预防肾损伤破坏肠淋巴管的方法

预防肾损伤破坏肠淋巴管的方法
1.政府支持
2.本发明是在由美国国家卫生研究院(national institutes of health)授予的授权号为nih 1p01hl116263的政府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权利。
3.发明背景
4.众所周知，肾病会影响肠道的结构和功能。尽管肠淋巴管在饮食和合成脂/脂蛋白的吸收和重塑中起着重要作用，但对于肾损伤是否以及如何影响肠淋巴管网络(lymphatic network)或其中运输的脂蛋白仍知之甚少。为了研究肾损伤对肠淋巴管和肠系膜淋巴的影响，本发明人使用了两种蛋白尿模型(嘌呤霉素氨基糖苷处理的大鼠和nep25转基因小鼠)。
5.本发明人发现，肾损伤扩大了肠淋巴管网络，激活了淋巴管内皮细胞，并增加了肠系膜淋巴流动。肾损伤动物的淋巴的细胞因子、免疫细胞水平升高，载脂蛋白ai(apoai)产量更高。此外，源自肠道的尿毒症毒素、硫酸吲哚酚刺激回肠类器官产生反应性二羰基化合物(dicarbonyl)，例如isolevuglandin(isolg)。回肠中以及肠系膜淋巴中的isolg增加。isolg修饰的apoai直接增加淋巴管收缩，激活淋巴管内皮细胞，并通过巨噬细胞经由vegf-c的分泌诱导淋巴管生成。因此，本发明的实施方案包括肾脏和肠道之间的串话机制(crosstalk)中的新介质(isolg修饰的apoai)和新途径(肠淋巴管网络)，该串话机制构成肾病的不良全身后果的基础。
6.肾病被公认为引起脂质和脂蛋白的水平、组成和功能失调。肠淋巴管在脂质吸收和脂蛋白的转运/重构中是关键的。本发明人发现，肾损伤刺激肠淋巴管生成，激活淋巴管内皮细胞，增加肠系膜淋巴流动，以及改变淋巴的组成，包括脂蛋白(hdl/apoai)和炎症因子。关键是，肾损伤刺激肠道产生修饰hdl/apoai的活性二羰基化合物，导致淋巴管收缩增加以及淋巴管内皮细胞激活。这些结果提供了在构成肾病不良后果的基础的肾-肠串话机制中的新介质和途径。


技术实现要素：

7.本发明满足了长期以来的需求，因为慢性肾病(ckd)在2017年影响全球人口的约9.1％，或7亿人。由于许多因素，特别是人口老龄化和糖尿病的日益盛行，肾病的患病率及其相关的发病率和死亡率正在增加。肾病会破坏许多器官和组织的结构和功能，导致并发症，例如感染、心血管疾病(cvd)、外周动脉疾病、骨病、贫血和急性肾损伤，并伴有住院和死亡率的增加。
8.本发明还详述了肾-肠串话机制在ckd相关并发症中的重要性。以前很少考虑肾损伤或肾病中的肠淋巴管变化。尽管肠淋巴管通过提供免疫/炎症细胞和介质的传播和激活位点而在免疫中起着核心作用。肠淋巴管还转运脂蛋白形式的膳食和内源性脂质，包括影响cvd的进展的乳糜微粒、极低密度脂蛋白(vldl)和高密度脂蛋白(hdl)。此外，最近的许多研究表明，特定器官的淋巴管功能障碍加剧一系列疾病，包括癌症、cvd、自身免疫性疾病和神经退行性疾病。肾淋巴管的功能和生长甚至表现出影响急性肾损伤和ckd的进展以及肾移植后的预后。
9.本发明利用嘌呤霉素氨基糖苷(pan)处理的大鼠表明，蛋白尿性肾损伤后，肠淋巴流动速度显著提高(》5倍)，肠淋巴白蛋白运输减少，肠淋巴脂质和脂蛋白(特别是hdl和载脂蛋白ai[apoai])增加，同时血浆中也发生类似变化。此外，数据表明，pan大鼠的肠淋巴中的辅助性t细胞17细胞和细胞因子(包括白细胞介素-6、白细胞介素-10和白细胞介素-17)增加，而血浆中则不然。在pan大鼠和nphs1-hcd25(nep25)转基因小鼠(作为另一种蛋白尿性肾损伤模型)中，它们都显示回肠中淋巴管内皮细胞(lec)标志物(包括平足蛋白(podoplanin)、血管内皮生长因子受体3[vegfr3]和淋巴管内皮受体1[lyve-1])的mrna表达增加，同时pan大鼠回肠中的平足蛋白阳性淋巴管增加。pan大鼠的肾损伤还改变了参与血管舒张的关键基因的回肠lec表达(例如，内皮特异性一氧化氮(nos3)增加)和免疫细胞化学诱导(例如，ccl21增加，sphk2表达更高且spns2表达降低，其是产生鞘氨醇-1-磷酸[s1p]的关键调节剂，其在肠系膜淋巴中增加)。
[0010]
本发明人还研究了蛋白尿性肾损伤如何改变肠淋巴脂蛋白，以及这些变化是否会调节肠lec和淋巴管。肾损伤增加氧化应激和脂质过氧化，导致产生一系列脂质醛，例如isolevuglandin(isolg)。isolg是一种高活性的二羰基化合物，其损害apoai的功能。pan大鼠和nep25转基因小鼠都在回肠中具有升高的总isolg赖氨酸，且pan大鼠肠系膜淋巴中isolg-赖氨酸升高，但血浆中则不然。isolg可由过氧化物酶髓过氧化物酶(mpo)产生，该酶在蛋白尿大鼠肠壁中升高。蛋白尿大鼠肠中mpo活性升高的原因尚未完全确定，这可能是未来研究的主题。isolg与apoai共定位于pan大鼠的回肠和肠淋巴中。离体研究表明，isolg修饰的apoai，而非天然apoai，直接增加淋巴管收缩，激活lec，并增加促淋巴管生成因子血管内皮生长因子c(vegf-c)从分离的巨噬细胞中分泌。用本发明的二羰基化合物清除剂对nep25小鼠进行处理，降低了回肠中的isolg，并降低了肠道中的淋巴管标志物平足蛋白，证明isolg促进在具有蛋白尿性肾损伤的啮齿动物中观察到的肠淋巴管变化。
[0011]
本发明的一个方面是，在蛋白尿性肾损伤而无肾衰竭的啮齿动物模型中，肠淋巴管的组成、结构和功能被广泛地改变。这些变化在调节肾、肠和其他器官之间的串话机制中起重要作用，该串话机制导致肾病的全身性并发症。
[0012]
全身的淋巴管结构和功能的改变已被证明是肾损伤和肾病进展及并发症的重要因素。本发明人发现，isolg修饰的apoai的增加调节具有肾损伤的啮齿动物的肠淋巴管结构和收缩，并且isolg形成的抑制剂能够减少淋巴管生成。因此，本发明的一个方面是影响肾损伤和肾病进展和并发症的这种抑制剂。本发明还证明，肠淋巴管脂质和脂蛋白运输随着肾损伤而显著改变。全身性血脂异常是cvd的重要风险因子；并且肠淋巴脂蛋白运输的正常化被证明是减少具有肾损伤和肾病的患者的心血管并发症的一种治疗方法。
[0013]
实验和临床研究的一个主要焦点是了解器官间串话机制，特别是受损的肾脏与肠道之间串话机制的病理生理学。肾病是产生诸如酚类(对甲酚硫酸酯)、吲哚类(硫酸吲哚酚)和三甲胺n-氧化物等毒素的肠道微生物的组组成和代谢的强大调节剂。肾损伤也破坏肠道屏障，促进细菌成分和内毒素进入循环系统，然后启动免疫激活和促炎信号传导。肾-肠串话机制中介质的主要途径被认为涉及血管和神经。很少关注淋巴管。肠淋巴管的独特之处在于，除了清除间质液、大分子、免疫/炎性细胞外，它们还负责膳食脂质的吸收和脂蛋白的转运/重塑。淋巴管也是将高密度脂蛋白(hdl)从外周间质转运到循环系统的主要通道。淋巴运输和淋巴管完整性的破坏最近被认为是疾病(包括心血管疾病(cvd)、炎症性肠
病和慢性肾病(ckd))的强大增强因子。虽然炎症和血脂异常影响肠淋巴管的数量和功能，但以炎症和脂质代谢异常为特征的肾损伤是否影响肠淋巴管尚未可知。
[0014]
在许多疾病中观察到的血浆脂质/脂蛋白水平和组成的异常已被归因于产生发生变化和被肝脏修饰。相反，尽管肠道也是apoai/hdl的关键来源，但关于肠道对疾病中普遍存在的脂蛋白异常的贡献的信息很少。有趣的是，最近证明肠道微生物变异调节血浆总胆固醇和ldl的水平，并且在vldl和hdl的代谢中尤其重要，包括hdl的逆向胆固醇转运功能。这可能在病理生理上密切相关，因为apoai/hdl结构和组成的改变决定了该颗粒的有益/有害作用。
[0015]
脂蛋白修饰中的关键机制涉及通过反应性羰基化合物的加合反应，所述羰基化合物包括丙二醛、4-羟基壬烯醛、4-氧代-壬烯醛(4-oxo-neonenal)，以及所有羰基化合物中最具反应性的isolevuglandin(isolg)。虽然单独的羰基化合物可以影响特定的apoai/hdl功能，但isolg损害apoai的基本作用：胆固醇外排、抗炎和抗氧化。isolg在改变apoai功能方面也比其他羰基化合物低10-30倍。肾病改变hdl的组成和功能，并增加血浆蛋白加合物。本发明人已经证明，通过用isolg修饰apoai，hdl颗粒变得功能失调，这损害apoai/hdl促进胆固醇从巨噬细胞外排的能力，不仅降低hdl抑制细胞因子诱导的能力，而且增强lps诱导的il-1β表达。本领域普通技术人员可以预期，肠道不仅是apoai/hdl的来源，而且还是apoai/hdl修饰的位点，其可涉及病理生理学，包括调节淋巴管生成。
[0016]
本发明人表明，肾病中普遍存在的血脂异常和炎症影响肠淋巴管的结构和功能，并且本发明的实施方案是治疗、预防和/或改善这种影响。
[0017]
因此，本发明公开了用于治疗、预防和/或改善肾病对肠淋巴管结构和功能的影响的方法，该方法包括鉴别患有肾病的个体，以及向所述个体施用isolg清除有效量的至少一种下式的化合物：
