一种欧美山杨杂种组培苗离体根诱导再生植株的方法与流程

1.本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种欧美山杨杂种组培苗离体根诱导再生植株的方法。


背景技术：

2.欧美山杨杂种(populus tremula
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p.tremuloides)是由欧洲山杨(p.tremula)和北美山杨(p.tremuloides)的杂交种品种，是芬兰林业科学院通过几十年对山杨进行杂交育种和优良无性
3.系的选择，最终筛选出来的山杨杂种优良品种，其具有生长快、耐寒、耐贫瘠、树形高大、
4.适应性强等特点，是北方山地造林的优良树种。目前作为优良用材树种被许多国家广泛引进。
5.但是大多数白杨派树种因在无性繁殖中扦插生根比较困难，给大量无性扩繁带来障碍，
6.为此詹亚光等人在《叶腋增殖途径快速繁殖欧美杂种山杨》一文中提出以欧美山杨杂种腋芽
7.为外植体进行组织培养，以建立有效的欧美山杨杂种叶腋增殖快繁途径。
8.以欧美山杨杂种腋芽为外植体进行组织培养的具体方法为：
9.(1)预处理：欧美山杨杂种的枝条采回后，水培2～3天，取新枝接种。将嫩枝上的叶片
10.去除后，用消毒水冲洗3～4次，75％酒精浸泡30s，边泡边摇，然后用0.1％氯化汞灭菌2min，
11.再用灭菌的蒸馏水洗净残液，漂洗3～5遍。
12.(2)初始培养：将步骤(1)预处理后的嫩枝切成1cm长的茎段接种至初始培养基上，
13.控制培养温度为25～28℃，光照16h/d，光照度为1400～1600lx，相对湿度为40～50％。半个月
14.后，叶腋萌动，一个月后形成展叶枝，在叶腋处又有新的侧枝形成。最优的初始培养基为
15.wpm+ba 1.0mg/l+2％蔗糖+琼脂5.2g/l。
16.(3)将步骤(2)获得的无菌苗接种于分化培养基中培养15天，当试管苗长到2cm以
17.上时，将其切下，再进行单株生根培养，10天长出长0.5cm的不定根。苗长出新根后可移栽。
18.但是该方法仍然较为复杂，且培育时间较长，差不多需要3个月左右的时间。


技术实现要素：

19.本发明的目的在于提供一种培育周期短，培育方法简单的欧美山杨杂种组培苗离
体根诱
20.导再生植株的方法。
21.为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：本发明提供了一种欧美山杨杂种组培苗离体根诱导再生植株的方法，使欧美山杨杂种组培苗的离体根在培养基中进行再生植株诱导培养，其中，所述培养基以减量ms培养基为基础，所述减量ms培养基是ms培养基中的无机盐成分减少50％～80％或者全部成分减少50％～80％，所述培养基中还含有琼脂、蔗糖、终浓度为0.05～0.3mg/l的6-ba、终浓度为0.1～0.6mg/l的naa、终浓度为0.05～0.3mg/l的iba。
22.其中，减量ms培养基可以为ms培养基中的无机盐成分减少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％。
23.减量ms培养基还可以为ms培养基中的全部成分减少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％。
24.根据一些优选实施方式，所述减量ms培养基是ms培养基中的无机盐成分减少65％～80％或者全部成分减少65％～80％。
25.根据一些进一步优选实施方式，所述减量ms培养基是ms培养基中的无机盐成分减少70％～80％或者全部成分减少70％～80％。
26.根据一些更为具体且优选实施方式，所述减量ms培养基是ms培养基中的全部成分减少70％～80％。
