一种花生风味相关的分子标记及其应用

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种花生风味相关的分子标记及其应用。


背景技术：

2.花生是一种重要的油料作物，具有独特、宜人的风味和丰富的营养。因此，改善花生风味是花生工业的长期目标。
3.众所周知，花生风味是复杂的数量性状，且受到遗传、环境、储存和加工条件的影响。传统评价花生风味的方法主要是靠测试专家来品尝，该方法需要大量的人员且主观影响因素较大，无法准确、客观反映花生风味的评价结果。
4.全基因组关联分析(genome-wide association study，gwas)是一种基于连锁不平衡(linkage disequilibrium，ld)原理的强大工具，可用于检测与复杂农艺性状相关的qtl位点。
5.但目前尚无利用gwas进行花生风味相关性状研究的技术方案。


技术实现要素：

6.针对上述技术问题，本发明提供了一种花生风味相关的分子标记及其应用，其可以通过位点ax-147221247以及三个影响花生风味的主要性状：总糖、蔗糖和总生育酚来快速判断花生风味是否优良。
7.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
8.提供了一种花生风味相关的分子标记，所述分子标记为snp位点ax-147221247，位于花生a04号染色体上，且位置在120249731bp处；所述snp位点ax-147221247前后各100bp的序列如seq id no.1所示。
9.提供了一种用于检测上述分子标记的kasp引物对组。
10.优选的，所述kasp引物对组包括正向引物p1以及反向引物p2，其中，所述正向引物p1的序列为tgcatgcatgtgtaagtgtcc，所述反向引物p2的序列为tgcatgcatgtgtaagtgtcc。
11.提供了一种用于花生风味鉴定的试剂盒，其包括上述kasp引物对组。
12.提供了一种花生风味的鉴定方法，其包括如下步骤：
13.s1、提取待鉴定花生材料的dna样本；
14.s2、合成上述引物对组，且利用上述kasp引物对组、以步骤s1中获取的dna样本为模板进行pcr扩增；
15.s3、对经步骤s2获得的pcr扩增产物进行检测，若分子标记ax-147221247的基因型为c/c时，则认为待鉴定花生材料风味良好，若分子标记ax-147221247的基因型为t/c或t/t时，则认为待鉴定花生材料风味较差。
16.优选的，在进行pcr扩增时，所述pcr扩增的反应体系为1μldna、5μlkasp mix(lgc genomics,hoddeston,uk)、0.08μlμgcl2、2.52μl ddh2o和1.4μl混合引物，且所述混合引物中，正向引物p1以及反向引物p2的体积比为1:1。
17.优选的，在进行pcr扩增时，pcr反应程序为：94℃15min；94℃20s；61-55℃60s，10个循环，且每循环降低0.6℃；94℃20s，55℃60s，35个循环。
18.提供一种上述kasp引物对组和/或上述试剂盒和/或上述鉴定方法在花生的风味鉴定/育种/品系管理中应用。
19.本发明至少具备以下有益效果：
20.本发明通过gwas和降维分析(pca)筛选获得三个影响花生风味的主要性状：总糖、蔗糖和总生育酚，由此可通过三者的含量来快速判断花生风味是否优良。另外，本发明鉴定得出1个与花生风味相关的显著位点ax-147221247，由此可以通过该分子标记在早期进行花生风味评价，用于辅助选择育种，有助于获得风味更佳的花生品系。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1a为本发明中102份美国微核心花生种质群体结构的structure分析结果；
23.图1b为本发明中通过分析推断出k＝2时，102份美国微核心花生种质的群体结构，其中单个垂直线代表每个种质，每种颜色代表一个群体；
24.图1c为本发明中102份美国微核心花生种质的连锁不平衡图；
25.图2为本发明中筛选的总糖、蔗糖和总生育酚3个性状指标的正态分布图；
26.图3为本发明中花生全基因组范围内snp的分布结果；
27.图4a为本发明中通过gwas分析得到的曼哈顿图，其中线条a代表显著线，-log(p)》4.67；线条b代表建议线，-log(p)》3.37；
28.图4b为本发明中通过gwas分析得到的qq图；
29.图5为本发明中花生的单倍型分析图；
30.图6a为本发明中基因型为c/c的测序结果；
31.图6b为本发明中基因型为t/c的测序结果。
具体实施方式
32.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
