一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点、引物组合以及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点、引物组合以及其应用。


背景技术：

2.先天性耳聋是指出生时就有的听力损失，是一种常见的听力障碍，其发病率为1
‰
～3
‰
。先天性耳聋可能是由遗传或非遗传因素引起的。遗传性耳聋是先天性耳聋中最常见的一种，占60％以上。目前，已知有多种基因突变与先天性耳聋相关联，如gjb2、slc26a4、myo7a、cdh23等基因，这些基因的突变可导致耳部结构和听觉功能异常，从而引起先天性耳聋。
[0003][0004]
胚胎植入前单基因遗传病检测(pgt-m)是一种-在胚胎植入前靶向检测胚胎是否携带致病基因突变的技术。这项技术旨在检查胚胎的遗传信息，以发现可能导致婴儿在出生时患有某种遗传病的异常基因突变。该技术最早于上世纪80年代末开始研究和探索，目前这种早期孕前诊断方式已经得到被广泛接受。传统的pgt-m检测通常使用基于毛细管电泳检测核酸短串联重复(short tandom repeats，str)或者基于pcr为基础的一代测序技术完成分析，这些方法具有检测耗时长、通量低、操作复杂、通常无法实现致病变异和多态性位点的同步检测与分析等缺点，同时等位基因脱扣(ado)会导致误诊的风险相对较高。核苷酸多态性(snp)位点的检测技术可以解决部分上述问题。近年来snp芯片技术在基因检测领域应用较多，但是在辅助生殖领域，由于该方法的成本较高和检测时间较长，而且对致病变异的直接检测效果欠佳，因而限制了其在胚胎植入前单基因遗传病检测中的广泛应用。
[0005]
二代测序技术(ngs)具有快速、准确、低成本的优点，通过对胚胎囊胚期细胞进行二代测序，可以检测胚胎的染色体数目、结构和单基因疾病等信息，提高胚胎植入成功率和健康出生率，降低流产和遗传病的风险。
[0006]
等位基因脱扣(ado)是指在进行单细胞pcr扩增时，杂合子的两个等位基因中的一个优势扩增，而另一个完全扩增失败，发生率约为5％-20％。这也是导致误诊的主要原因之一。对于常染色体隐性遗传病来说，ado的发生可能会将杂合胚胎误认为是患病胚胎而影响妊娠率；但对于常染色体显性遗传病，ado的发生则可能导致将患病胚胎误认为正常胚胎，最终导致误诊。


技术实现要素：

[0007]
为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点，该组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点能够应用于制备用于检测诊断胚胎植入前先天性耳聋的试剂。
[0008]
本发明的第二个目的在于提供上述位点在制备胚胎植入前检测先天性耳聋的诊
断试剂或试剂盒的应用。
[0009]
本发明的第三个目的在于提供针对所述用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点检测用的引物组合物。
[0010]
本发明的第四个目的在于提供包含上述引物组合物的试剂盒。
[0011]
本发明的第五个目的在于提供针对所述用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点检测用的特异性引物组合。
[0012]
本发明的第六个目的在于提供包含上述特异性引物组合的试剂盒。
[0013]
本发明的第七个目的在于提供上述试剂盒在制备胚胎植入前检测先天性耳聋的诊断产品中的应用。
[0014]
为实现上述发明的第一个目的，本发明采用的技术方案如下：
[0015]
本发明提供一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点，包括13号染色体携带的74个位点，其中包含一个gjb2突变位点，所述gjb2突变位点的上游是35个与所述gjb2突变位点连锁的snp位点，下游是38个与所述gjb2突变位点连锁的snp位点；
[0016]
所述74个位点如下：
[0017]
[0018]
[0019][0020][0021]
其中，采用上述多个snp有效位点进行分析，能用于胚胎植入前gjb2突变(nm_004004.6(gjb2):c.109g》a)检测，进而能够更好构建单体型。
[0022]
为实现上述发明的第二个目的，本发明采用的技术方案如下：
[0023]
本发明提供上述位点在制备胚胎植入前检测先天性耳聋的诊断试剂或试剂盒的应用。
[0024]
为实现上述发明的第三个目的，本发明采用的技术方案如下：
[0025]
本发明提供一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点检测用的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物中各引物的信息如下：
[0026]
[0027]
[0028]
[0029][0030]
为实现上述发明的第四个目的，本发明采用的技术方案如下：
[0031]
本发明提供用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点的试剂盒，所述试剂盒含有上述所述的引物组合物。
[0032]