27.其中，所述6-ba的终浓度为0.05mg/l、0.06mg/l、0.07mg/l、0.08mg/l、0.09mg/l、0.1mg/l、0.11mg/l、0.12mg/l、0.13mg/l、0.14mg/l、0.15mg/l、0.16mg/l、0.17mg/l、0.18mg/l、0.19mg/l、0.2mg/l、0.21mg/l、0.22mg/l、0.23mg/l、0.24mg/l、0.25mg/l、0.26mg/l、0.27mg/l、0.28mg/l、0.29mg/l或者0.3mg/l。
28.根据一些优选实施方式，所述6-ba的终浓度为0.05～0.2mg/l。
29.根据一些进一步优选实施方式，所述6-ba的终浓度为0.08～0.15mg/l。
30.其中，所述naa的终浓度为0.1mg/l、0.11mg/l、0.12mg/l、0.13mg/l、0.14mg/l、0.15mg/l、0.16mg/l、0.17mg/l、0.18mg/l、0.19mg/l、0.2mg/l、0.21mg/l、0.22mg/l、0.23mg/l、0.24mg/l、0.25mg/l、0.26mg/l、0.27mg/l、0.28mg/l、0.29mg/l、0.3mg/l、0.31mg/l、0.32mg/l、0.33mg/l、0.34mg/l、0.35mg/l、0.36mg/l、0.37mg/l、0.38mg/l、0.39mg/l、0.4mg/l、0.45mg/l、0.5mg/l、0.55mg/l或者0.6mg/l。
31.根据一些优选实施方式，所述naa的终浓度为0.1～0.4mg/l。
32.根据一些进一步优选实施方式，所述naa的终浓度为0.15～0.3mg/l。
33.其中，所述iba的终浓度为0.05mg/l、0.06mg/l、0.07mg/l、0.08mg/l、0.09mg/l、0.1mg/l、
34.0.11mg/l、0.12mg/l、0.13mg/l、0.14mg/l、0.15mg/l、0.16mg/l、0.17mg/l、0.18mg/l、0.19mg/l、
35.0.2mg/l、0.21mg/l、0.22mg/l、0.23mg/l、0.24mg/l、0.25mg/l、0.26mg/l、0.27mg/l、0.28mg/l、
36.0.29mg/l或者0.3mg/l。
37.根据一些优选实施方式，所述iba的终浓度为0.05～0.2mg/l。
38.根据一些进一步优选实施方式，所述iba的终浓度为0.05～0.15mg/l。
39.根据一些优选实施方式，所述琼脂的终浓度为6～7g/l，所述蔗糖的终浓度为25～35g/l。
40.根据一些优选实施方式，将诱导培养获得的再生植株在根部进行剪切，其中带芽的根进
41.行移栽，剩余的根作为离体根在所述培养基中进行再生植株诱导培养。
42.由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
43.本发明利用欧美山杨杂种组培苗的离体根进行再生植株培养，并通过采用特定配方的培
44.养基，能够缩短再生植株的培养时间，简化培养流程，并且具有诱导率高、再生频率高、培
45.育稳定等优势，开辟了一种新式的欧美山杨杂种组培繁殖技术，为工厂化生产提供理论依据。
附图说明
46.图1为实施例1中的离体根诱导5天的照片；
47.图2为实施例1中的离体根诱导15天的照片；
48.图3为实施例1中的离体根诱导30天的照片。
具体实施方式
49.由于以欧美山杨杂种腋芽为外植体进行组织培养的方式来扩繁欧美山杨杂种，仍存在培
50.养方法较为复杂，培育时间需要长达3个月左右的不足。发明人通过大量研究，确定了欧美
51.山杨杂种组培繁殖新方法，克服了以欧美山杨杂种腋芽为外植体进行培养的不足。
52.首先，发明人对欧美山杨杂种组培苗离体根进行培养，并且发明人对培养基进行优化筛
