装载进入pvc颗粒(图12b)。[0197]用装载和未装载tcst的pvc溶液分别处理巨噬细胞后，用细胞计数试剂盒-8测定细胞的存活力，结果显示用pnfn50-sp引导装载tcst的pvc对细胞造成了显著性的杀灭作用(图13)。[0198]随后，在携带j774a.1肿瘤的balb/c小鼠中评估装载tcst的pvc的抗癌效果。该实验方案如图14中所示。该使用小鼠的研究由biocytogen依照aaalac指南进行。该研究由biocytogen的机构动物护理和使用委员会(biocytogen’sinstitutionalanimalcareandusecommittee)批准并且按照照料和使用实验动物的指导(国家研究委员会，2011)。实验在6-8周龄的雌性balb/c小鼠中进行。小鼠被分为3组(每组5只小鼠)。在第-5天右侧皮下植入j774a.1细胞(1×107个细胞/小鼠)。待第0天肿瘤生长至约80mm3体积后用装载或未装载tcst的pvc溶液对肿瘤进行瘤内注射治疗，pbs溶液作为阴性对照。注射方法为每周3次共18天，注射量为30mg/kg小鼠。每周两次测量肿瘤体积和小鼠重量。实验结束后小鼠被安乐死并对肿瘤进行检测。结果表明，在小鼠中pvc+tcst注射两周后产生了显著的抗癌活性，并且肿瘤生长不能被施用单独的pvc溶液抑制。图15a显示了肿瘤体积随时间的数据，且图15b显示了在小鼠安乐死后取出的肿瘤的重量数据。这表明pvc能够向肿瘤组织中递送蛋白质类药物用于有效的癌症治疗。并且，3组小鼠的体重随时间变化没有差异(图16)，表明装载tcst的pvc在小鼠体内没有造成显著的毒性。[0199]生物信息学和统计学分析[0200]所有序列均从ncbi/uniprot获得。使用clustalomega进行多序列比对。进行两样品t-检验比较以证实所比较的样品之间至少95％可信度的统计学显著性。***，p《0.001，**，p《0.01，*，p《0.05。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种信号肽，其指导多肽装载到发光杆菌毒力盒(pvc)中，其中所述信号肽衍生自非共生发光杆菌(photorhabdus asymbiotica)的pvc基因簇下游的效应因子。2.根据权利要求1所述的信号肽，其中所述非共生发光杆菌为非共生发光杆菌(photorhabdus asymbiotica)atcc43949。3.根据权利要求1或2所述的信号肽，其中所述信号肽衍生自所述pvc基因簇下游的效应因子的n末端40-70个氨基酸，例如n末端50-70个氨基酸、例如n末端45-55个氨基酸、或n末端48-52个氨基酸，优选n末端50个氨基酸的序列。4.一种信号肽，其中所述信号肽包含与选自seq id no:3、7、11、15、19、23或27的氨基酸序列具有至少80％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列，或者所述信号肽包含与选自seq id no:3、7、11、15、19、23或27的氨基酸序列相比具有1-5个氨基酸取代的氨基酸序列。5.一种核酸，其编码根据权利要求1-4中任一项所述的信号肽。6.一种融合蛋白，其包含多肽和根据权利要求1-4中任一项所述的信号肽，其中所述信号肽与所述多肽的n末端融合。7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述信号肽与所述多肽直接连接或通过接头连接。8.根据权利要求6或7所述的融合蛋白，其中所述多肽的分子量为10kda至200kda。9.根据权利要求6-8中任一项所述的融合蛋白，其中所述多肽的等电点为4-10。10.根据权利要求6-9中任一项所述的融合蛋白，其中所述多肽选自信号通路调节蛋白、结构蛋白、转运蛋白、激素或激素调节分子、细胞毒素、抗原或免疫原、标签蛋白或报告蛋白、抗菌肽、参与细胞代谢的酶和基因编辑蛋白。11.一种核酸，其包含编码根据权利要求6-10中任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列。12.一种载体，其包含根据权利要求11所述的核酸。13.根据权利要求12所述的载体，其中所述载体还包含编码非共生发光杆菌的发光杆菌毒力盒v(pvc-v)结构蛋白的核苷酸序列，优选地，所述pvc-v结构蛋白包括pvc1、pvc2、pvc3、pvc4、pvc5、pvc6、pvc7、pvc8、pvc9、pvc10、pvc11、pvc12、pvc13、pvc14、pvc15和pvc16。14.一种宿主细胞，其包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码根据权利要求6-10中任一项所述的融合蛋白，所述第二核苷酸序列编码非共生发光杆菌的pvc-v结构蛋白的核苷酸序列，优选地，所述pvc-v结构蛋白包括pvc1、pvc2、pvc3、pvc4、pvc5、pvc6、pvc7、pvc8、pvc9、pvc10、pvc11、pvc12、pvc13、pvc14、pvc15和pvc16，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列在相同或不同的载体上。15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还表达lysr调控子。16.根据权利要求14或15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞，优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。17.一种多肽注射系统，其包含非共生发光杆菌的pvc-v复合物和装载在所述pvc-v复合物中的多肽。18.根据权利要求17所述的多肽注射系统，其中所述多肽通过在其n端与根据权利要求1-4中任一项所述的信号肽融合从而装载至所述pvc-v复合物中。
19.一种制备权利要求17或18所述的多肽注射系统的方法，包括培养根据权利要求14-16中任一项所述的宿主细胞，任选地，所述方法还包括从培养的宿主细胞或其上清液分离所述多肽注射系统。20.一种将多肽转入靶细胞中的方法，其包括：将根据权利要求17或18所述的多肽注射系统与靶细胞接触，使得所述多肽注射系统将装载的多肽注射到所述靶细胞中。21.一种组合物，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的信号肽、根据权利要求5或11所述的核酸、根据权利要求6-10中任一项所述的融合蛋白，根据权利要求12或13所述的载体，根据权利要求14-16中任一项所述的宿主细胞，或根据权利要求17或18所述的多肽注射系统。

技术总结
本公开提供了用于将多肽注射到细胞中的信号肽、融合蛋白、多肽系统，及其在将多肽注射到细胞中的用途。到细胞中的用途。


技术研发人员：江峰 金奇 王霞
受保护的技术使用者：中国医学科学院病原生物学研究所
技术研发日：2022.01.29
技术公布日：2023/8/8