为实现上述发明的第五个目的，本发明采用的技术方案如下：
[0033]
本发明提供一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点用的特异性引物组合，所述特异性引物组合包含35对上游引物，1对含致病突变位点的特异性引物，38对下游引物；
[0034]
所述特异性引物组合的序列信息如下：
[0035]
[0036]
[0037][0038]
其中，这些特异性引物的特点是：(1)在目标染色体上序列唯一；(2)引物的tm值相近，引物之间和自身没有互补或部分互补的序列，进而能避免出现二聚体或发夹结构；(3)上下游靶向扩增区间至少包含一个所筛选的snp位点。
[0039]
为实现上述发明的第六个目的，本发明采用的技术方案如下：
[0040]
本发明提供用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点的试剂盒，所述试剂盒含有上述所述的特异性引物组合。
[0041]
为实现上述发明的第七个目的，本发明采用的技术方案如下：
[0042]
本发明提供上述试剂盒在制备胚胎植入前检测先天性耳聋的诊断产品中的应用。
[0043]
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0044]
(1)本发明通过发现了一组与先天性耳聋致病位点(nm_004004.6(gjb2):c.109g》a)遗传连锁的snp位点并证明通过检测该组snp位点基因型信息能够检测胚胎先天性耳聋相关致病位点的基因型信息，因此，该组snp位点可以作为临床胚胎植入前检测先天性耳聋的生物标志物。另外，该组先天性耳聋相关的snp位点和相关引物组合可用于制备先天性耳聋胚胎植入前单基因遗传病测试用诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品，采用该诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品能够提高临床胚胎植入前检测先天性耳聋诊断的准确性，从而避免携带致病基因型的胚胎植入，阻断先天性耳聋家族遗传的发生。
[0045]
(2)本发明的一组胚胎植入前检测先天性耳聋连锁的snp位点，是基于二代高通量测序技术的，并能够在胚胎植入前检测先天性耳聋的位点，具有通用性、高通量、成本低、高灵敏度、特异性强的优点，在实际应用的过程中，通过对多位点snp测序、防止扩增等位基因脱扣造成的检测误诊，能够对胚胎移植前先天性耳聋进行快速精准地检测。
[0046]
(3)本发明的一组胚胎植入前检测先天性耳聋连锁的snp位点，是来自gjb2基因突变位点，以及gjb2基因突变位点上下游1mb的连锁区域，因此，根据检测到的这些snp位点的基因型构建用于检测先天性耳聋突变的单体型，具有特异性强，连锁性高的优点。
[0047]
(4)本发明的针对用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点检测用的引物组合物，
由于采用了74个snp进行分析，可用于不同家系的胚胎移植前诊断，因此通用性比较好。另外，由于多个snp位点同时检测，能够用于多种先天性耳聋的家系组合胚胎移植前检测，也可用于胎儿检测，流产组织检测。
[0048]
(5)本发明的针对用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点检测用的特异性引物组合，包含35对上游引物，1对含致病突变位点的特异性引物，38对下游引物，该特异性引物组合能够将靶向缺失区间及连锁位点同时扩增，靶向位点结果与连锁位点单体型结果相互验证，准确率更高，且节约成本。也即，由于是通过该特异性引物组合而不是单一位点的检测，降低等位基因脱扣(ado)造成的误诊，能有效提高检测的准确性和可靠性，并能大大降低检测先天性耳聋的成本和时间。
具体实施方式
[0049]
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0050]
在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明中，实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
[0051]
为帮助更好理解本发明，对以下概念进行了解释：
[0052]
snp芯片(snp chip)技术是指通过微阵列(microarray)技术将高密度dna片段通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如膜、玻璃片等固相表面，以同位素或荧光标记的dna探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的snp位点基因型检测的技术。
[0053]
单体型(haplotype)是一条染色体上一组紧密相连的等位基因的基因型，通常作为一个单位遗传。单体型可以反映出染色体上的单核苷酸多态(snp)的组合和分布。
[0054]
测序深度是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值，可以理解为基因组中每个碱基被测序到的平均次数。测序深度越高，表示测序数据的质量和可靠性越高，但也会增加测序的成本和数据量。例如在一个实施方案中，测序深度为1000x，则代表该条特异pcr扩增产物被测序1000次。