53.选，确定培养基的配方为以减量ms培养基为基础，培养基中还含有终浓度为0.05～0.3mg/l的6-ba、终浓度为0.1～0.6mg/l的naa、终浓度为0.05～0.3mg/l的iba。该培养方法具有
54.较高的再生植株诱导率、较高的再生频率、更高的移栽成活率且培育过程较为稳定的优势。
55.并且，该培养基以减量ms培养基作为基础培养基，相比使用ms培养基作为基础培养基，还具有节约成本的优势。
56.其次，通过在上述培养基中培养形成带根的再生植株，将根剪下，再次进行再生植株诱导，又可形成带根的再生植株，形成一个循环技术体系，即：欧美山杨杂种组培苗根
再生植株。循环使用此技术，不仅缩短了育苗周期，简化了常规组培育苗流程，而且大大降低了生产成本，开辟了一种新式的欧美山杨杂种组培繁殖技术，为工厂化生产提供理论依据。
57.本发明主要对培养离体根的培养基体系进行了优化筛选，离体根培养过程中的培养温度等培养条件可以采用本领域已知条件。
58.本技术中的ms培养基可以市购获得，也可以自行配制。ms培养基的全部成分是指：kno
3 1900mg/l、nh4no
3 1650mg/l、mgso4·
7h2o 370mg/l、kh2po
4 170mg/l、cacl2·
2h2o 440mg/l、na2edta
·
2h2o 37.25mg/l、feso4·
7h2o 27.8mg/l、mnso4·
4h2o 16.9mg/l、znso4·
7h2o 8.6mg/l、h3bo
3 6.2mg/l、ki 0.83mg/l、namoo4·
2h2o 0.25mg/l、cuso4·
5h2o 0.025mg/l、cocl2·
6h2o 0.025mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、vb1 0.1mg/l、vb6 0.5mg/l以及甘氨酸2mg/l。
59.其中，全部成分减少是指上述列明的全部成分的浓度降低相应比例。比如，全部成分减少75％，即是指上述列明的所有成分的浓度均降低75％，以kno3为例，在该减量ms培养基中，kno3的浓度为475mg/l，其他成分亦如此。
60.有机盐成分减少是指上述列明的全部成分中的有机盐成分的浓度降低相应比例。有机盐成分为：kno3、nh4no3、mgso4·
7h2o、kh2po4、cacl2·
2h2o、na2edta
·
2h2o、feso4·
7h2o、mnso4·
4h2o、znso4·
7h2o、h3bo3、ki、namoo4·
2h2o、cuso4·
5h2o以及cocl2·
6h2o。
61.欧美山杨杂种组培苗是通过欧美山杨杂种的茎段，诱导腋芽，继代培养，最终通过生根诱导得到的组培苗。
62.下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
63.实施例1
64.剪下一段欧美山杨杂种组培苗的根，将根在减量ms培养基中进行培养，培养条件为：控制培养温度为25
±
2℃，光照12h/d，光照度为3000lx，相对湿度为60％；
65.减量ms培养基为：基础培养基、0.1mg/l的6-ba(6-苄氨基嘌呤)、0.2mg/l的naa(1-萘乙酸)、0.1mg/l的iba(吲哚丁酸)、6.5g/l的琼脂、30g/l的蔗糖。
66.其中，基础培养基采用ms培养基中的全部成分减少75％的培养基。
67.实施例2
68.与实施例1基本相同，不同之处在于：基础培养基采用ms培养基中的有机盐成分减少75％的培养基。
69.实施例3
70.与实施例1基本相同，不同之处在于：基础培养基采用ms培养基中的全部成分减少50％的培养基。
71.实施例4
72.与实施例1基本相同，不同之处在于：基础培养基采用ms培养基中的有机盐成分减少50％的培养基。
73.对比例1