33.实施例1：
34.1.田间试验设计
35.如表1所示，选取102份美国微核心花生种质资源，分别于2013年和2014年种植于美国乔治亚州。田间种植采用完全随机区组设计，两次重复。每行10个单株，行长1.5m，行距80cm，株距17cm。田间管理与常规大田管理一致。进一步的，图1a-1c示出了上述102份美国微核心花生种质的群体结构。
36.表1 102份美国微核心花生种质资源
37.38.39.[0040][0041]
a)群体结构的structure分析；b)通过分析推断出的k＝2时的群体结构。单个垂直线代表每个品种，每种颜色代表一个群体；c)连锁不平衡图
[0042]
2.风味相关性状测定
[0043]
收获上述种植的花生种子，经过鉴定和检测后，共获得33个风味相关性状指标(如表2所示)，包括：种子含水量、油分含量、α-生育酚、β-生育酚、gamma-生育酚、delta-生育酚、总生育酚、肌酸、葡萄糖、果糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖、总糖、烤花生、甜芳香、深度烤、豆腥味、木质壳皮、纸板气味、泥土霉味、泥泞、塑料-化学、金属、果味发酵、香料、甜味、酸味、咸味、苦味、涩味、焦味和灰分。需要说明的是，表2所示出的性状指标的鉴定、检测均为现有技术，不再赘述。
[0044]
表2 33个花生风味相关性状指标
[0045]
[0046][0047]
其中，drywt为干重，wetwt为湿重，fwt为鲜重，na表示无法获取广义遗传率。
[0048]
3.表型数据处理
[0049]
使用spss statistics version 24(ibm spss,ibm corp,armonk,ny,usa)对表型数据进行统计分析。采用spss的因子降维方法进行主成分分析。方差成分分析采用限制最大似然(reml)方法，单变量方差分析采用标准glm方法。根据估计的方差分量h2＝σ2g/(σ2g+σ2g
×
e/r+σ2error/rn)来确定2个环境实验中各性状(感官分析除外)的广义遗传率，其中σ2g、σ2g
×
e和σ2error分别表示基因型方差、102个基因型与环境方差的相互作用以及误差(残差)方差分量。r是环境试验的次数，n是每次环境试验的重复次数。由此获得表2所示的各项数据。
[0050]
4.降维分析(pca)
[0051]
对上述33个性状指标数据进行皮尔逊相关性分析和pca分析(主成分分析)。皮尔逊相关性分析结果表明，咸度与其他性状的相关性不显著。
[0052]
第一次pca分析结果显示，每个pc(principle components)只能解释很小的方差
成分，如pc1解释总方差的18.11％，pc2解释总方差的15.32％，表明所有pc对总方差的贡献没有显著差异，因此根据第一次pca的结果从10个pc中选择一个或两个性状进行第二次pca分析。
[0053]
第二次pca分析包括了13个性状，产生5个pc，解释了总方差的68.89％。考虑到表型数据的正态分布和组成百分比，最终选择总糖、蔗糖和总生育酚3个性状指标作为花生风味影响的主要性状，用于进行后续的gwas分析，同时，图2示出了总糖、蔗糖和总生育酚三个性状指标的正态分布图，其中“2013”、“2014”分别表示相关数据分别基于2013年度、2014年度种植的花生种质资源获得，以下“2013”、“2014”含义均与此相同。
[0054]
5.基因型分析
[0055]
采用改良的ctab法提取102份美国微核心花生种质幼嫩叶片基因组dna，并利用来自geneseek的snp芯片(affymetrix，lincoln,nebraska,usa)进行全基因组内的snp(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)分析。其中，call rate《0.95,maf《0.05则视为低质量snp，可被过滤掉。最终获得12526个高质量snps(如图3所示)用于后续的gwas分析。
[0056]
6.全基因组关联分析
[0057]
利用structure v2.3.4软件，基于多态性的snp位点对102份美国微核心花生种质进行群体遗传结构分析。
[0058]
分析过程中，使用以下参数运行10次：k值从1到10，length of burn-in period设置为10000，mcmc(markov chain monte carlo)设置为100000。
[0059]
由此利用structure v2.3.4软件获得q矩阵，再利用tassel 5.0软件进行主成分分析和构建系统发育进化树。在进行全基因组关联分析时，利用tassel 5.0软件的一般线性模型(glm)进行snps与花生风味相关性状之间的关联分析。