[0055]
有效位点是指夫妻男女双方的某个snp位点，或str位点，其中一方为纯合，另一方为杂合，则该位点称为有效位点。
[0056]
下面结合具体实施例进行说明。
[0057]
实施例1
[0058]
一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点，包括13号染色体携带的74个位点，其中包含一个gjb2突变位点，所述gjb2突变位点的上游是35个与所述gjb2突变位点连锁的snp位点，下游是38个与所述gjb2突变位点连锁的snp位点；
[0059]
所述74个位点如下：
[0060]
[0061]
[0062][0063]
其中，采用上述多个snp有效位点进行分析，能用于胚胎植入前gjb2突变(nm_004004.6(gjb2):c.109g》a)检测，进而能够更好构建单体型。
[0064]
其中，本发明的一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点，对应的坐标如下：
[0065]
[0066]
[0067][0068]
实施例2
[0069]
实施例1的一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点在制备胚胎植入前先天性耳聋的诊断试剂或试剂盒的应用。
[0070]
针对上述一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点设计检测用的引物组合物，所设计的引物组合物中各引物的信息如下：
[0071]
[0072]
[0073][0074][0075]
其中，设计用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点的试剂盒，该试剂盒含有上述引物组合物。
[0076]
另外，针对上述一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点设计检测用的特异性
引物组合，该特异性引物组合包含35对上游引物，1对含致病突变位点的特异性引物，38对下游引物；该特异性引物组合的序列信息如下：
[0077]
[0078]
[0079][0080]
其中，设计用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点的试剂盒，该试剂盒含有上述的特异性引物组合。
[0081]
另外，上述的试剂盒应用于制备胚胎植入前检测先天性耳聋的诊断产品。
[0082]
实验：
[0083]
一、单细胞全基因组扩增
[0084]
基于本发明的一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点，采用单细胞全基因组扩增技术增加检测dna起始量，通过靶向多重pcr捕获测序技术检测致病位点基因型和致病位点连锁的snp位点基因型，采用单体性连锁分析构建与致病位点关联的单体型方法检测胚胎是否携带致病突变。
[0085]
其中，样本的前处理采用的单细胞全基因组扩增技术(single-cell whole genome amplification，scwga)是一种基因组扩增技术，它能够从单个细胞中扩增出足够的基因组dna，使得能够对单个细胞的基因组进行全面的分析。该单细胞全基因组扩增的具体操作是，首先采用带有反向序列尾巴的随机引物对单细胞dna进行6轮的扩增，生成“半扩增产物”。这些半扩增产物两端带反向互补序列，反向互补序列互相结合，形成圆环，无法作为下一轮pcr扩增的模板，从而避免了dna过度拷贝，从而很大程度上防止dna复制后的指数性扩增，增加了全基因组扩增的均一性。另外，对预扩增的产物用一对引物进行指数扩增，增加扩增产物产量。其中，对预扩增的产物进行指数扩增所采用的该对引物为市售的scwga试剂盒中配套的引物。
[0086]
具体方法包括：
[0087]
靶向捕获方法：多重pcr捕获测序是一种基于多重pcr技术的目标区域捕获测序方法。多重pcr技术是指通过一次pcr反应同时对多个靶标进行扩增，结合一定的检测手段对扩增产物进行检测从而实现对多个靶标进行诊断的技术。多重pcr捕获测序是利用预先设计的引物，即本发明的用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点设计检测用的特异性引物组合，对对感兴趣的目标区域进行快速靶向线性扩增，然后使用高通量测序平台进行大批量样本平行检测与深度分析的整体解决方案。具有高效率，高通量，低成本的优点，适用于临床级确定基因热点的超速检测模式。本发明用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点设计检测用的特异性引物组合，共74对，是针对中国人先天性耳聋的snp位点，能避免等位基因脱扣的发生。
[0088]
高通量测序方法：使用设计好的多重引物panel，配合特异性条形码和dna文库，对目标序列进行快速高效的扩增；对构建成功的文库进行上机前的质检，确保文库的质量和可靠性；质检通过的文库进行均一化处理，然后进行模板制备和富集，以获得足够的模板量；对模板进行扩增，并使用阳性模板在ion torrent等高通量测序平台上进行测序实验。
