一种PolyA检测方法与流程

一种polya检测方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种polya检测方法。


背景技术：

2.细胞信使rna（mrna）在真核生物细胞中广泛存在，负责传递遗传信息，指导蛋白质合成。mrna是一种近来备受关注的基因治疗手段，在肿瘤学、传染病学、蛋白疗法等领域有广泛前景。mrna的polya尾是体外合成mrna（ivt mrna）的重要结构元件，通常由两种途径加入：一种由模板编码polyt转录形成；另一种由多聚腺苷酸聚合酶在转录mrna 3端将腺苷酸催化聚合形成。由于mrna polya尾对ivt mrna的翻译效率及胞内稳定性起着至关重要的作用，因此polya尾长及占比是ivt mrna的关键工艺质量参数，对mrna polya尾长及占比的有效及准确的表征是非常必要且重要的。
3.当前polya尾长的检测方法主要为：1）酶切法将polya尾通过一定酶切前处理从mrna中切除并分离后进行液相色谱－质谱联用分析，该方法一方面对polya的结构及内部序列有一定限制，例如利用rnase t1酶对mrna进行酶切处理，特异性切割相邻核苷酸的 3'－鸟苷残基和 5'-oh 残基之间的磷酸二酯键，限制了polya序列含鸟苷残基的ivt mrna的检测，另一方面液质联用仪器成本较高。2）多聚腺苷酸聚合酶加尾过程中利用atp的消耗量与mrna加尾长度的关系监测mrna polya尾长度，该法仅适用转录后加尾的工艺过程，对模板编码polyt转录polya尾不适用。3）基于epat法或lm-pat法对polya进行检测时，可获得较为准确的polya长度，但其对不同polya长度及占比的分析相关性较差，不能有效定义ivt mrna的理论polya长度的占比。
4.由此可见，提供一种能够准确检测不同mrna polya尾长及占比的方法，且具有成本低、方便操作、结果安全可靠的优点，成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

5.本技术实施例通过提供一种polya检测方法，解决了现有技术中操作过程繁复、准确性不高等缺陷，提供了准确检测不同mrna polya尾长及占比的方法，能够适用模板编码polyt转录polya尾长检测，有效定义ivt mrna的理论polya长度的占比。
6.本技术实施例提供了一种polya检测方法，包括以下步骤：步骤1：在polya聚合酶反应体系中对待测靶mrna进行加尾反应；步骤2：将加尾后的mrna加入反转录反应体系，以特异性反转引物进行反转录形成cdna；步骤3：于待测polya上游位置设计的特异性正向引物与反向引物，对反转录形成的cdna进行聚合酶链式反应得到聚合酶链式反应产物；步骤4：对所述聚合酶链式反应产物进行分离及大小分析，得到polya尾长。
7.优选地，所述步骤1中，以gtp及itp的混合溶液作为底物对待测靶mrna进行加尾反应，使待测靶mrna在3端加入g/i尾。
8.本发明通过以gtp及itp的混合溶液替代atp作为底物进行加尾反应，可在polya尾后加入一定长度的g/i尾，有效稳定polya尾。解决了现有技术中对各长度polya不能等量检出的问题，实现目的polya长度占比的精确检测。
9.进一步优选地，所述步骤1中，取1μg mrna加入所述polya聚合酶反应体系，所述polya聚合酶反应体系包括，在1
×
缓冲液下，使用5u polya聚合酶，gtp溶液与itp溶液各为10pmol，于37℃反应60min，得到加尾后mrna。
10.优选地，所述特异性反转引物序列如seq id no .1所示。
11.进一步优选地，取5μl加尾后mrna加入反转录反应体系，所述反转录反应体系包括，在1
×
缓冲液下，取1μl反转录酶、50pmol特异性反转引物于42℃反应60min后于90℃酶失活反应10min，得到反转录产物cdna。
12.优选地，所述步骤3中，所述正向引物序列如seq id no .2所示，所述反向引物序列如seq id no .3所示。
13.本发明所确定的特异性反转引物序列设计为特异性引物序列且含有可与g/i尾配对进行反转录的polyc及可与polya尾配对的polyt，可实现polya长度的精确定量。正向引物序列为靶mrna特异性序列，反向引物序列以特异性反转引物序列得出，可从理论上判定聚合酶链式反应产物大小，从而精确判断mrna polya尾长。
14.进一步优选地，所述步骤3中，取5μl反转录产物cdna加入聚合酶链式反应体系中，所述聚合酶链式反应体系包括，在1
×