74.与实施例1基本相同，不同之处在于：基础培养基采用ms培养基中的全部成分减少25％的培养基。
75.对比例2
76.与实施例1基本相同，不同之处在于：基础培养基采用ms培养基中的有机盐成分减少25％的培养基。
77.对比例3
78.与实施例1基本相同，不同之处在于：基础培养基采用1/2ms培养基。1/2ms培养基是硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾以及硫酸镁这四个成分的含量减半的培养基。
79.按照实施例1至4以及对比例1至3的方法对100条离体根诱导培养1个月，观察再生
80.植株的生长状态以及再生率。其中，再生率＝产生再生植株的根数/接种诱导的总根数。实验
81.结果见表1。
82.表1
[0083][0084]
从上述试验中可以得出，1/4ms(ms全部成分减3/4)的培养基配方较为适合欧美山杨
[0085]
杂种诱导再生植株，其诱导率高达95％，再生频率较高，再生植株生长较快，且较为稳定。
[0086]
另外，相比于对比例3采用常规ms培养基作为基础培养基，实施例1中的基础培养基
[0087]
中的全部成分减少3/4，所以在使用成本上减少了约3/4，从而大大降低了生产成本。
[0088]
实施例5
[0089]
与实施例1基本相同，不同之处在于减量培养基中的6-ba、naa以及iba的量不同。
[0090]
本实施例中各具体配方下的6-ba、naa以及iba的量以及再生率见表2，欧美山杨杂种组
[0091]
培苗离体根诱导再生植株的方差分析见表3。
[0092]
表2
[0093][0094][0095]
从表2中分析出，不同激素处理组合对欧美山杨杂种再生植株诱导都有较大的影响，通过极差分析，在欧美山杨杂种再生植株诱导过程中，三种激素对欧美山杨杂种再生植株诱导作用顺序为：6-ba＞naa＞iba，6-ba在欧美山杨杂种再生植株诱导中，其作用最大，r值为0.42。不同处理组合都有不同程度的再生率，其再生率最大的为1号培养基，再生率为95％，因此，筛选出欧美山杨杂种再生植株诱导最佳培养基配方为：1/4ms(ms全部成分减3/4)+6-ba 0.1mg/l+naa 0.2mg/l+iba 0.1mg/l+琼脂6.5g/l+蔗糖30g/l，诱导率高达95％。
[0096]
表3
[0097]
变异来源平方和自由度均方f值p值naa0.07220.03643.0000.0236-ba0.26220.131157.0000.006iba0.00120.0010.0011.000误差0.00220.001
ꢀꢀ
总和0.3558
ꢀꢀꢀ
[0098]
从表3方差分析中可以看出，在欧美山杨杂种再生植株诱导的过程中，细胞分裂素6-ba对欧美山杨杂种再生植株诱导影响较大，其f值为157，在0.05水平达到显著；其次，对欧美山杨杂种再生植株诱导过程影响大的为生长素naa，其f值为43，在0.05水平达到显著；生长素iba对欧美山杨杂种再生植株诱导影响较小，无显著水平。
[0099]
实施例6
[0100]
实施例1培养30天得到的再生植株，在移栽前，将再生植株从瓶中取出，剪切一段根部，按照实施例1的方法进行再生植株培养，培养周期为30天左右，又可以获得一批欧美山杨杂种再生植株，并且再生率与实施例1相当。
[0101]
因是从根部再生的植株，在移栽时将再生植株从根剪短，因一条根上会再生三个芽以上，因此将带芽的根一起剪下，因再生植株有根且根毛较多，较容易成活，以此操作，缩短了育苗周期，相比常规组培育苗，省掉了继代培养过程，直接培育一代欧美山杨杂种生根组培苗，后期直接修剪组培苗的根，接种到再生培养基中，再次获得一批欧美山杨杂种生根组培苗，形成循环体系，不仅简化了欧美山杨杂种常规的组培繁殖过程，而且大大降低了生
产成本；形成循环技术体系为：修剪组培苗根再生植株。
[0102]
此技术有如下优点：