[0089]
生物信息分析方法：将二代测序结果进行过滤，得到过滤后的测序结果，过滤的条件包括序列中含有n的比例，以及含有低质量碱基数的比例，所述n为测序得到的碱基无法
判断，过滤一条序列中n的比例大于5％的序列，以及一条序列中质量值小于20的比例大于40％的序列。将过滤后的测序结果与参考人类基因组序列进行比对，获得经过比对的测序数据集合；所述比对的软件采用bwa-mem；所述参考人类基因组为grch38，确定目标区域多态性位点的基因型，筛选有效位点，最后通过样本间家系关系分析单体型。
[0090]
二、筛选snp有效位点的标准为：
[0091]
(1)位点位于gjb2突变区域的上下游1mb区域内以及三种突变区域中的特异性区段内，snp位点在基因上、下游均匀分布，平均每4-5kb一个snp位点。
[0092]
(2)snp位点均存在于千人基因组或dbsnp数据库中收录，选取等位基因频率较高的位点，maf大于0.2的snp。
[0093]
(3)snp位点附近序列在人类基因组中不具有同源性。
[0094]
(4)由于不同人种间同snp位点的maf值差异较大，因此在进行snp位点选择时结合了千人基因组maf数据库及自建的15万中国人群为基础snp数据库，使其更适用于中国人群。
[0095]
实验案例：
[0096]
实验例1：通过上下游snp位点确定单体型
[0097]
一、操作方法
[0098]
(1)样本获取：选取亲代双方及其患病儿代(先证者)采用全血样本；提取血液基因组dna，利用qubit 4.0测定dna浓度，并取一定量作为待测dna样本。然后选取胚胎待测样6例，胚胎发育至囊胚期，采用常规胚胎活检技术取出3-5个外滋养层细胞，自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组dna进行富集，全基因组扩增采用fapon single cell genome-ampli kit(nk023)。
[0099]
(2)获得的样本dna进行qubit 4.0浓度测定。本实验例中，dna样本采用dsdna hs assay kit试剂盒进行浓度测定，按照试剂盒说明书操作步骤进行检测。
[0100]
(3)目的片段扩增：将dna与多重pcr引物和pcr扩增试剂混合，经多重pcr反应，得到目的基因dna片段；
[0101]
其中，反应体系如下：
[0102][0103][0104]
其中，反应条件如下：99℃预变性2min，1个循环；99℃变性15s，于60℃下退火和延伸4min，22个循环；10℃终止。
[0105]
(4)引物消除：将步骤(3)得到的dna片段加入2μl life technologines公司的fupa reagent引物消除试剂，混合反应，以降解去除pcr扩增片段中的引物序列，得到去引
物的dna片段。
[0106]
(5)文库构建：将步骤(4)得到的去引物后的dna片段与p1接头、特异性接头、连接反应试剂混合进行连接反应，得到加接头的dna片段；
[0107]
其中，反应体系如下：
[0108]
试剂体积(μl)步骤(4)产物22连接缓冲液4p1接头4特异性接头4dna连接酶2总体积30
[0109]
进行反应时，对反应体系震荡混匀，然后进行离心后放入pcr仪，反应条件如下：22℃下30min，升温至68℃下5min，升温至72℃下5min，降温至10℃终止。
[0110]
(6)磁珠纯化：将加接头的dna片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头，得到纯化的dna片段。
[0111]
(7)文库检测：采用荧光定量pcr的方法检测步骤(6)得到的纯化的dna片段的文库浓度。
[0112]
(8)高通量测序：采用ion torrent pgm测序平台对步骤(7)得到的文库进行高通量测序。
[0113]
(9)生物信息学分析：对胚胎活检细胞全基因组扩增wga产物(dna)及家系样本进行捕获测序后进行生物信息学snp分析，获得夫妇及致病基因连锁单倍型信息，再根据胚胎样本的测序信息判断先天性耳聋相关的致病位点基因型，并进行分类和诊断。利用fastp-0.21.0软件对原始数据进行过滤，并利用bwa-mem软件比对到人类grch38参考基因组，去除低质量序列，统计目标位点的测序深度，并去除深度小于100的位点，然后确定目标区域snp位点的基因型。利用父母和胚胎目标区域snp位点的基因型，筛选有效位点构建单体型。然后利用已经建立好的单体型对胚胎是否携带突变进行判断。
[0114]
二、判断结果
[0115]
选取目标区域的18个有效位点构建单体型，结果如表1所示。
[0116]
表1上下游snp位点判断单体型结果数据表
[0117][0118][0119]
上下游snp位点判断单体型结果数据表(接上表)
[0120][0121]
其中，女方基因型的chrb一列、男方基因型的chrd一列、先证者基因型的chrb一列和chrd一列、胚胎1的chrd一列、胚胎2的chrb一列和chrd一列、胚胎3的chra一列、胚胎4的chrb一列和chrd一列、胚胎5的chrb一列和chrd一列均为携带致病缺失基因的染色单体。其中，chra为正常染色体单体，chrb为携带母源风险染色单体，chrc为正常染色体单体，chrd为携带父源风险染色单体。
[0122]