缓冲液下，加入3.75u聚合酶，取10pmol正向引物和10pmol反向引物，扩增条件为94℃初始变性2分钟，94℃持续10s，65℃持续10s，72℃持续10s，共做30次循环，最后保持在12℃。
15.优选地，所述步骤4中，利用琼脂糖凝胶电泳及dna分子标准量对所述聚合酶链式反应产物进行分离及大小分析，得到所述polya尾长。
16.优选地，所述待测靶mrna为包含不同模板编码polya长度的mrna。本发明的方法能够实现不同模板编码polya长度的检测。
17.优选地，还包括步骤5：对凝胶成像分析时，利用灰度值分析方法分析所述凝胶成像电泳图条带，得到各polya长度占比。
18.通过选择利用琼脂糖凝胶电泳方法和灰度值分析方法来检测不同polya尾长和各polya的占比，检测的数值结果准确易得，便于操作且成本低。
19.本技术实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：本技术提供的检测方法，可针对不同mrna序列进行上游引物序列设计并检测分析，可检测多种poly长度及占比值，成本低，易操作，可如实反映ivt mrna的目的polya长度占比。
附图说明
20.图1为本技术实施例中polya检测方法原理图；图2为本技术实施例3中3种不同polya长度mrna检测电泳图；图3为本技术实施例4中不同polya长度占比mrna检测电泳图；图4为本技术实施例4中不同polya长度占比mrna检测趋势图。
具体实施方式
21.为了更好地理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细地说明。
实施例1
22.一种polya检测方法，如图1所示原理图，包括以下步骤：步骤1：在polya聚合酶反应体系中以gtp及itp的混合溶液作为底物对待测靶mrna进行加尾反应，使待测靶mrna在3’端加入g/i尾；步骤2：将加尾后的mrna加入反转录反应体系，以特异性反转引物进行反转录形成cdna，所述特异性反转引物序列如seq id no .1所示。
23.步骤3：于待测polya上游位置设计的特异性正向引物与反向引物对反转录形成的cdna进行聚合酶链式反应得到聚合酶链式反应产物，所述正向引物序列如seq id no .2所示，所述反向引物序列如seq id no .3所示；步骤4：利用琼脂糖凝胶电泳及dna分子标准量对所述聚合酶链式反应产物进行分离及大小分析，得到所述polya尾长；步骤5：所述待测靶mrna为包含不同模板编码polya长度的mrna，对凝胶成像分析时，利用灰度值分析方法分析所述凝胶成像电泳图条带，得到各polya长度占比值。
24.本技术提供的检测方法，可针对不同mrna序列进行上游引物序列设计并检测分析，可检测多种polya长度及占比值，成本低，易操作，可如实反映ivt mrna的polya长度占比。
实施例2
25.步骤1：加尾反应：取1μg mrna加入所述polya聚合酶反应体系，所述polya聚合酶反应体系包括，在1
×
缓冲液下，使用5u polya聚合酶，gtp溶液与itp溶液各为10pmol，于37℃反应60min，得到加尾后mrna。
26.步骤2：反转录反应：取5μl加尾后mrna加入反转录反应体系，所述反转录反应体系包括，在1
×
缓冲液下，取1μl反转录酶、50pmol特异性反转引物于42℃反应60min后于90℃酶失活反应10min，得到反转录产物cdna。
27.步骤3：聚合酶链式反应（pcr）：取5μl反转录产物cdna加入聚合酶链式反应体系中，在1
×
缓冲液下，加入3.75u聚合酶，取10pmol正向引物和10pmol反向引物， pcr扩增条件为94℃初始变性2分钟，94℃持续10s，65℃持续10s，72℃持续10s，共做30次循环，最后保持在12℃。本实施例中mrna polya正向引物序列如seq id no .2所示为gsp-f（tcattgctgcagctcgct），反向引物序列如seq id no .3所示为polya r（acacgacgctcttccgatct）步骤4：琼脂糖凝胶电泳：取5μl pcr产物与1μl 6
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dna 上样缓冲液混合均匀后上样于2.5%的琼脂糖凝胶中，以反式标准分子量dna作为分子量对照，在1
×
缓冲液下，120v电泳30min，后于凝胶成像
系统（北京通宝达）中进行拍照及分析，基于凝胶成像结果，得到polya长度值。
28.步骤5：灰度值分析：在凝胶成像分析时，进行条带灰度值分析并由分析软件给出各个条带灰度值占比，根据条带大小，得出目的polya长度的占比。本发明实施例2限定的上述参数特征，为本发明最优选方案，在实施例2限定方法步骤下，本技术检测的不同polya尾长和占比准确性更高，检测误差最低仅有0.4%。