[0018][0019]
其中r为n或c-r2；r2独立地选自h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、c
1-c
10
烷氧基、羟甲基、羟基；r3为h、卤素、c
1-c
10
烷基、烷氧基、羟基、硝基；r4为h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、羧基；及其药学上可接受的盐。
[0020]
本发明还公开了调节肠淋巴管功能以改善肾损伤或肾病的方法，该方法包括施用isolg清除有效量的至少一种下式的化合物：
[0021][0022]
其中r为n或c-r2；r2独立地选自h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、c
1-c
10
烷氧基、羟甲基、羟基；r3为h、卤素、c
1-c
10
烷基、烷氧基、羟基、硝基；r4为h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、羧基；及其药学上可接受的盐。
[0023]
本发明还公开了改善肾损伤或肾病的全身性并发症的方法，该方法包括施用isolg清除有效量的至少一种下式的化合物：
[0024][0025]
其中r为n或c-r2；r2独立地选自h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、c
1-c
10
烷氧基、羟甲基、羟基；r3为h、卤素、c
1-c
10
烷基、烷氧基、羟基、硝基；r4为h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、羧基；及其药学上可接受的盐。
[0026]
本发明还公开了改善肠淋巴管功能障碍的方法，该方法包括施用isolg清除有效量的至少一种下式的化合物：
[0027][0028]
其中r为n或c-r2；r2独立地选自h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、c
1-c
10
烷氧基、羟甲基、羟基；r3为h、卤素、c
1-c
10
烷基、烷氧基、羟基、硝基；r4为h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、羧基；及其药学上可接受的盐。
[0029]
在本发明的所述方法中，所述化合物还可具有下式：
[0030][0031]
其中r2独立地选自h、取代或未取代的烷基；r3为h、卤素、烷基、烷氧基、羟基、硝基；r4为h、取代或未取代的烷基、羧基；或其药学上可接受的盐。
[0032]
在一个实施方案中，r2独立地选自h、乙基、甲基。
[0033]
在另一个实施方案中，所述化合物是2-羟基苄胺、甲基-2-羟基苄胺、乙基-2-羟基苄胺。
[0034]
在另一个实施方案中，所述化合物为：
[0035][0036]
或其药学上可接受的盐。
[0037]
在另一个实施方案中，所述化合物为：
[0038][0039]
或其药学上可接受的盐。
[0040]
在另一个实施方案中，所述化合物或其药学上可接受的盐以包含所述化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的组合物的形式施用。
[0041]
在其他实施方案中，所述化合物或其药学上可接受的盐与具有治疗肾病和/或炎症导致的损害的已知副作用的另一种活性剂共同施用。
[0042]
本发明的其他优点和实施方案将在下面的描述中进行阐述，并且部分将从描述中变得显而易见，或者可以通过本发明的实践来学习。本发明的优点和实施方案将通过所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。应当理解，前面的一般描述和下面的更详细描述都是示例性的，并且仅是示例性的，而并不限制要求保护的本发明。
[0043]
附图简要说明
[0044]
图1示出蛋白尿性肾损伤增加肠系膜淋巴流动，并改变淋巴组成。(a)与对照组相比，pan-损伤动物的肠系膜淋巴管中的淋巴流动速度始终较高。(b)与对照组相比，pan的肠系膜淋巴中的白蛋白浓度和产量显著降低。(c)与对照组相比，pan的肠系膜淋巴中胆固醇和甘油三酯浓度较低；pan的肠系膜淋巴中胆固醇和甘油三酯的总产量显著更高。(d)肠系膜淋巴中脂蛋白颗粒的nmr分析表明，与对照组相比，pan中ldl颗粒相似，含有甘油三酯(trl)的颗粒较小，hdl颗粒较大。(e)fplc系统上的尺寸排阻色谱法(sec)发现，pan增加了与球形hdl和乳糜微粒一致的级分中的蛋白质、胆固醇和磷脂，并增加了与乳糜微粒相对应的级分中的甘油三酯。(f)pan中的淋巴apoai浓度与对照组相似；与对照组相比，pan中的肠系膜淋巴总apoai产量增加。(g)与对照组相比，pan中血浆apoai的浓度增加。(h)用apoai(红色)和平足蛋白(绿色)对回肠组织进行的双重染色显示，pan将apoai重新分布到乳糜管中。
[0045]
图2示出蛋白尿性肾损伤改变肠系膜淋巴中的免疫细胞和细胞因子。(a)与对照组相比，肠系膜淋巴的流式细胞术显示pan淋巴中有更多的th17细胞(cd3+/cd4+/ccr6+)。(b)与对照组相比，pan中肠系膜淋巴显示更多的il-6、il-10和il-17，而il-1没有差异。
[0046]
图3示出蛋白尿性肾损伤扩大了肠系膜淋巴管网络，并激活了淋巴管内皮细胞(lec)。(a)pan提高了淋巴管生成因子的回肠表达，包括平足蛋白(pdpn)、lyve-1(lyve1)和vegfr3(flt4)mrna。(b)pan损伤大鼠的染色显示，与对照相比，平足蛋白的表达提高。(c)nep25增加了平足蛋白(pdpn)和vegfr3(flt4)的回肠基因表达。(d)与对照小鼠相比，nep25回肠染色显示平足蛋白表达增加。(e)与对照组相比，pan增加了回肠平足蛋白阳性lec中的enos(nos3)mrna表达。(f)pan肾损伤显著增加了回肠平足蛋白阳性lec中趋化因子ccl21 mrna的表达。(g)与正常对照的回肠相比，从pan的回肠分离的平足蛋白阳性lec显示出更高的sphk2mrna和更低的sphk2 mrna。(h)来自pan大鼠的肠系膜淋巴具有比对照淋巴更多的s1p。
[0047]
图4示出蛋白尿性肾损伤刺激回肠产生isolg。(a)与对照组相比，pan增加了回肠组织中的isolg加合物。(b)与对照组相比，pan肠系膜淋巴含有更多的isolg加合物。(c)与载体相比，暴露于尿毒症毒素硫酸吲哚酚(is)的培养的类肠(enteroids)产生更多的isolg加合物。(d)pan回肠中apoai(绿色)和isolg(红色)的双重染色显示了与apoai共定位的乳糜管中的isolg加合物(箭头)。
[0048]
图5示出isolg修饰的apoai激活所培养的淋巴管内皮细胞(lec)，并改变分离的肠系膜淋巴管的血管动力学。与未修饰的apoai相比，体外培养的暴露于isolg-apoai的lec产生(a)更多的ros，并且(b)提高enos(nos3)基因表达。与未修饰的apoai相比，isolg-apoai(c)较基线增加收缩频率，(d)较基线不改变收缩末期内径，(e)较基线降低舒张末期内径，并且(f)较基线降低收缩幅度。
[0049]
图6示出蛋白尿性肾损伤刺激回肠巨噬细胞产生vegf-c。(a)与对照组相比，pan增加回肠vegf-c。(b)与对照组相比，pan淋巴中vegf-c浓度较低，但pan中vegf-c的总产量显著较高。(c)用vegf-c(红色)和cd68(绿色)对回肠进行的双重染色显示，与对照组相比，pan中与vegf-c共定位的cd68阳性细胞数量更多(箭头)。(d)与未修饰的apoai相比，暴露于isolg-apoai的所培养的巨噬细胞表达更多的vegfc mrna。
[0050]
图7示出了用本发明的化合物进行的治疗降低了回肠淋巴管生成和isolg加合物。(a)ppm显著降低了蛋白尿nep25小鼠的肠淋巴管生成。(b)ppm还降低了nep25小鼠回肠中的isolg加合物。
[0051]
图8示出了用本发明的化合物进行的治疗减少肠系膜淋巴中的isolg-赖氨酸。
具体实施方式
[0052]
本发明人已经发现了有效治疗肾损伤的影响的化合物。
[0053]
如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数个指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“官能团”、“烷基”或“残基”包括两个或更多个这样的官能团、烷基或残基的混合物等。
[0054]