[0103]
1.简化了组培育苗流程，缩短了育苗周期。常规育苗周期为三个月，应用本技术为1个月。
[0104]
2.降低了生产成本，为常规组培生产成本的1/3。常规组培需要三个月，本技术一个月，所以成本为常规组培生产成本的1/3。
[0105]
3.本技术为转基因提供材料，探究转基因新的途径。目前在欧美山杨杂种由根进行转基因工作没有相关报道及研究，下一步将进行相关的转基因工作。
[0106]
4.移栽成活率更高，因是由根再生的植株，在移栽时的原始根较粗且壮，木质化程度较高，根的抗性比常规组培苗的抗性更强，提高了成活率。因再生植株的根系为培养了两个月的根，而常规组培苗的根是一个月培养的根，因此在木质化和健壮程度上都比常规的好，所以移栽成活率更高。
[0107]
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种欧美山杨杂种组培苗离体根诱导再生植株的方法，其特征在于：使欧美山杨杂种组培苗的离体根在培养基中进行再生植株诱导培养，其中，所述培养基以减量ms培养基为基础，所述减量ms培养基是ms培养基中的无机盐成分减少50％～80％或者全部成分减少50％～80％，所述培养基中还含有琼脂、蔗糖、终浓度为0.05～0.3mg/l的6-ba、终浓度为0.1～0.6mg/l的naa、终浓度为0.05～0.3mg/l的iba。2.根据权利要求1所述的欧美山杨杂种组培苗离体根诱导再生植株的方法，其特征在于：所述减量ms培养基是ms培养基中的无机盐成分减少65％～80％或者全部成分减少65％～80％。3.根据权利要求2所述的欧美山杨杂种组培苗离体根诱导再生植株的方法，其特征在于：所述减量ms培养基是ms培养基中的无机盐成分减少70％～80％或者全部成分减少70％～80％。4.根据权利要求3所述的欧美山杨杂种组培苗离体根诱导再生植株的方法，其特征在于：所述减量ms培养基是ms培养基中的全部成分减少70％～80％。5.根据权利要求1所述的欧美山杨杂种组培苗离体根诱导再生植株的方法，其特征在于：所述6-ba的终浓度为0.05～0.2mg/l。6.根据权利要求5所述的欧美山杨杂种组培苗离体根诱导再生植株的方法，其特征在于：所述6-ba的终浓度为0.08～0.15mg/l。7.根据权利要求1所述的欧美山杨杂种组培苗离体根诱导再生植株的方法，其特征在于：所述naa的终浓度为0.1～0.4mg/l。8.根据权利要求7所述的欧美山杨杂种组培苗离体根诱导再生植株的方法，其特征在于：所述naa的终浓度为0.15～0.3mg/l。9.根据权利要求1所述的欧美山杨杂种组培苗离体根诱导再生植株的方法，其特征在于：所述琼脂的终浓度为6～7g/l，所述蔗糖的终浓度为25～35g/l。10.根据权利要求1所述的欧美山杨杂种组培苗离体根诱导再生植株的方法，其特征在于：将诱导培养获得的再生植株在根部进行剪切，其中带芽的根进行移栽，剩余的根作为离体根在所述培养基中进行再生植株诱导培养。

技术总结
本发明涉及一种欧美山杨杂种组培苗离体根诱导再生植株的方法，其特征在于：使欧美山杨杂种组培苗的离体根在培养基中进行再生植株诱导培养，其中，所述培养基以减量MS培养基为基础，所述减量MS培养基是MS培养基中的无机盐成分减少50％～80％或者全部成分减少50％～80％，所述培养基中还含有琼脂、蔗糖、终浓度为0.05～0.3mg/L的6-BA、终浓度为0.1～0.6mg/L的NAA、终浓度为0.05～0.3mg/L的IBA。本发明能够缩短再生植株的培养时间，简化培养流程，并且具有诱导率高、再生频率高、培育稳定等优势。势。


技术研发人员：辛全伟 张瑜轩 黄柳依 储逸文 朱奕陆
受保护的技术使用者：苏州北美国际高级中学
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/8/9