[0060]
在对ld分析后，总共保留2363个独立的snps和ld块。因此，全基因组显著性阈值为0.05/2363＝2.12e-5，-log10(p值)＝4.67，全基因组建议性阈值为1/2363＝4.23e-4，-log10(p值)＝3.37。
[0061]
同时利用r软件中的qqman软件包绘制如图4a所示的曼哈顿图和如图4b所示的qq图，进行gwas结果可视化。
[0062]
以及利用poplddecay(https://github.com/bgi-shenzhen/poplddecay)估算两个snps位点之间的ld参数(r2)。
[0063]
7.风味相关qtl位点单倍型分析
[0064]
通过gwas分析，可获得花生风味性状相关的显著snp位点(如表3所示)。进一步的，通过这些位点的单倍型分析，如图5所示，发现位点ax-147221247(位于a04染色体，位置120249731bp)基因型为c/c时，花生风味较好，基因型为t/c或t/t时，花生风味较差。
[0065]
表3花生风味性状相关的显著snp位点
[0066][0067][0068]
其中，％表示表型解释率。
[0069]
8.关联位点验证
[0070]
将ax-147221247位点前后各100bp的序列(如seq id no.1所示)作为目的基因，利
用kasp(竞争性等位基因特异性pcr)技术，对花生材料进行扩增、测序、检测，以完成花生风味相关性状关联位点的验证和鉴定，其具体包括如下步骤：
[0071]
s1、提取待鉴定花生材料的dna样本；
[0072]
s2、利用primer5.0软件设计并合成kasp引物对组，且利用所述kasp引物对组、以步骤s1中获取的dna样本为模板进行pcr扩增；所述kasp引物对组包括正向引物p1以及反向引物p2，其中，所述正向引物p1的序列为tgcatgcatgtgtaagtgtcc，所述反向引物p2的序列为tgcatgcatgtgtaagtgtcc；
[0073]
s3、对经步骤s2获得的pcr扩增产物进行检测，若分子标记ax-147221247的基因型为c/c(如图6a所示)时，则认为待鉴定花生材料风味良好，若分子标记ax-147221247的基因型为t/c(如图6b所示)或t/t时，则认为待鉴定花生材料风味较差。
[0074]
进一步的，在进行pcr扩增时，所述pcr扩增的反应体系为1μl dna、5μl kaspmix(lgc genomics,hoddeston,uk)、0.08μlμgcl2、2.52μl ddh2o和1.4μl混合引物，且所述混合引物中，正向引物p1以及反向引物p2的体积比为1:1。
[0075]
同时，在进行pcr扩增时，pcr反应程序为：94℃15min；94℃20s；61-55℃60s，10个循环，且每循环降低0.6℃；94℃20s，55℃60s，35个循环。
[0076]
实施例2：
[0077]
本实施例还提供了一种用于花生风味鉴定的试剂盒，其包括实施例1中所述的kasp引物对组。
[0078]
实施例3：
[0079]
本实施例还提供了上述kasp引物对组和/或上述试剂盒和/或上述鉴定方法在花生的风味鉴定/育种/品系管理中应用。
[0080]
综上所述，本发明通过对102份美国微核心花生种质资源进行分析，以获得风味相关的33个性状指标，包括：种子含水量，油分含量，生育酚(α-生育酚，β-生育酚，gamma-生育酚，delta-生育酚和总生育酚)，糖(肌酸，葡萄糖，果糖，蔗糖，棉子糖，水苏糖，总糖)，以及描述性品质性状(烤花生，甜芳香，深度烤，豆腥味，木质壳皮，纸板气味，泥土霉味，泥泞，塑料-化学，金属，果味发酵，香料，甜味，酸味，咸味，苦味，涩味，焦味和灰分，进一步进行gwas和降维分析(pca)来筛选影响风味的主要性状。
[0081]
从中发现总糖、蔗糖和总生育酚3个性状直接决定花生的口味。因此，可以通过生理方法测定花生中总糖、蔗糖和总生育酚的含量来快速判断花生风味是否优良，即，三者含量越高，则口味越好，以实现花生风味的快速、直接鉴定。另外，本发明通过snp分子标记与这3个性状结合进行关联分析，鉴定得出1个显著位点ax-147221247，其位于a4染色体上，位置120249731bp处，基因型为c/c时，总糖含量高，口味好，基因型为t/c或t/t时，风味较差，由此可以通过该分子标记在早期进行花生风味评价，用于辅助选择育种，有助于获得风味更佳的花生品系。
[0082]
上述实施例1-3中的技术特征可进行任意组合，且组合而成的技术方案均属于本技术的保护范围。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求
书及其等同物界定。