本文可将范围表示为从“约”一个具体值和/或至“约”另一个具体值。当表达这样的范围时，另一方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解该特定值形成另一方面。还应理解的是，每个范围的端值不论是与另一个端值相关，还是与另一个端值不相关，都是有意义的。还应该理解，本文公开了许多数值，并且每个数值在本文中也被公开为“约”该特定数值以及该数值本身。例如，
如果公开了数值“10”，那么还公开了“约10”。还应理解为特定单元之间的每个单元也被公开。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
[0055]
如本文所用，术语“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和所述事件或情况不发生的情况。
[0056]
如本文所用，术语“个体”是指给药对象。本文公开的方法的个体可以是脊椎动物，例如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。因此，本文公开的方法的个体可以是人、非人灵长类动物、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、牛、猫、豚鼠或啮齿动物。该术语不指具体的年龄或性别。因此，不论是雄性的还是雌性的成年和新生个体及胎儿都被涵盖。患者是指患有疾病或病症的个体。术语“患者”包括人和兽类个体。
[0057]
如本文所用，术语“治疗”是指患者的医学管理，其旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症。该术语包括积极治疗，即特别地旨在改善疾病、病理状况或病症的治疗，还包括病因治疗，即旨在消除相关疾病、病理状况或病症的病因的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即旨在缓解症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，即旨在最小化或者部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症形成的治疗；和支持性治疗，即用于补充另一种旨在改善相关疾病、病理状况或病症的特定疗法的治疗。
[0058]
如本文所使用的，术语“预防(prevent)”或“防止(preventing)”是指排除、阻止、避免、防止、预防或阻碍某事发生，尤其是通过提前行动。应当理解，除非另有明确说明，在本文使用减少、抑制或预防的情况下，也明确公开了其他两个词的使用。如本文中所见，治疗和预防的定义存在重叠。
[0059]
如本文所用，术语“经诊断的”意指已经由本领域技术人员(例如，医师)进行身体检查，并且发现其具有可被诊断或通过本文所公开的化合物、组合物或方法治疗的病症。如本文所用，短语“鉴定为需要治疗病症”等是指基于对治疗病症的需要选择个体。例如，基于本领域技术人员的早期诊断可以将个体鉴定为需要治疗病症(例如，与炎症有关的病症)，然后接受该病症的治疗。在一个方面，预期鉴别可以由与进行诊断的人不同的人来执行。在另一方面，还预期可由随后进行给药的人来给药。
[0060]
如本文所用，术语“施用(administering)”和“给药(administration)”是指向个体提供药物制剂的任何方法。这些方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于口服给药、透皮给药、吸入给药、鼻腔给药、局部给药、阴道内给药、眼科给药、耳内给药、脑内给药、直肠给药和肠胃外给药，包括注射，例如静脉内给药、动脉内给药、肌内给药和皮下给药。给药可以是连续的或间歇的。在各个方面，可以治疗性地给药制剂；即给药以治疗现有的疾病或病症。在其他各个方面，可以预防性地给药制剂；即给药以预防疾病或病症。
[0061]
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现所需结果或对不希望的病症具有效力的量。例如，“治疗有效量”是指足以实现所需治疗结果或对不希望的症状具有效力，但通常不足以引起不良副作用的量。任何特定患者的特定治疗有效剂量水平会取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；使用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间；给药途径；所使用的特定化合物的排泄速度；治疗的持续时间；与所用特定化合物联合或同时使用的药物以及医学领域熟知的相似因素。例如，在本领域的技术范围内是：以低于达到期望的治疗效果所需的剂量的水平开始化合物的剂量，逐步增加剂量，直至达到期望的治疗效果。无需要，可将有效日剂量分为多个剂量用于给药。所以，单
剂量组合物可含有这样的量或者其约数以达到每日剂量。在任何禁忌症的情况下，个体医师可以调整剂量。剂量可以变化，并且可以每天以一或多次剂量给药施用，持续一天或几天。对于给定类别的药物产品，可以在文献中找到关于适当剂量的指导。在其他各个方面，制剂可以“预防有效量”给药；即，有效预防疾病或病症的量。
[0062]
如本文所用，术语“清除剂”或“清除”是指可以被给药以将杂质或不需要的反应产物除去或灭活的化学物质。例如，不受理论或机制限制，isolg不可逆地与蛋白质上的赖氨酸残基特异性加合。本发明的isolg清除剂在isolg与赖氨酸残基加合之前与它们反应。因此，本发明化合物“清除”isolg，从而防止它们与蛋白质加合。
[0063]
如本文所使用，术语“取代的”旨在包括有机化合物所有可允许的取代基。在一个概括的方面，可运许的取代基包括有机化合物的非环状的和环状的、支链的或无支链的、碳环的和杂环的、芳香性的和非芳香性的取代基。示例性的取代基包括例如下面所述的那些取代基。对于适当的有机化合物，可允许的取代基可为一个或多个并其可相同或不同。为了本发明目的，杂原子例如氮可以具有氢取代基和/或本文描述的、符合杂原子化合价的、有机化合物的任何可允许的取代基。不欲以任何方式通过有机化合物的可允许的取代基限制本发明。而且，术语“取代”或“被...取代”包括隐含的条件，即此类取代符合被取代的原子及取代基的允许的化合价，并且该取代形成稳定的化合物，例如不会通过诸如重排、环化、消去等自发进行转变的化合物。
[0064]
本文所用的术语“烷基”是1至24个碳原子的支链或非支链饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。烷基可以是环状或非环状的。烷基可以是支链或非支链的。烷基也可以是取代的或未取代的。例如，烷基可以被一个或多个基团取代，所述基团包括但不限于任选取代的烷基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、磺基氧基或硫醇，如本文所述。“低级烷基”基团是含有1至6个(例如，1至4个)碳原子的烷基。
[0065]
在整个说明书中，“烷基”通常用于表示未取代的烷基和取代的烷基二者；然而，取代的烷基在本文中也通过鉴定该烷基上的特定取代基而被具体提及。例如，术语“卤代烷基”具体是指被一个或多个卤化物(例如氟、氯、溴或碘)取代的烷基。术语“烷氧基烷基”具体是指被一个或多个如下所述的烷氧基取代的烷基。术语“烷基氨基”具体是指被一个或多个如下所述的氨基取代的烷基，等等。当在一种情况下使用“烷基”并且在另一种情况下使用例如“烷基醇”的特定术语时，并不表示意指术语“烷基”也不是指例如“烷基醇”之类的特定术语等。
[0066]
该实践也用于本文描述的其他组。也就是说，虽然例如“环烷基”的术语是指未取代的环烷基部分和取代的环烷基部分二者，但是取代的部分还可以在本文中被特别地标识；例如，特定的取代的环烷基可以称为例如“烷基环烷基”。类似地，取代的烷氧基可以特别地称为例如“卤代烷氧基”，特定的取代的烯基可以是例如“烯基醇”等。同样，使用例如“环烷基”的通用术语和例如“烷基环烷基”的特定术语的实践并不意味着暗示通用术语也不包括特定术语。
[0067]
本文所用的术语“环烷基”是包含至少三个碳原子的非芳族碳基环。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、降冰片基等。术语“杂环烷基”是如上定义的
一类环烷基，并且包括在术语“环烷基”的含义内，其中环的至少一个碳原子被杂原子替代，所述杂原子例如但不限于氮、氧、硫或磷。环烷基和杂环烷基可以为取代的或未取代的。环烷基和杂环烷基可以被一个或多个基团取代，包括但不限于本文所述的任选取代的烷基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、磺基氧基或硫醇。
[0068]
如本文所用的术语“聚亚烷基”是具有两个或更多个彼此连接的ch2基团的基团。聚亚烷基可由式-(ch2)
a-表示，其中“a”为2至500的整数。
[0069]
