一种产黄原胶的工程菌株及其构建方法与流程

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产黄原胶的工程菌株及其构建方法。
技术背景
2.黄原胶（xanthan gum）是由野油菜黄单胞菌（xanthomonas campestris）发酵产生的一种酸性胞外杂多糖，其主链由β-1, 4糖苷键连接的d-葡萄糖构成，三糖侧链由d-甘露糖、d-葡萄糖醛酸和d-甘露糖连接而成并通过α-1, 3糖苷键连接到主链上的葡萄糖残基上，侧链末端甘露糖残基部分发生丙酮酸化，内部甘露糖残基大部分发生乙酰化，丙酮酸和乙酰基取代的水平因菌株及其代谢环境的差异而变化，在此结构基础之上黄原胶分子能够形成更为复杂的二级及三级结构。黄原胶分子独特的结构使其水溶液具有独特的剪切稀释性能、良好的增稠性、乳化稳定性及耐酸碱环境、耐温性，因而广泛应用于食品、石油开采、医药、农业、化工等众多行业，是一种具有重要商业价值的微生物多糖。
3.目前，黄原胶作为增稠剂、悬浮剂广泛应用于食品、石油、农业等行业。随着应用领域扩展，对黄原胶的性能提出了更高的要求，通过提高黄原胶产品的粘度即产品耐稀释性能可在减少黄原胶使用量的情况下保持相同粘度或达到更高粘度，降低使用成本，在石油、农业等对于应用成本敏感的行业具有更好的应用前景。
4.现有技术对产黄原胶的原始菌株进行了基因工程改良，获得产量和性能改善的基因工程菌。例如：cn103695453 a公开了一种编码巯基-二硫键氧化还原酶基因在黄原胶生产中的应用，用于构建及选育黄原胶高产的基因工程菌，该基因工程菌携带该基因的重组质粒pl0495,通过将pl0495导入野油菜黄单胞菌野油菜变种的野生型菌株8004获得。研究发现，xcc8004菌株基因组中编码巯基-二硫键氧化还原酶基因与黄原胶产量有关，该基因可用于构建，选育黄原胶高产的基因工程菌株。
[0005]“野油菜黄单胞菌重组克隆pixu9278对黄原胶生物合成的影响，南京农业大学学报”用pij3200作为载体，构建了包含1562个重组克隆野生型野油菜黄单胞菌的粘粒文库,在prk2013的帮助下,从e.coli中转移到xccnau-92中,绝大多数重组克隆对黄原胶合成无影响,但导致菌株生长缓慢。工程菌株xccnau-9278在28℃，120r/min条件下发酵72h，产量达37.50g/kg，发酵液粘度为14600mpa
·
s，与xccnau-92相比，产量增加7.14%，发酵液粘度增加7.35%。
[0006]“野油菜黄单胞菌中gumd基因的过表达对产黄原胶的影响，中国生化药物杂志”，在野油菜黄单胞菌58中过量表达产胶基因gumd，提高黄原胶发酵产量和质量。通过pcr扩增，将重组质粒pbbr-gumd转入原始菌xc58。结果工程菌与原始菌相比，黄原胶产量提高11.19%，黏度提高6.31%,重均分子质量提高20.21%，乙酰基含量提高77.07%，丙酮酸含量下降6.34%。结论改造后的菌株的黄原胶发酵产量和质量都较原始菌株有所提高。
[0007]
cn109706110a专利文献中，通过敲除黄单胞菌nk-01菌株的gumf和gumg基因两种
基因，并且过表达guml基因，得到基因工程改造的菌株，生产的黄原胶的丙酮酸含量和粘稠度提高。
[0008]
文献applied microbiology and biotechnology volume 42,pages187-191 (1994)，use of industrial medium components for xanthan production byxanthomonas campestris nrrl-b-1459，记载了nrrl-b-1459菌株，该菌株具备发酵生产黄原胶的能力，是研究黄原胶发酵的主要菌株之一。


技术实现要素：

[0009]
本发明要解决的技术问题提高黄原胶产品的性能。
[0010]
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种产黄原胶的工程菌株及其构建方法。
[0011]
本发明所述的产黄原胶的工程菌株是通过以下技术方案实现。
[0012]
一种产高分子量黄原胶的工程菌，gumf基因活性被失活。
[0013]
进一步地，所述工程菌是以野油菜黄单胞菌为出发菌株，基因敲除或敲低gumf基因，得到工程菌。
[0014]
更近一步地，所述工程菌按照如下方法构建：构建gumf基因敲除载体，转入到野油菜黄单胞菌，得到工程菌。
[0015]