上述判断结果表明：男方染色单体分为chrc和chrd，其中chrd为携带致病突变染色单体，chrc为正常染色体单体；女方染色单体分为chra和chrb，其中chra为正常染色体单体，chrb携带致病突变染色单体；先征者染色体单体分别为chrb和chrd，为纯合突变。胚胎1为杂合突变，胚胎2为纯合突变，胚胎3为杂合突变，胚胎4为纯合突变，胚胎5为纯合突变，胚胎6无突变。
[0123]
其中，在胚胎致病位点因scwga导致等位基因脱扣(ado)情况下可仅通过致病位点上下游所筛选的snp位点基因型检测结构进行致病位点分型，无需借助先天性耳聋gjb2致病位点。并且，结合所筛选的snp位点与靶向扩增区间内相关的其他snp位点，一起进行单体型分析，增加有效位点数目，帮助单体型分型，能够帮助先天性耳聋检测得到更好的判定。
[0124]
另外，本发明根据致病基因上下游多态位点(snp)进行连锁分析，在进行snp连锁分析时，为避免影响诊断结果的脱扣问题，选择更多的多态性位点数量，即使少数位点发生脱扣，也不影响最后的诊断结果，进而提高遗传学诊断的准确性，降低误诊率。
[0125]
实验例2：panel捕获性能指标检测
[0126]
本实验例使用与实验例1相同的6例胚胎囊胚期滋养层细胞全基因组扩增产物、父
母及先征者外周血细胞dna样本，使用本发明设计的引物组合物(共74对snp引物)，按照fapon single cell genome-ampli kit(nk023)标准建库流程进行建库，并在ion torrent pgm上测序，得到片段长度分布在100-150bp的目标区域dna片段序列。对获得的测序下机数据进行常规参数的质控和分析。
[0127]
检测结果：
[0128]
对实验例1中的样本进行测试，能够获得靶向区间全覆盖，目标全覆盖，最低测序深度为100x，mapping rate≥99％，ontarget rate≥95％，100x均一度≥95％。具体信息如下表2所示。
[0129]
表2样本测试信息表
[0130][0131]
表2中，“mapping rate”代表重测序时比对率；“ontarget rate”代表中靶率，表示测序数据比对到靶向扩增子的比例；“》0.2x average depth rate”代表大于0.2x平均测序深度位点的比例，该值越高，扩增均一性越好；“》30xdepth rate”代表目标位点的覆盖率，该值越高，说明目标位点覆盖度越高。
[0132]
以上所述仅为本技术的较佳实施例而已，并不用以限制本技术，凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点，其特征在于，包括13号染色体携带的74个位点，其中包含一个gjb2突变位点，所述gjb2突变位点的上游是35个与所述gjb2突变位点连锁的snp位点，下游是38个与所述gjb2突变位点连锁的snp位点；所述74个位点如下：
2.权利要求1所述的位点在制备胚胎植入前检测先天性耳聋的诊断试剂或试剂盒的应用。3.权利要求1所述的一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点检测用的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物中各引物的信息如下：
4.用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点的试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的引物组合物。5.权利要求1所述的一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点检测用的特异性引物组合，其特征在于，所述特异性引物组合包含35对上游引物，1对含致病突变位点的特异性引物，38对下游引物；所述特异性引物组合的序列信息如下：
6.用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点的试剂盒，其特征在于，含有权利要求5所述的特异性引物组合。7.权利要求4或6任一项所述的试剂盒在制备胚胎植入前检测先天性耳聋的诊断产品中的应用。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋的位点、引物组合以及其应用，本发明发现一组用于胚胎植入前检测先天性耳聋SNP位点并证明其通过检测该组SNP位点基因型信息可以检测胚胎先天性耳聋相关致病位点的基因型信息，因此，可作为临床胚胎植入前辅助诊断先天性耳聋的生物标志物。另外，该组先天性耳聋相关的SNP位点可用于制备先天性耳聋胚胎植入前单基因遗传病测试用诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品，采用诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品能够提高临床胚胎植入前先天性耳聋诊断的准确性，从而避免携带致病基因型的胚胎植入，阻断先天性耳聋家族遗传的发生。发生。


技术研发人员：彭昕瑶 彭霁民 郭文涛 朱国红 彭幼鹏
受保护的技术使用者：广州中景医学检验实验室有限公司
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/8/9