本文所用的术语“烷氧基(alkoxy)”和“烷氧基(alkoxyl)”是指通过醚键键合的烷基或环烷基；也就是说，“烷氧基”基团可以定义为-oa1，其中a1是如上定义的烷基或环烷基。“烷氧基”还包括如上所述的烷氧基聚合物；也就是说，烷氧基可以是聚醚，例如-oa
1-oa2或-oa
1-(oa2)
a-oa3，其中“a”是1-200的整数，并且a1、a2和a3是烷基和/或环烷基。
[0070]
本文所用的术语“胺”或“氨基”由式na1a2a3表示，其中a1、a2和a3可独立地为氢或如本文所述的任选取代的烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基。
[0071]
本文所用的术语“羟基”由式-oh表示。
[0072]
本文所用的术语“硝基”由式-no2表示。
[0073]
术语“药学上可接受的”描述了在生物学上或其他方面不是不合需要的材料，即，不会产生不可接受的水平的不良生物学效应或以有害的方式相互作用的材料。
[0074]
本发明化合物的实例包括但不限于选自下式的化合物：
[0075][0076]
其中：r为n或c-r2；r2独立地选自h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、c
1-c
10
烷氧基、羟基；r3为h、卤素、c
1-c
10
烷基、烷氧基、羟基、硝基；r4为h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、羧基；
[0077]
及其药学上可接受的盐。
[0078]
其他实例包括下式的化合物：
[0079][0080]
其中：
[0081]
r2独立地选自h、取代或未取代的烷基；
[0082]
r3为h、卤素、烷基、烷氧基、羟基、硝基；
[0083]
r4为h、取代或未取代的烷基、羧基；
[0084]
及其药学上可接受的盐。
[0085]
在其他实施方案中，r2独立地选自h、乙基、甲基。在其他实施方案中，所述化合物可选自：
[0086][0087]
或其药学上可接受的盐。
[0088]
所述化合物还可选自：
[0089]
或其药学上可接受的盐。所述化合物还可选自：
[0090]
或其药学上可接受的盐。
[0091]
所述化合物还可选自：
[0092][0093]
或其药学上可接受的盐。
[0094]
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒碱或酸制备的盐。当本发明化合物是酸性的时，其相应的盐可以方便地从药学上可接受的无毒性碱(包括无机碱和有机碱)制备。得自此类无机碱的盐包括铝盐、铵盐、钙盐、铜(二价和一价)盐、三价铁盐、二价铁盐、锂盐、镁盐、锰(三价和二价)盐、钾盐、钠盐、锌盐等。特别优选的是铵盐、钙盐、镁盐、钾盐和钠盐。得自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺以及环胺和取代的胺(例如天然存在和合成的取代的胺)的盐。可用来形成盐的其他药学上可接受的无毒有机碱包括离子交换树脂，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、n,n`-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、n-乙基吗啉、n-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡萄糖、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。
[0095]
如本文所用，术语“药学上可接受的无毒酸”包括无机酸、有机酸和由其制备的盐，例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、异亮氨酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、扑酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。优选的是柠檬酸、氢溴酸、盐酸、马来酸、磷酸、硫酸和酒石酸。
[0096]
因此，本发明的一个实施方案是治疗蛋白尿性肾损伤的方法，该方法包括向有此需要的患者施用有效量的至少一种本发明的isolg清除剂化合物、或其药学上可接受的盐。
优选地，所述化合物是2-hoba、甲基-2-hoba或乙基-2-hoba。
[0097]
本发明的另一个实施方案是治疗肾病造成的损害的方法。在本发明的一或多个方面，所述损伤是对肠淋巴管网络的损害。在其他方面，所述损害是淋巴管的收缩增加和淋巴管内皮细胞的激活。在其他方面，所述损害是淋巴运输和淋巴管完整性的破坏。
[0098]
本发明的另一个实施方案是治疗蛋白尿性肾损伤的方法，该方法包括鉴定需要治疗肾损伤的个体；以及向所述个体施用isolg清除有效量的至少一种本发明的化合物。
[0099]
在一个方面，蛋白尿性肾损伤是肾病导致的损害。在另一个方面，所述损害是对肠淋巴管网络的损害。在另一个方面，所述损害是淋巴管的收缩增加和淋巴管内皮细胞的激活。在又一个方面，所述损害是淋巴运输和淋巴管完整性的破坏。
[0100]
本发明的另一个实施方案是调节肠淋巴功能以改善肾损伤或肾病的方法，该方法包括施用isolg清除有效量的至少一种本发明的化合物。
[0101]
本发明的另一个实施方案是改善肾损伤或肾病的全身性并发症的方法，该方法包括施用isolg清除有效量的至少一种本发明的化合物。在一方面，所述isolg位于肠淋巴管网络中。在另一方面，所述全身性并发症是心血管的、血液循环的或肥胖相关的。
[0102]
本发明的另一个实施方案是改善肠淋巴管功能障碍的方法，该方法包括施用isolg清除有效量的至少一种本发明的化合物。在一个方面，该功能障碍是肠淋巴管生成。
[0103]
上述实施方案包括向有此需要的患者施用有效量的至少一种本发明的isolg清除剂化合物、或其药学上可接受的盐。优选地，该化合物是2-hoba、甲基-2-hoba或乙基-2-hoba。
[0104]
如上所述，本发明涉及包含所公开的化合物的药物组合物。即，可以提供这样的药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种所公开的化合物或所公开的方法的至少一种产物和药学上可接受的载体。
[0105]
在某些方面，所公开的药物组合物包含所公开的作为活性成分的化合物(包括其药学上可接受的盐)、药学上可接受的载体以及任选的其他治疗成分或辅剂。本发明的组合物包括那些适合于口服、直肠、局部和胃肠外(包括皮下、肌肉内和静脉内)给药的组合物，然而在任何给定情况下最合适的途径将取决于特定宿主以及需要给予活性成分的病症的性质和严重程度。所述药物组合物可以方便地以单位剂型提供，并通过药学领域中公知的任何方法制备。
[0106]
在实践中，可以根据常规制药技术，将本发明的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分与药用载体紧密混合。所述载体可依据给药(例如口服或肠胃外(包括静脉内))所需的制剂形式有很多种形式。因此，本发明的药物组合物可以以适合口服的分离单元的形式提供，例如各自包含预定量的活性成分的胶囊剂、扁囊剂或片剂。此外，所述组合物可以作为散剂、颗粒剂、溶液、在水性液体中的混悬剂、非水性液体、水包油乳液或油包水液体乳液提供。除了上述常见剂型外，本发明的化合物和/或其药学上可接受的盐还可以通过控释装置和/或递送装置给药。所述组合物可以通过任何药学方法来制备。通常，此类方法包括将活性成分与构成一种或多种必需成分的载体组合在一起的步骤。通常，通过将活性成分和液体载体或研磨成细粉的固体载体或它们两者均一而紧密地混合在一起，来制备所述组合物。然后，可以方便地将产物的形状制成需要的形式。
[0107]
因此，本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体和本发明化合物或本发明
化合物的药学上可接受的盐。本发明化合物或其药学上可接受的盐也可以与一种或多种其它的治疗活性化合物组合而被包含在所述药物组合物中。所用的药物载体可以是例如固体、液体或气体。固体载体的实例包括乳糖、白陶土、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体的实例为糖浆、花生油、橄榄油和水。气体载体的实例包括二氧化碳和氮气。
[0108]
在制备用于口服剂型的组合物时，可以使用任何方便的药物基质。例如，水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等可用于形成口服液体制剂，例如混悬剂、酏剂和溶液；而诸如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等载体可用于形成口服固体制剂，例如散剂、胶囊剂和片剂。因为给药方便，所以片剂和胶囊是优选的口服剂量单位，由此使用的载体是固体药用载体。任选地，片剂可通过标准的水性或非水技术包衣。