优选地，所述工程菌按照如下方法构建：（1）从黄原胶菌株xanthomonas campestris nrrl b-1459（购自promega公司）基因组上扩增获得gumf基因的上游同源臂基因和下游同源臂基因，通过双酶切获得pk18mobsacb线性化载体，利用t5 dna连接酶将gumf的上下同源臂片段插入到质粒上的多克隆位点，构建获得乙酰基转移酶gumf的敲除质粒pk18mobsacb-δgumf；（2）将敲除质粒pk18mobsacb-δgumf转化至大肠杆菌dh-5α菌株（购自promega公司），获得转化子，得到重组菌株dh-5α/pk18mobsacb-δgumf；（3）将从重组菌株dh-5α/pk18mobsacb-δgumf中提取的质粒通过电击转化的方式转移至xanthomonas campestris nrrl b-1459，筛选出gumf基因敲除的工程菌株；（4）发酵获得低乙酰基高丙酮酸基黄原胶产品。
[0016]
更优选地，所述gumf基因的序列如seq id no.1所示。
[0017]
更优选地，所述上游同源臂基因的扩增引物为：seq id no.2和3，下游同源臂基因的扩增引物为：seq id no.4和5另一方面，本发明还涉及一种基因工程重组载体，如图1所示。
[0018]
另一方面，本发明还涉及一种基因工程重组载体，所述基因工程重组载体的序列如seq id no.6所示。
[0019]
另一方面，本发明还涉及上述工程菌在发酵生产黄原胶中的应用。
[0020]
与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：本发明专利与现有的技术相比，通过菌种基因工程改造，本发明构建菌种xanthomonas campestris δgumf-27合成的黄原胶具有乙酰基含量低、分子量高、丙酮酸含量高、发酵产率高、低含量溶液粘度高等性质，实现了耐稀释高分子量新型黄原胶的高效发酵生产，为黄原胶产品应用市场的扩大奠定良好的技术基础，产品市场应用前景良好。
附图说明
[0021]
图1：pk18mobsacb-δgumf载体图谱。
具体实施方式
[0022]
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0023]
为了使本领域技术人员能够更加清楚了解本发明公开的技术方案，以下结合具体的实施例详细说明本发明公开的技术方案。
[0024]
实施例1
[0025]
产高分子量黄原胶生产菌株工程菌株xanthomonas campestris δgumf-27的构建：（1）从合成普通黄原胶的野油菜黄单胞菌xanthomonas campestris nrrl b-1459基因组上扩增获得gumf（seq id no.1）的上下游同源臂基因，上游同源臂基因的扩增引物为：seq id no.2和3，下游同源臂基因的扩增引物为：seq id no.4和5；通过双酶切获得pk18mobsacb线性化载体，利用t5 dna连接酶将gumf的上下同源臂片段插入到质粒上的多克隆位点，构建获得乙酰基转移酶gumf的敲除质粒pk18mobsacb-δgumf（seq id no.6，注：序列表中的小写字母为δgumf序列），载体图谱见图1。
[0026]
（2）将敲除质粒pk18mobsacb-δgumf转化至dh-5α菌株，获得转化子，得到重组菌株dh-5α/pk18mobsacb-δgumf。
[0027]
（3）将从重组菌株dh-5α/pk18mobsacb-δgumf中提取的质粒通过电击转化的方式转移至xanthomonas campestris nrrl b-1459，卡那霉素（kanamycin）平板筛选单交换菌株，蔗糖致死平板筛选已敲除gumf的双交换菌命名为xanthomonas campestris δgumf-27。
[0028]
（4）利用菌株xanthomonas campestris δgumf-27发酵获得低乙酰基高丙酮酸基黄原胶产品。
[0029]
实施例2
[0030]
高分子量黄原胶发酵生产：（1）菌株活化：将处于-80
°
c保藏的xanthomonas campestris δgumf-27菌种无菌接种于斜面lb培养基上，32
°
c静置培养1天，获得活化菌种，用于发酵生产种子液制备。
[0031]
（2）高分子量黄原胶发酵生产种子液制备：挑取经斜面活化培养的生产菌种（xanthomonas campestris δgumf-27）2-3环，接种于种子培养液里，32
°
c培养20h，获得成熟种子液。
[0032]
所述种子培养液由如下的组分组成（单位g/100ml）：玉米淀粉2.0；大豆蛋白胨0.5；nacl 0.2；硫酸锰1ppm（终浓度）；聚醚消泡剂0.02；其他为软化水；ph 7.0-7.2。
[0033]
（3）高分子量黄原胶发酵生产：将培养成熟的xanthomonas campestris δgumf-27菌株种子液按照10%的接种量接种到经灭菌的发酵培养液中，调整发酵培养液的ph，进行通气搅拌发酵培养，通过分阶段