29.实施例3：不同polya长度mrna进行polya检测的准确性验证试验：1、实验目的：取3种不同模板编码polya长度的mrna（polya60，polya90，polya120）进行polya检测，验证本实施例polya检测方法，检测polya尾长和占比的准确率。
30.2、实验材料：mrna，本公司通过体外转录不同编码polya尾质粒制备得到。
31.polya聚合酶：e.coli poly(a) polymerase（neb m0276s），购于neb公司。
32.gtp溶液（thermo w813b004），购于thermo公司。
33.itp溶液（trilink n-1020-1），购于trilink公司。
34.反转录酶：primescript
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rt reagent kit（takara rr037a），购于takara公司。
35.dna聚合酶：champagne taq dna polymerase（vazyme p122-d1），购于vazyme公司。
36.dna缓冲液：dna loading buffer（transgen gh101-01），购于transgen公司。
37.3、实验步骤：步骤1：加尾反应：1μg mrna加入polya聚合酶e. coli poly(a) polymerase（neb m0276s）反应体系中，在1
×
缓冲液下，polya聚合酶e. coli poly(a) polymerase使用量5u，gtp溶液与itp溶液各为10pmol，于37℃反应60min。
38.步骤2：反转录反应：取5μl加尾后mrna，加入反转录酶primescript
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rt reagent kit（takara rr037a ）反应体系中，在1
×
缓冲液下反转录酶，primescript rt enzyme mix加入量为1μl，特异性反转引物序列如seq id no .1所示（acacgacgctcttccgatctcccccccccctttttttttt）为50pmol，于42℃反应60min后于90℃进行酶失活反应10min。
39.步骤3：聚合酶链式反应（pcr）：取5μl反转录产物加入聚合酶champagne taq dna polymerase（vazyme p122-d1）反应体系中，在1
×
缓冲液下，加入3.75u聚合酶，正向、反向引物各10pmol，本实施例中mrna polya正向引物序列如seq id no .2所示为gsp-f（tcattgctgcagctcgct），反向引物序列如seq id no .3所示为polya r（acacgacgctcttccgatct），扩增条件为94℃初始变性2分钟，94℃持续10s，65℃持续10s，72℃持续10s，共做30次循环，最后保持在12℃。
40.步骤4：琼脂糖凝胶电泳：取5μl pcr产物与1μl 6
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dna上样缓冲液（transgen gh101-01）混合均匀后上样于2.5%的琼脂糖凝胶中，以反式标准分子量dna trans dna marker i（transgen bm401-01）作为分子量对照，在1
×
tae缓冲液下，120v电泳30min，后于凝胶成像系统（北京通宝达）
polya为60，90，120长度的pcr产物大小分别为250bp，280bp和310bp。实际检测到的长度分别为251bp，286bp和310bp，检测误差分别为0.4%，2.14%和3.22%，误差小，可较为精准地检测出ivt mrna的polya长度。
54.步骤5：灰度值分析：在凝胶成像分析时，进行条带灰度值分析并得出polya120 mrna的占比进行趋势分析。理论上，polya120 mrna的混合占比分别为100%，75%，50%，25%，0%；如表1所示，实际检测到的polya120的占比分别为84.05%，57.38%，29.04%，12.65%，0%。100%的polya120 mrna检出结果为84.05%，原因为ivt mrna制备中存在polya的缺失，即被待检测mrna中存在polya的缺失，本技术检测方法对于缺失polya的mrna仍能够准确得出polya长度占比值。检测结果如表1所示。