[0109]
含有本发明组合物的片剂可以任选地与一种或者多种附属组分或者助剂通过压制或者成型来制备。压制片剂可在合适的机器上将以自由流动的形式例如粉末或颗粒存在的活性成分任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合压制而成。铸形片剂可以通过在适宜的机械中，将粉末化的用惰性液体稀释剂湿润后的化合物进行塑形而制得。
[0110]
本发明的药物组合物可利包含作为活性成分的本发明的化合物(或其药学上可接受盐)、药学上可接受的载体和任选存在的一种或多种其它治疗剂或辅剂。
[0111]
适于胃肠外给药的本发明的药物组合物可以制成活性化合物在水中的溶液或悬浮液。可以包含适合的表面活性剂，例如羟丙基纤维素。还可以在甘油、液态聚乙二醇和它们在油中的混合物中制备分散液。此外，还可以包含防腐剂以防止微生物的有害生长。
[0112]
适于注射用的本发明的药物组合物包括无菌的水溶液或分散液。此外，所述的组合物可以为用于临时制备这样的无菌可注射溶液或者分散液的无菌粉末的形式。在任何情况下，最终的可注射形式必须无菌且必须实际上为流体，以方便注射。药物组合物在制造和储存条件下必须是稳定的；因此，优选的贮存应防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、植物油及其合适的混合物。
[0113]
本发明的药物组合物可为适于局部使用的形式，例如气雾剂、乳膏、软膏、洗剂、撒粉、漱口剂、含漱剂等。此外，所述组合物可为适用于透皮装置的形式。这些制剂可以通过常规加工方法，利用本发明的化合物或其药学上可接受的盐制备。举例来讲，乳膏或软膏通过以下方式制备：将亲水性物质和水以及约5％重量至约10％重量的化合物混合以产生具有所需稠度的乳膏或软膏。
[0114]
本发明的药物组合物可以是适于直肠给药的形式，其中载体是固体。优选的是，混合物形成单位剂量栓剂。适合的载体包括可可脂及本领域常用的其它物质。通过首先将组合物和软化或熔化的载体混合，然后在模具中冷却和成形，可方便地形成栓剂。
[0115]
除了上述的载体成分外，视情况而定，上面描述的药物制剂可以包含一种或者多种另外的载体成分，例如稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等等。另外，可以包含其它的辅剂以使所述制剂与目标受体的血液等渗。含有本发明化合物和/或其药学上可接受的盐的组合物也可以制备成粉末或液体浓缩物形式。
[0116]
然而，应理解的是，任何特定患者的特定剂量水平会取决于各种因素。这些因素包括患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食。其他因素包括给药时间和途径、排泄率、药物组合以及正在接受治疗的特定疾病的类型和严重程度。
[0117]
应当理解，所公开的组合物可以由所公开的化合物制备。还应理解，所公开的组合物可用于所公开的使用方法中。
[0118]
因此，本发明的药物组合物包括含有除了本发明的化合物之外的一种或多种其他活性成分的药物组合物。
[0119]
上述组合不仅包括所公开的化合物与一种其他活性化合物的组合，还包括所公开的化合物与两种或多种其他活性化合物的组合。同样，所公开的化合物可与用于预防、治疗、控制、改善所公开的化合物对其有用的疾病或病症、或者降低其风险的其他药物组合使用。这些其他药物可以通过其通常使用的途径和量与本发明的化合物同时或顺序给药。当本发明的化合物与一种或多种其它药物同时使用时，优选除本发明的化合物之外还含有此类其它药物的药物组合物。因此，本发明的药物组合物包括含有除了本发明的化合物之外的一种或多种其他活性成分的药物组合物。
[0120]
本发明化合物与第二活性成分的重量比可以改变，并会取决于每种成分的有效剂量。通常，会使用各自的有效剂量。因此，例如，当本发明的化合物与另一种药剂组合时，本发明的化合物与另一种药剂的重量比通常为约1000:1至约1:1000以及其间的任何量，优选约200:1至约1:200。本发明的化合物和其他活性成分的组合通常也会在上述范围内，但在每种情况下，应使用每种活性成分的有效剂量。
[0121]
在这样的组合中，本发明的化合物和其它活性剂可以单独或联合给药。此外，一种成分的给药可以在给药其他药剂之前、同时或之后进行。
[0122]
因此，本发明的化合物可以单独使用或与已知在本发明的适应症中有益的其他药剂或影响受体或酶的其他药物组合使用，所述受体或酶增加所公开的化合物的有效性、安全性、方便性或减少其有害的副作用或毒性。本发明的化合物和其他药剂可以同步治疗的形式或以固定组合的形式共同给药。
[0123]
除了其优异的安全特性之外，本发明的化合物还由于其使用的可行性而是合乎需要的。虽然是一种施用选择，但是本发明的化合物不必注射或输注，因为它们是口服可生物利用的。此外，本发明的化合物在室温下具有较长的保质期(≥2年)。与生物疗法相比，本发明的化合物还可以以显著更低的成本制备，这将进一步降低患者的负担并确保可获得性。
[0124]
在本发明的另一个实施方案中，本发明的化合物可与具有治疗肾损伤和/或炎症的已知副作用的另一种活性剂共同施用给有此需要的患者。
[0125]
即，本发明的化合物可以单独施用，或与有效量的至少一种额外的活性剂组合施用。“组合”或“联合”或“共同”应理解为功能性共同施用，其中一些或所有化合物可以以不同制剂、不同施用模式(例如，皮下、静脉内或口服)和不同施用时间分开施用。这种组合的单个化合物可以在分开的药物组合物中顺序施用，也可以在组合的药物组合物中同时施用。
[0126]
本发明人已经表明，蛋白尿性肾损伤增加肠系膜淋巴流动，并改变淋巴组成。本发明人在大鼠中使用了公认的嘌呤霉素氨基糖苷肾病(pan)模型。如所预期的，与对照组相比，pan大鼠形成腹水、蛋白尿、低白蛋白血症、血浆胆固醇和甘油三酯增加(下表1)。
[0127]
表1：对照和pan大鼠中白蛋白/肌酐浓度比(acr)、血浆白蛋白、血浆总胆固醇和甘油三酯浓度
[0128][0129]
数据表示为平均值
±
sem
[0130]
每组n＝12
[0131]
蛋白尿性损伤引起了肠系膜淋巴流动的显著增加(见图1a)。pan的肠系膜淋巴中白蛋白减少，尽管淋巴体积增加，但与对照组相比，pan的肠系膜总白蛋白产量较少(见图1b)。与对照相比，pan中胆固醇和甘油三酯的淋巴浓度较低，然而，这些脂质的总淋巴产量增加，同时血浆脂质升高(见图1c，表1)。pan不影响淋巴ldl颗粒大小，但与对照相比，pan的淋巴中与vldl对应的含甘油三酯的颗粒更小，hdl颗粒更大(见图1d)。hdl颗粒的进一步分析显示，与球形hdl一致的级分中总蛋白、总胆固醇和磷脂增加(见图1e)。血浆hdl颗粒大小没有改变(pan：10.7
±
0.1nm vs对照组：10.5
±
0.1nm，pns)。
[0132]
由于循环中30％的apoai起源于回肠，因此我们还评估了apoai的肠道和淋巴水平。回肠apoai蛋白水平没有组间差异(pan：1.06
±
0.06μg/mg vs对照组：1.16
±
0.17μg/mg，pns)，但与对照组相比，pan中apoai的总肠系膜产量显著更高(见图1f)。这伴随着在损伤早期pan中血浆apoai水平高于对照组(见图1g)。pan大鼠的回肠显示出更显著的apoai蛋白表达，其从上皮细胞的顶端重新分布到管腔侧，并与肠绒毛内的淋巴乳糜管共定位(见图1h)。
[0133]
pan损伤影响了肠系膜淋巴的免疫细胞组成，增加了th17细胞(cd3
+
/cd4
+
/ccr6
+
)的数量(见图2a)。pan淋巴具有显著升高的细胞因子，包括il-6、il-10和il-17(见图2b)。值得注意的是，在pan与对照组之间，同时获得并与淋巴样品一起测定的血浆细胞因子没有差异。这些结果证明，蛋白尿性肾损伤增加肠系膜淋巴的流动速度、淋巴脂质、脂蛋白、免疫细胞和细胞因子，但许多变化中许多与血浆的变化并不平行。
[0134]
本发明人还表明，蛋白尿性肾损伤扩大了肠淋巴管网络，并改变了淋巴管内皮细胞的表型。淋巴管生成标志物，包括平足蛋白、lyve-1和vegfr3，在pan和对照组的回肠中都显著增加(见图3a)。与对照组相比，除了更高的mrna，通过ihc，pan的回肠显示出更高的平足蛋白阳性淋巴管(见图3b)。转基因nep25小鼠的结果证实了这些发现，与野生型小鼠相比，转基因nep25小鼠的平足蛋白和vegfr3(flt4)的回肠基因表达增加(见图3c)。与pan大鼠类似，与未损伤的小鼠相比，蛋白尿小鼠的回肠中平足蛋白的表达增加(见图3d)。
[0135]