控制发酵条件，生产获得高分子量黄原胶产物。
[0034]
所述发酵培养液有如下的组分组成（单位g/100ml）：玉米淀粉4.5；大豆蛋白胨0.2；nacl 0.2；硫酸锰、硫酸锌各2ppm（终浓度）；聚醚消泡剂0.02；其他为软化水；ph 7.0-7.2。
[0035]
所述发酵控制条件如下：0-18h：温度32
°
c、ph自然、通风量1.2v/v.m、罐压0.08mpa、溶解氧30%；18h-放罐（60h）：温度28
°
c、每隔6h流加碱液调控发酵液ph至6.8、通风量1.8v/v.m、罐压0.08mpa、溶解氧10%。
[0036]
获得高分子量黄原胶。
[0037]
对比例1高分子量黄原胶发酵生产：（1）菌株活化：将处于-80
°
c保藏的xanthomonas campestris nrrl b-1459菌种无菌接种于斜面lb培养基上，32
°
c静置培养1天，获得活化菌种，用于发酵生产种子液制备。
[0038]
（2）高分子量黄原胶发酵生产种子液制备：挑取经斜面活化培养的生产菌种（xanthomonas campestris nrrl b-1459）2-3环，接种于种子培养液里，32
°
c培养20h，获得成熟种子液。
[0039]
所述种子培养液由如下的组分组成（单位g/100ml）：玉米淀粉2.0；大豆蛋白胨0.5；nacl 0.2；硫酸锰1ppm（终浓度）；聚醚消泡剂0.02；其他为软化水；ph 7.0-7.2。
[0040]
（3）高分子量黄原胶发酵生产：将培养成熟的xanthomonas campestris nrrl b-1459菌株种子液按照10%的接种量接种到经灭菌的发酵培养液中，调整发酵培养液的ph，进行通气搅拌发酵培养，通过分阶段控制发酵条件，生产获得黄原胶产物。
[0041]
所述发酵培养液有如下的组分组成（单位g/100ml）：玉米淀粉4.5；大豆蛋白胨0.2；nacl 0.2；硫酸锰、硫酸锌各2ppm（终浓度）；聚醚消泡剂0.02；其他为软化水；ph 7.0-7.2。
[0042]
所述发酵控制条件如下：0-18h：温度32
°
c、ph自然、通风量1.2v/v.m、罐压0.08mpa、溶解氧30%；18h-放罐（60h）：温度28
°
c、每隔6h流加碱液调控发酵液ph至6.8、通风量1.8v/v.m、罐压0.08mpa、溶解氧10%。
[0043]
实施例3
[0044]
应用上述方法制备的高分子量黄原胶的性能指标检测结果如下：（1）多糖产率测定根据文献中一般采用的方法如下：a. 所用仪器：恒温干燥箱、分析天平（0.001g）。
[0045]
b. 测定方法：准确量取一定体积的发酵液，缓慢加入90-95%的乙醇沉淀多糖，过滤后再用90-95%的乙醇洗涤一遍，滤干后置于105
°
c恒温干燥箱干燥至恒重，降温后称重。
[0046]
多糖产率=样品干重/发酵液体积
×
100%。
[0047]
（2）多糖分子量测定
a. 所用仪器：凝胶渗透色谱仪（gpc）。
[0048]
b. 测定方法：蒸馏水配制0.1%（w/v）浓度的黄原胶溶液，并以10 000g离心30min，采用0.22μm水系膜过滤上清液制备待测样品。使用gpc系统测定多糖分子量，配有差示折射检测器和多角度激光散射检测器。nano3溶液（0.1%）作为流动相，流速1ml/min，柱温30
°
c。
[0049]
（3）多糖乙酰基与丙酮酸含量测定a. 所用仪器：高效液相色谱仪（hplc）。
[0050]
b. 测定方法：参照cheetham和punruckvong的方法测定不同黄原胶样品的乙酰基和丙酮基含量。h. c n w, acharaporn p. an hplc method for the determination of acetyl and pyruvyl groups in polysaccharides[j]. carbohydrate polymers, 1985,5(6)。
[0051]
（4）多糖产物粘度测定a. 所用仪器：brookfield dv
‑ⅱ
型旋转粘度计，62#转子，60r/min，20
°
c测定。
[0052]
b. 测定方法：准确称取采用本发明方法制备的黄原胶产品或对比黄原胶产品0.6g溶于300.0ml蒸馏水中，1000r/min搅拌至溶解，静置30min，测定其粘度。
[0053]
c. 测定结果见表1：表1 发酵产黄原胶性能比较
[0054]
其中，对比例1是使用原始菌株进行相同工艺发酵，与实施例2的区别在于发酵菌株的不同，具备可比较性；对比例2为市售食品级黄原胶产品。由上表1测定结果对比知，本发明构建菌种xanthomonas campestris δgumf-27合成的黄原胶具有乙酰基含量低、分子量高、丙酮酸含量高、发酵产率高、低含量溶液粘度高，实现了耐稀释高分子量新型黄原胶的高效发酵生产。