55.表1 不同占比polya120 mrna进行polya检测结果polya120mrna理论占比值100%75%50%25%0%polya120mrna检测占比值84.05%57.38%29.04%12.65%0%基于表1所示polya120 mrna检测占比值，得到图4所示不同polya长度占比mrna检测趋势图，即使mrna中混合有多种长度的polya，通过本实施例方法也可精准检测，同时polya120的长度占比值与理论mrna混合比例成线性正相关，r2=0.988。综上，可通过本实施例方法较为准确地得出ivt mrna的polya长度构成及占比。
56.尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
57.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.一种polya检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：在polya聚合酶反应体系中对待测靶mrna进行加尾反应；步骤2：将加尾后的mrna加入反转录反应体系，以特异性反转引物进行反转录形成cdna；步骤3：于待测polya上游位置设计的特异性正向引物与反向引物，对反转录形成的cdna进行聚合酶链式反应得到聚合酶链式反应产物；步骤4：对所述聚合酶链式反应产物进行分离及大小分析，得到polya尾长。2.根据权利要求1所述的polya检测方法，其特征在于：所述步骤1中，以gtp及itp的混合溶液作为底物对待测靶mrna进行加尾反应，使待测靶mrna在3端加入g/i尾。3.根据权利要求2所述的polya检测方法，其特征在于：所述步骤1中，取1μg mrna加入所述polya聚合酶反应体系，所述polya聚合酶反应体系包括，在1
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缓冲液下，使用5u polya聚合酶，gtp溶液与itp溶液各为10pmol，于37℃反应60min，得到加尾后mrna。4.根据权利要求1所述的polya检测方法，其特征在于：所述步骤2中，所述特异性反转引物序列如seq id no .1所示。5.根据权利要求4所述的polya检测方法，其特征在于：取5μl加尾后mrna加入反转录反应体系，所述反转录反应体系包括，在1
×
缓冲液下，取1μl反转录酶、50pmol特异性反转引物于42℃反应60min后于90℃下酶失活反应 10min，得到反转录产物cdna。6.根据权利要求1所述的polya检测方法，其特征在于：所述步骤3中，所述正向引物序列如seq id no .2所示，所述反向引物序列如seq id no .3所示。7.根据权利要求6所述的polya检测方法，其特征在于：所述步骤3中，取5μl反转录产物cdna加入聚合酶链式反应体系中，所述聚合酶链式反应体系包括，在1
×
缓冲液下，加入3.75u聚合酶，取10pmol正向引物和10pmol反向引物，扩增条件为94℃初始变性2分钟，94℃持续10s，65℃持续10s，72℃持续10s，共做30次循环，最后保持在12℃。8.根据权利要求1所述的polya检测方法，其特征在于：所述步骤4中，利用琼脂糖凝胶电泳及dna分子标准量对所述聚合酶链式反应产物进行分离及大小分析，得到所述polya尾长。9.根据权利要求1所述的polya检测方法，其特征在于：所述待测靶mrna为包含不同模板编码polya长度的mrna。10.根据权利要求9所述的polya检测方法，其特征在于：还包括步骤5：对凝胶成像分析时，利用灰度值分析方法分析所述凝胶成像电泳图条带，得到各polya长度占比。

技术总结
本发明公开了一种PolyA检测方法，包括以下步骤：在PolyA聚合酶反应体系中对待测靶mRNA进行加尾反应；将加尾后的mRNA加入反转录反应体系，以特异性反转引物进行反转录形成cDNA；于待测PolyA上游位置设计的特异性正向引物和反向引物对反转录形成的cDNA进行聚合酶链式反应得到聚合酶链式反应产物；对所述聚合酶链式反应产物进行分离及大小分析，得到PolyA尾长。本发明解决了现有技术中PolyA检测操作过程繁复、准确性不高等缺陷，提供了准确检测不同mRNA PolyA尾长及占比的方法，能够适用模板编码polyT转录PolyA尾长检测，有效定义IVT mRNA的理论PolyA长度的占比。mRNA的理论PolyA长度的占比。mRNA的理论PolyA长度的占比。


技术研发人员：贾明明 陈立 朱伟萍
受保护的技术使用者：北京立康生命科技有限公司
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/8/9