为了确定肾损伤是否影响淋巴管内皮细胞(lec)，从pan和对照大鼠回肠分离的lec中通过pcr定量关键基因的表达。内皮特异性一氧化氮(nos3)是血管舒张的关键介质，与对照大鼠相比，从pan分离的肠道lec中内皮特异性一氧化氮显著增加(见图3e)。pan还显著上调了趋化因子ccl21的肠道表达，ccl21是免疫细胞募集的关键介质(见图3f)。从pan回肠分离的平足蛋白阳性lec也表现出更高的sphk2表达和降低的spns2表达(sphk2和spns2是s1p产生的两个关键调节因子)，这反过来刺激淋巴细胞迁移和存活(见图3g)。与对照组相比，pan的肠系膜淋巴含有更多的s1p(见图3h)。总之，这些结果支持了蛋白尿性肾损伤增
加肠lec中参与淋巴管生成、血管舒张和免疫细胞化学诱导的关键基因的概念。
[0136]
本发明人还表明，蛋白尿性肾损伤增加了调节淋巴管内皮细胞和淋巴管动力学的isolg修饰的脂蛋白。肾损伤增加氧化应激和脂质过氧化，其可产生多种脂质醛家族，包括损害apoai功能的isolg。pan大鼠回肠中的总isolg-赖氨酸含量高于对照组(见图4a)。pan大鼠还显示出肠系膜淋巴中isolg-赖氨酸水平显著增加(见图4b)，但血浆中则不然(pan：0.20
±
0.07pmol/mg蛋白质vs对照组：0.15
±
0.03pmol/mg蛋白质，pns)。有趣的是，与载体处理的类肠相比，暴露于尿毒症毒素硫酸吲哚酚(is)的培养类肠中isolg加合物的产生显著增加(见图4c)。事实上，针对apoai和isolg的回肠的共染色显示了pan大鼠回肠中的表位重叠和共定位(见图4d)。
[0137]
为了确定isolg-apoai是否直接影响淋巴管，将培养的lec暴露于isolg-apoai。与未修饰的apoai相比，isolg-apoai导致ros的产生显著增加(见图5a)。此外，与用未修饰的apoai处理的lec相比，暴露于isolg-apoai的lec具有增加的nos3(见图5b)。在离体研究中，与未修饰的apoai相比，暴露于isolg-apoai的经分离的肠系膜淋巴管显示出增加的收缩频率(见图5c)。尽管isolg-apoai没有显著改变收缩末期直径(esd)(见图5d)，但在isolg-apoai处理的淋巴管中，舒张末期直径(edd)显著降低(见图5e)，同时收缩幅度显著减小(见图5f)。这些研究揭示了isolg-apoai对淋巴管动力学的直接影响，这与天然apoai不同。结果还表明，收缩频率是体内淋巴流动增加的驱动力。
[0138]
vegf-c是促进淋巴管生成的主要生长因子。与对照大鼠相比，pan回肠中的vegf-c蛋白水平显著增加(见图6a)。重要的是，pan的肠系膜淋巴中的vegf-c蛋白水平显著增加(见图6b)，而没有观察到pan与对照大鼠在血浆vegf-c上的差异(pan：11.03
±
0.76pg/ml vs对照组：10.91
±
0.59pg/ml，pns)。pan在肠道乳糜管中有更多的cd68+细胞(巨噬细胞)，这些细胞与vegf-c蛋白共定位(图6c)。淋巴中vegf-c蛋白含量的增加可能与淋巴管hdl的isolg修饰有关，因为与未修饰的apoai相比，用isolg-apoai处理的巨噬细胞显示出vegfc mrna的表达显著增加(见图6d)。这些数据支持这样一种假设，即，回肠可能是肠淋巴管中vegf-c水平增加的来源，以及肠巨噬细胞可能导致所观察到的增加。
[0139]
与未经治疗的nep25小鼠相比，用本发明化合物治疗的nep小鼠显示出肠平足蛋白表达显著降低(图7a)。本发明的化合物还降低了回肠中isolg加合物的水平(图7b)。图8示出了减少肠系膜淋巴中的isolg的另一种本发明的化合物。
[0140]
实验和临床数据已经有力地证实，肾损伤对心脏、肺和肠道等远端器官具有有害影响。在肠-肾串话机制方面，研究主要集中在肾病对肠道微生物组和屏障功能障碍的影响上。本发明的各个方面表明了蛋白尿性肾损伤对肠淋巴管的影响，肠淋巴管在脂质和脂蛋白的吸收、代谢和运输以及调节免疫和炎症中起核心作用。通过使用这两个模型，本发明人证明蛋白尿性肾损伤增强了肠淋巴管生成、肠系膜淋巴流动、淋巴管收缩和淋巴管内皮细胞的激活。肠系膜淋巴的组成也发生了改变，细胞因子和免疫细胞增加。本发明人证明，肾损伤导致isolg肠道产生增加，isolg可以加合局部的apoai。然后，源自肠道的isolg-apoai直接或间接地(例如，通过刺激vegf-c、enos、ros)改变淋巴管网络的生长和动力学，并因此增加潜在有害生物活性元素的传播。总之，这些数据指向了构成肾病的不良全身性后果的基础的肾和肠道之间的串话机制的一种新途径，其中肠淋巴管网络作为管道而isolg-apoai作为这些作用的新介质。
[0141]
两种不同的蛋白尿性肾损伤模型具有显著扩大的肠淋巴管生成，淋巴管内皮标志物平足蛋白、lyve-1和vegfr3的mrna和免疫染色的增加证明了这一点。肾损伤也改变了肠lec的表型。从pan大鼠回肠中分离的平足蛋白阳性lec的nos3 mrna显著升高，结果与以往的研究一致，表明lec产生(elaboration)enos是淋巴管扩张的主要因素。这些数据与在pan大鼠中观察到的肠系膜淋巴流动比对照组显著增加相一致，并符合这样的观察结果，即，enos放大淋巴细胞和其他免疫细胞的运输，将它们引导到淋巴结进行抗原呈递和启动先天性和适应性免疫反应。lec可产生趋化因子梯度，尤其是ccl21，其将树突细胞、巨噬细胞和t淋巴细胞亚群募集到淋巴管网络中。本发明人表明，pan中回肠平足蛋白阳性lec增加了ccl21的表达。肠道lec显示出调节免疫细胞运输的其他因素的增加，例如s1p和s1pr1。蛋白尿性肾损伤增加了潜在毒性免疫细胞(th17淋巴细胞)和细胞因子(il-6、il-10、il-17)的水平。总之，我们的数据表明，蛋白尿性肾损伤扩大肠淋巴管网络，然后肠淋巴管网络增强淋巴从肠道的流动。我们还表明，蛋白尿性肾损伤导致淋巴管lec激活，免疫/炎症细胞的血管动力学介质和化学引诱剂的表达增加。
[0142]
pan大鼠肠系膜淋巴中的胆固醇和甘油三酯浓度低于对照组。然而，在淋巴流动增加的情况下，pan大鼠的胆固醇和甘油三酯的肠系膜总产量更大，这可能导致蛋白尿病特有的严重混合性血脂异常。胆固醇和甘油三酯进入乳糜微粒或与hdl中的apoai结合。由于肠道合成的apoai占总apoai的三分之一，因此我们接下来研究了pan对肠道apoai的影响。为了限制膳食脂蛋白的产生，在我们的研究中动物被禁食。我们的数据没有显示出pan与对照组在回肠淋巴中apoai蛋白浓度的差异，然而，ihc显示apoai从上皮细胞的顶端重新分布到管腔侧，与淋巴乳糜管共定位。重新分布和/或分泌增加以及淋巴流动增加可能有助于增加apoai的肠系膜产量。除了apoai的肠系膜产量增加外，我们的研究还表明，在肾损伤的早期阶段，肠系膜淋巴含有更大的hdl颗粒，更多的细胞因子，更高的vegf-c和增加的isolg(如下所述)。有趣的是，与对照大鼠相比，在同时获得的pan血浆中，没有观察到pan淋巴中许多分子的水平增加，这些数据支持这样一种观点，即，至少在肾损伤后的早期阶段，肠道是潜在有害分子的来源。
[0143]
蛋白尿性肾损伤导致肠道产生反应性过氧化产物isolg，isolg是apoai/hdl的强大调节剂，可降低其许多有益作用，包括结合lps、排出细胞胆固醇和抑制细胞因子反应的能力降低。apoai/hdl的isolg修饰与败血症、高血压和cvd的发病机制有关。ros在这些病症中增加，是isolg产生的强大刺激物。本发明人发现，pan大鼠的肠系膜淋巴富含isolg。我们的数据还显示，硫酸吲哚酚(一种起源于肠道的毒素，已知其刺激ros)显著增加培养的回肠类器官中的isolg加合物。由于类器官包含回肠内的不同细胞，因此负责产生isolg的特定细胞类型尚不确定。这些数据与我们的体内研究结果一致，显示pan大鼠的回肠壁和肠系膜淋巴中的isolg含量与对照组相比有所增加。事实上，我们通过淋巴细胞标志物和isolg的双重染色证明，isolg-apoai定位于回肠淋巴管中。因此，该研究表明，蛋白尿性损伤增加了肠道isolg的产生，isolg可以修饰局部apoai，但肠道产生的和循环衍生的apoai颗粒都可以被isolg修饰。
[0144]
数据表明，肠淋巴管不仅是脂蛋白运输的管道，而且是其作用的靶点。先前的研究已经描述了apoai/hdl可调节淋巴管生成和淋巴管完整性。本发明人研究了isolg-apoai对淋巴管或lec的影响是否不同于正常apoai。与未修饰的apoai相比，isolg-apoai增加了培
养的lec中的nos3 mrna。这些结果补充了本发明人的体内研究结果，即，从pan回肠分离的lec具有增加的nos3 mrna。isolg-apoai还改变了分离的肠系膜淋巴管的功能，包括与未修饰的apoai相比，血管活性减弱和收缩频率更高。尽管对单个淋巴管动力学的离体评估不包括神经支配、循环细胞因子或淋巴流动的贡献，但是在来自其他变量的影响被最小化的情况下，该方法揭示了isolg-apoai的直接影响。总之，结果表明，isolg-apoai能刺激lec产生血管扩张剂，并导致淋巴管更加松弛。尽管如此，如在pan大鼠中记录的，与对照组相比，收缩频率的同时增加可以促进更高的淋巴流动，并从而促进更高地递送肠道产生的分子和细胞。