[0055]
实施例4
[0056]
甜菜碱对xanthomonas campestris δgumf-27的产胶能力测试。
[0057]
发酵工艺同实施例2，在实施例2中的发酵培养液中添加不同浓度的甜菜碱，考察甜菜碱对产黄原胶性能的影响。发酵菌株采用xanthomonas campestris nrrl b-1459和xanthomonas campestris δgumf-27，具体见表2。
[0058]
表2 不同浓度的甜菜碱对黄原胶产率（%）的影响
[0059]
如上表2所示，甜菜碱能够提高xanthomonas campestris δgumf-27的发酵黄原胶的产量，但对原始菌株的产胶性能没有明显影响，可能原因是，基因敲除gumf的xanthomonas campestris nrrl b-1459的胞内信号通路发生了改变，使得甜菜碱能够刺激δgumf-27菌株的产胶性能。发明人还尝试验证甜菜碱对基因敲除gumf的其他xanthomonas campestris 菌（cgmcc no.15155）的产胶能力的影响，出乎意料的是，对其他工程菌并没有明显的影响。
[0060]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本案作了详尽的说明，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种产高分子量黄原胶的工程菌，其特征在于，所述工程菌是以野油菜黄单胞菌为出发菌株，敲除或敲低gumf基因，得到工程菌。2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌按照如下方法构建：构建gumf基因敲除载体，转入到野油菜黄单胞菌，得到工程菌。3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌按照如下方法构建：（1）从野油菜黄单胞菌xanthomonas campestris nrrl b-1459基因组上扩增获得gumf基因的上游同源臂基因和下游同源臂基因，通过双酶切获得pk18mobsacb线性化载体，利用t5 dna连接酶将gumf的上游同源臂基因和下游同源臂基因片段插入到载体上的多克隆位点，构建获得gumf基因的敲除质粒pk18mobsacb-δgumf；（2）将敲除质粒pk18mobsacb-δgumf转化至dh-5α菌株，获得转化子，得到重组菌株dh-5α/pk18mobsacb-δgumf；（3）将从重组菌株dh-5α/pk18mobsacb-δgumf中提取的质粒转移至xanthomonas campestris nrrl b-1459，筛选出gumf基因敲除的工程菌株；（4）利用上述gumf基因敲除的工程菌株发酵获得低乙酰基高丙酮酸基黄原胶产品。4. 根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述gumf基因的序列如seq id no.1所示。5. 根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述上游同源臂基因的扩增引物为：seq id no.2和3，下游同源臂基因的扩增引物为：seq id no.4和5。6. 一种基因工程重组载体，其特征在于，所述基因工程重组载体的序列如seq id no.6所示。7.含有权利要求6所述的基因工程重组载体的工程菌。8.权利要求1-5、7任其一所述的工程菌在发酵生产黄原胶中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：将所述工程菌的种子液接种到经灭菌的发酵培养液中进行发酵培养，获得高分子量黄原胶产物；所述发酵培养液有如下的组分组成：玉米淀粉45g/l、大豆蛋白胨2g/l、nacl 2g/l、硫酸锰2ppm、硫酸锌2ppm、聚醚消泡剂0.2g/l，甜菜碱0-50g/l，其他为软化水；ph 7.0-7.2。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述甜菜碱的添加量为10-50g/l。

技术总结
本发明属于基因工程技术领域，公开了一种产黄原胶的工程菌株及其构建方法，所述工程菌是以野油菜黄单胞菌为出发菌株，敲除或敲低gumF基因，得到工程菌。与现有的技术相比，本发明构建菌种合成的黄原胶具有乙酰基含量低、分子量高、丙酮酸含量高、发酵产率高等特性。发酵产率高等特性。发酵产率高等特性。


技术研发人员：董学前 赵兰坤 陈晓妮 李树标 张永刚 伏广好 徐淑科 许志颖
受保护的技术使用者：山东省食品发酵工业研究设计院
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/8/9