技术特征：
1.一种花生风味相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为snp位点ax-147221247，位于花生a04号染色体上，且位置在120249731bp处；所述snp位点ax-147221247前后各100bp的序列如seq id no.1所示。2.一种用于检测上述分子标记的kasp引物对组。3.如权利要求2所述的kasp引物对组，其特征在于，所述kasp引物对组包括正向引物p1以及反向引物p2，其中，所述正向引物p1的序列为tgcatgcatgtgtaagtgtcc，所述反向引物p2的序列为tgcatgcatgtgtaagtgtcc。4.一种用于花生风味鉴定的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的kasp引物对组。5.一种花生风味的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、提取待鉴定花生材料的dna样本；s2、合成权利要求2或3所述的kasp引物对组，且利用所述kasp引物对组、以步骤s1中获取的dna样本为模板进行pcr扩增；s3、对经步骤s2获得的pcr扩增产物进行检测。6.如权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，步骤s3中，对pcr扩增产物进行检测后，若分子标记ax-147221247的基因型为c/c时，则认为待鉴定花生材料风味良好，若分子标记ax-147221247的基因型为t/c或t/t时，则认为待鉴定花生材料风味较差。7.如权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，在进行pcr扩增时，所述pcr扩增的反应体系为1μldna、5μlkaspmix、0.08μlμgcl2、2.52μlddh2o和1.4μl混合引物。8.如权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，所述混合引物中，正向引物p1以及反向引物p2的体积比为1:1。9.如权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，在进行pcr扩增时，pcr反应程序为：94℃15min；94℃20s；61-55℃60s，10个循环，且每循环降低0.6℃；94℃20s，55℃60s，35个循环。10.一种权利要求2或3所述的kasp引物对组和/或权利要求4所述的试剂盒和/或权利要求5-9任一项所述鉴定方法在花生的风味鉴定/育种/品系管理中应用。

技术总结
本发明公开了一种花生风味相关的分子标记及其应用，所述分子标记为SNP位点AX-147221247，位于花生A04号染色体上，且位置在120249731bp处；所述SNP位点AX-147221247前后各100bp的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明可以通过位点AX-147221247以及三个影响花生风味的主要性状：总糖、蔗糖和总生育酚来快速判断花生风味是否优良。花生风味是否优良。花生风味是否优良。


技术研发人员：张慧 乐运来 陈勇
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/8/9