[0145]
除了直接影响lec外，isolg-apoai还改变了调节淋巴管网络的其他细胞类型。与对照组相比，pan大鼠的肠和肠系膜淋巴中的vegf-c水平增加，pan大鼠和nep25小鼠二者回肠中的淋巴管生成和平足蛋白免疫染色增加。虽然我们没有在我们的蛋白尿性损伤模型中专门研究vegf-c的来源，但巨噬细胞长期以来一直被认为是vegf-c的重要来源。巨噬细胞耗竭或vegf-c信号传导的阻断已被证明减少淋巴管生成。在本研究中，肠绒毛的巨噬细胞浸润与pan中的vegf-c共定位。这些数据支持这样一种假设，即，在蛋白尿性损伤中，巨噬细胞是肠道vegf-c的重要来源。我们的结果补充了原始的观察结果，即，isolg-apoai可以增加巨噬细胞vegfc表达。总之，这些数据表明，isolg-apoai调节淋巴管的机制包括lec基因的直接调节，以及通过巨噬细胞产生vegf-c而间接增加淋巴管网络。
[0146]
因此，本发明人发现了肾病和肠道反应之间的新联系(图7)。本发明的一或多个方面显示，肾损伤刺激肠内产生isolg加合物，其修饰源自肠道的apoai/hdl。本发明的其他方面表明，肠/肠系膜淋巴管网络通过增强淋巴管生成、淋巴管收缩、lec激活和淋巴流动增加，而起到isolg-hdl作用的靶点和肇事者的作用。净效应是肠道衍生分子的更高递送，所述分子构成了不利的肾-肠串话机制的新机制。
[0147]
方法
[0148]
动物
[0149]
将成年雄性sprague dawley大鼠(200-225g，charles river)在12小时明/暗循环下饲养，自由获取正常大鼠食物和水。通过单次注射嘌呤霉素氨基糖苷(pan)(125mg/kg体重，腹腔内注射(i.p.))诱导肾损伤，而将注射盐水的大鼠用作对照(cont)。注射后8天，处死大鼠，并采集血液、尿液和组织。我们还研究了在足细胞上表达人cd25的成年雄性(12周龄)nphs1-hcd25转基因(nep25，c57 bl/6背景)小鼠可以通过注射会导致蛋白尿的重组免疫毒素抗tac(fv)-pe38(由ira pastan博士慷慨提供的lmb2，1ng/g bw，静脉内注射(i.v.))而选择性地损伤。这些小鼠和野生型对照小鼠在正常条件下进行饲养，自由获得常规的啮齿动物食物和水。lmb2后两周，处死小鼠，并采集血液、尿液和组织。所有动物程序都得到了vanderbilt university动物护理和使用委员会(institutional animal care and use committee)的批准。
[0150]
淋巴、血浆和尿液成分评估
[0151]
肠系膜淋巴管插管后，在一组清醒的大鼠中采集肠系膜淋巴。将大鼠置于温度和湿度受控的培养箱中的bollman笼中，每小时采集一次淋巴，持续至少3小时。
[0152]
通过elisa法测定白蛋白(exocell)、apoai(mybiosource)、鞘氨醇-1-磷酸(s1p)(mybiosources)和vegf-c水平(mybiosources)。白蛋白尿分别以尿白蛋白与肌酐的比值
(acr)(nephrat ii，exocell)和quantichromtm肌酐测定试剂盒(bioassay systems)进行测定。用酶法测定血浆和淋巴的总胆固醇和甘油三酯(cliniqa)。用溴化钾调节后，通过密度梯度超速离心从血浆和淋巴中分离hdl和ldl级分。通过nmr方法评估脂蛋白颗粒大小(liposcience)。使用比色测定法测量蛋白质(bca，thermofisher)。使用akta pure快速蛋白液相色谱(fplc)系统(ge healthcare)通过尺寸排阻色谱法(sec)分离血浆和淋巴中的脂蛋白。淋巴样品完全蛋白水解消化后，通过lc/ms测定总isolg-蛋白加合物作为isolg-赖氨酸。
[0153]
通过luminex multiplex测定白细胞介素-6(il-6)、il-10、il-17和il-1的血浆和淋巴水平。通过流式细胞术对淋巴中的免疫细胞进行定量。将样品用fc阻断抗体(bd biosciences)进行孵育，然后用bv421-偶联的抗cd3(bd biosciences)、pe/cy7-偶联的抗cd4(biolegend)、percp-偶联的抗cd8(biolegend)、alexa flour 488-偶联的抗cd25(biolegend)或pe-偶联的抗ccr6(r&d systems)在室温下孵育30分钟。将细胞用facsdiva软件(bd biosciences)在facscanto ii流式细胞仪上进行分析。
[0154]
肠组织的免疫染色
[0155]
将回肠切片在4％多聚甲醛/pbs中固定，脱水，用石蜡包埋，并切割以进行免疫染色。我们将重点放在小肠上，因为淋巴流入肠系膜淋巴管中，而且回肠对apoai的合成至关重要。对于平足蛋白染色，将回肠切片与小鼠抗平足蛋白抗体(1:1000，novus)孵育过夜，然后用hrp抗小鼠抗体(vector laboratories)进行孵育，并用二氨基联苯胺显示信号。将小鼠回肠切片与仓鼠抗平足蛋白抗体(1:2000，thermofisher)孵育过夜，然后用生物素化的抗仓鼠抗体(vector laboratories)和abc试剂进行孵育，并用二氨基联苯胺显示信号。
[0156]
apoai和平足蛋白的双重染色使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原回收，然后用一抗apoai(1:200；novus)过夜。使用immpress试剂(vector laboratories)和alexa fluor 546tyamide superboost(invitrogen)作为二抗。将切片用小鼠抗大鼠平足蛋白孵育过夜，然后用抗小鼠辣根过氧化物酶(hrp)(immpress)和alexa fluor 488tyamide superboost孵育过夜。isolg和apoai的双重染色使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原回收，然后用抗isolg(1:10；由annet kirabo博士慷慨赠与)过夜。第二抗体使用红色碱性磷酸酶底物试剂盒(vector laboratories)作为色原。然后将切片用兔抗大鼠apoai孵育过夜，然后用抗兔辣根过氧化物酶(hrp)(immpress)和alexa fluor 488tyamide superboost孵育过夜。cd68和vegf-c的双重染色使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原回收，然后使用靶向cd68的生物素化一抗(1:10；biorad)孵育过夜。第二抗体是abc试剂和alexa fluor 488tyamide superboost。然后将切片与小鼠抗大鼠vegf-c(1:200；abcam)孵育过夜，然后用抗小鼠辣根过氧化物酶(hrp)(immpress)和alexa fluor 546tyamide superboost孵育过夜。
[0157]
离体淋巴管动力学测定
[0158]
采集肠系膜淋巴管，并将其固定在灌注室中。将室放置在配备数字图像捕获系统(ionoptix)的倒置显微镜上，以记录阀前管腔内直径(pre-valve intraluminal diameter)和收缩频率。将淋巴管温热至37℃，使用krebs缓冲液柱加压至0.5mmhg，并使其平衡(20-60分钟)。然后以逐步的方式将有活力的淋巴管加压至3.5mmhg的恒定压力，然后使用1摩尔当量的合成isolg或载体(dmso)暴露于纯化的apoai或修饰的apoai。新鲜的
krebs缓冲液进行循环以便于冲洗。接下来将淋巴管暴露于isolg修饰的apoai。每次激发(challenge)后，使管腔直径稳定(40-60分钟)。
[0159]
肠淋巴管内皮细胞的特征
[0160]
将pan大鼠和对照大鼠的回肠切碎，然后用d型胶原酶(roche applied science)、1mlhbss培养基和10ml/ml dnase孵育1小时。使用70μm筛、然后使用40μm筛过滤组织。将细胞重悬，并与平足蛋白选择性试剂(novus)一起孵育。使用easyeights磁性细胞分离系统(stemcell technologies)分离淋巴管内皮细胞，即平足蛋白阳性细胞。
[0161]
通过rnase mini试剂盒(qiagen)从回肠裂解物和回肠平足蛋白阳性细胞中分离总rna。使用high-capacity cdna逆转录试剂盒(applied biosystems)进行逆转录。使用12.5μl universal master mix ii、1.25μl正向和反向引物[平足蛋白(pdpn)、淋巴管内皮受体(lyve1)、血管内皮生长因子受体3(vegfr3，flt4)、鞘氨醇激酶2(sphk2)、鞘脂转运蛋白2(spns2)、c-c基序趋化因子配体21(ccl21)和一氧化氮合酶3(enos，nos3)](thermofisher)和11.25μlcdna(10ng/μl)，在25μl的总反应体积中进行定量实时pcr。定量实时pcr使用具有以下循环参数的cfx96
tm
实时pcr检测系统(rt-pcr，bio-rad)：聚合酶在95℃下激活10分钟，在95℃和60℃下扩增40个循环周期，分别为15秒和60秒。将实验循环阈值(ct)值归一化为在相同板上测量的18s，并且通过2
–
δδct
方法确定基因表达的倍数差异。
[0162]
类器官和细胞培养
[0163]
完整的灌流肠被用来产生回肠类器官。将培养的回肠类器官在含有或不含硫酸吲哚酚(1mmol/l，sigma)的培养基中孵育3天。提取总蛋白用于isolg的定量。
[0164]
将原代成人皮肤淋巴管内皮细胞(lec)(hmvec-dlyad，lonza)用条件生长培养基(lonza)进行培养。将具有约70％汇合的第5-6代细胞在无血清培养基中饥饿过夜，然后与未经修饰的或isolg修饰的apoai(apoai：10μg/ml，isolg：1μm/l)一起孵育18小时。在此之前，我们证明了这种浓度的isolg产生体内观察到的isolg-赖氨酸加合物水平，并且不会产生未反应的isolg。通过rt-pcr对enos(nos3)和β-肌动蛋白(actb)mrna进行定量，并通过高效液相色谱法评估过氧化物的产生。
[0165]
将thp-1细胞铺板，并通过含有10％ fbs和50ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯的rpmi 1670分化为巨噬细胞，持续3天。将细胞与未修饰的或isolg修饰的apoai(apoai：10μg/ml，isolg：1μm/l)一起孵育48小时。通过rt-pcr来评估vegfc mrna。
[0166]
统计学分析
[0167]
数据表示为平均值
±
sem。通过非配对t检验确定差异，并且p《0.05被认为具有显著性。
[0168]
本文提及的所有出版物，包括下文列出的那些，通过援加入本文，以结合这些出版物所引用的方法和/或材料来公开和描述方法和/或材料。本文所讨论的出版物仅为了它们在本技术的申请日之前的公开而提供。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权因在先发明而早于此类出版物。此外，此处提供的出版日期可能与实际出版日期不同，需要独立确认。
[0169]
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[0228]
很明显，这样描述的本发明可以许多方式变化。对本领域技术人员来说显而易见的此类变化应被认为是本公开的旁支。
[0229]
除非另有说明，本说明书中所用的表示成分的量、诸如反应条件的性质等的所有数字应理解为在所有情形下都由术语“大约”修饰。因此，除非有相反的指示，说明书和权利要求书中所述的数值参数都是近似值，其可根据本发明寻求确定的所需性能而变化。
[0230]
虽然阐述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但在实验部分或实例部分所给出的数值是尽可能精确报告的。然而，任何数值都固有地包含必然由它们各自的试验测量中存在的标准偏差造成的一定误差。

技术特征：
1.治疗蛋白尿性肾损伤的方法，其包括：鉴定需要治疗肾损伤的个体；以及向所述个体施用isolg清除有效量的至少一种下式的化合物：其中：r为n或c-r2；r2独立地选自h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、c
1-c
10
烷氧基、羟甲基、羟基；r3为h、卤素、c
1-c
10
烷基、烷氧基、羟基、硝基；r4为h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、羧基；及其药学上可接受的盐。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物是2-羟基苄胺、甲基-2-羟基苄胺、乙基-2-羟基苄胺或5'-o-戊基-吡哆胺。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物具有下式：其中：r2独立地选自h、取代或未取代的烷基；r3为h、卤素、烷基、烷氧基、羟基、硝基；r4为h、取代或未取代的烷基、羧基；及其药学上可接受的盐。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白尿性肾损伤是因肾病导致的损害。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述损害是对肠淋巴管网络的损伤。6.根据权利要求4所述的方法，其中所述损害是淋巴管的收缩增加和淋巴管内皮细胞的激活。7.根据权利要求4所述的方法，其中所述损害是淋巴运输和淋巴管完整性的破坏。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物是：
或其药学上可接受的盐。9.调节肠淋巴管功能以改善肾损伤或肾病的方法，其包括施用isolg清除有效量的至少一种下式的化合物：其中：r为n或c-r2；r2独立地选自h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、c
1-c
10
烷氧基、羟甲基、羟基；r3为h、卤素、c
1-c
10
烷基、烷氧基、羟基、硝基；r4为h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、羧基；及其药学上可接受的盐。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述化合物是2-羟基苄胺、甲基-2-羟基苄胺、乙基-2-羟基苄胺或5'-o-戊基-吡哆胺。11.根据权利要求9所述的方法，其中所述化合物具有下式：
其中：r2独立地选自h、取代或未取代的烷基；r3为h、卤素、烷基、烷氧基、羟基、硝基；r4为h、取代或未取代的烷基、羧基；及其药学上可接受的盐。12.改善肾损伤或肾病的全身性并发症的方法，其包括施用isolg清除有效量的至少一种下式的化合物：其中：r为n或c-r2；r2独立地选自h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、c
1-c
10
烷氧基、羟甲基、羟基；r3为h、卤素、c
1-c
10
烷基、烷氧基、羟基、硝基；r4为h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、羧基；及其药学上可接受的盐。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述化合物是2-羟基苄胺、甲基-2-羟基苄胺、乙基-2-羟基苄胺或5'-o-戊基-吡哆胺。14.根据权利要求12所述的方法，其中所述化合物具有下式：
其中：r2独立地选自h、取代或未取代的烷基；r3为h、卤素、烷基、烷氧基、羟基、硝基；r4为h、取代或未取代的烷基、羧基；及其药学上可接受的盐。15.根据权利要求12所述的方法，其中所述isolg是在肠淋巴管网络中。16.根据权利要求12所述的方法，其中所述全身性并发症是心血管的、血液循环的或肥胖相关的。17.改善肠淋巴管功能障碍的方法，其包括施用isolg清除有效量的至少一种下式的化合物：其中：r为n或c-r2；r2独立地选自h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、c
1-c
10
烷氧基、羟甲基、羟基；r3为h、卤素、c
1-c
10
烷基、烷氧基、羟基、硝基；r4为h、取代或未取代的c
1-c
10
烷基、羧基；及其药学上可接受的盐。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述化合物是2-羟基苄胺、甲基-2-羟基苄胺、乙基-2-羟基苄胺或5'-o-戊基-吡哆胺。19.根据权利要求17所述的方法，其中所述化合物具有下式：
其中：r2独立地选自h、取代或未取代的烷基；r3为h、卤素、烷基、烷氧基、羟基、硝基；r4为h、取代或未取代的烷基、羧基；及其药学上可接受的盐。20.根据权利要求17所述的方法，其中所述功能障碍是肠淋巴管生成。

技术总结
治疗蛋白尿性肾损伤的方法，该方法包括施用isoLG清除有效量的至少一种本发明的化合物。物。物。


技术研发人员：科恩 N
受保护的技术使用者：范德比尔特大学
技术研发日：2021.10.13
技术公布日：2023/8/8