一种抑制乳腺癌生长的AAV苗及应用

一种抑制乳腺癌生长的aav苗及应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学和基因诊断学领域，具体涉及一种自主设计的aav苗在预防和治疗乳腺癌等肿瘤中的应用。


背景技术：

2.世界卫生组织国际癌症研究机构(iarc)发布了2020年全球最新癌症负担数据。预估了全球185个国家36种癌症类型的最新发病率、死亡率情况，以及癌症发展趋势。这项最新预估数据显示，2020年全球新发癌症病例1929万例，其中男性1006万例，女性923万例；2020年全球癌症死亡病例996万例，其中男性553万例，女性443万例。
3.全球乳腺癌新发病例高达226万例，超过了肺癌的220万例，乳腺癌取代肺癌，成为全球第一大癌。全球发病率前十的癌症分别是：乳腺癌226万，肺癌220万，结直肠癌193万，前列腺癌141万，胃癌109万，肝癌91万，宫颈癌60万，食管癌60万，甲状腺癌59万，膀胱癌57万，这十种癌症占据新发癌症总数的63％。2020年中国癌症新发病例457万例，前四位分别是肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌。
4.目前国际上保乳手术证明了其生存率与全乳切除者相比是基本相同的；可以获得与改良根治术的“传统”方法相同的长期生存率。靶向治疗是乳腺癌的治疗另一种方法。临床发现，大约有2/5的乳腺癌患者表达her2(人表皮生长因子受体-2)。因此抑制her2是乳腺癌靶向治疗的机制。曲妥珠单抗是一种人源化抗体，能特异性地与基因her2所表达的蛋白受体在肿瘤细胞膜外结合，从而阻断肿瘤细胞的信息传播通道，达到治疗恶性肿瘤的目的。一般筛查出可接受生物靶向药物治疗的her2阳性患者，大大提高了患者的生存期与生活质量。乳腺癌存在一种雌激素受体(er)或孕激素受体(pr)，内分泌治疗就是通过药物治疗，阻断雌激素与这些受体的结合或抑制雌激素的生成，起到抑制肿瘤细胞生长，降低复发率和转移风险。据统计，接受内分泌治疗的患者比没有接受此项治疗的患者，可以相对降低复发风险达20％～30％。虽然，上述治疗手段对乳腺癌患者的预后和生存具有明显的改善作用，但探索新的有效治疗手段和预防手段仍是目前的一项重要任务。
5.与传统治疗手段相比，治疗性疫苗针对肿瘤细胞表达的肿瘤相关抗原(taa)或肿瘤特异性抗原(tsa)，能有效激活免疫系统杀伤肿瘤细胞，而对正常组织却几乎没有损伤。发展治疗性疫苗有望达到特异、安全、有效地防治乳腺癌的目的。
6.目前大多数疫苗的研究集中在将ⅰ类限制性抗原作为特异性ctl作用的靶点，但如果将ⅰ类和ⅱ类抗原决定簇共同接种，cd4+t细胞能产生更多的有效的免疫反应。理想的疫苗，抗原的剂量和抗原释放的速度都非常重要。
7.在本发明之前，还没有有效的用于乳腺癌预防和治疗的疫苗。信号传导子和激活子3(stat3)表达的影响在乳腺癌组织中表达水平高于正常乳腺组织，与乳腺癌的分期和转移明显相关。当抑制人乳腺癌中stat3蛋白的表达，能阻断jaks/stat3通路，进而抑制人乳腺癌细胞的增殖。本发明针对stat3通路，设计了aav苗，发现其能有效抑制乳腺癌生长及迁移，为肿瘤的治疗提供了新思路。


技术实现要素：

8.本发明提供了一种自主设计的aav苗在抑制乳腺癌生长及迁移中的应用，该苗能明显抑制乳腺癌细胞在体内、体外增殖和迁移，对乳腺癌动物模型也有明显的预防和治疗作用。所述aav苗及特异性核酸，其特征在于，设计的aav苗核酸序列：5
′‑
gatcccggatgaagagttatcttaaggttcaagagaccttaagat aactcttcatcctttttggaaac-3
′
。检测这种aav苗在乳腺癌治疗中的作用，序列如seq id no：1所示。
9.(1)aav苗的制备
10.首先，载体构建。选择paav-zsgreen-shrna载体(上海泽叶生物科技有限公司)，应用ecor i和bgl ii酶切并补平，重构载体。然后应用bamh i和xho i酶切位点，将核酸序列1：5
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ccgggatcccggatgaagagttatcttaaggttcaagagacctta agataactcttcatcctttttggaaactcgaggcca-3
′
；或将核酸序列2：5
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ccgggatcccgagttatcttaaggatcatttcaagagaatgatcct taagataactctttttggaaactcgaggcca-3
′
；连接到重构paav-zsgreen-shrna载体上，得到paav-zsgreen-wfdown载体。
11.(2)病毒的包装制备
12.aav-293细胞的冻存：去掉细胞培养上清液，加入pbs洗去残留的培养基；加入0.25％的胰酶，消化1～2min后，待细胞变圆，间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。细胞计数后。离心1000rpm/min，5min。去掉上清。加入细胞冻存液重悬细胞，分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。
13.aav-293细胞的传代：消化细胞，方法同细胞冻存。细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。将细胞分到10cm培养皿中，每个培养皿补足到10ml培养基。
14.aav-293细胞的复苏：从液氮罐中取出冻存的细胞，迅速丢入37～42℃水浴锅中并快速晃动；将细胞溶液转移到15ml离心管中，并在其中加上1ml新鲜的完全培养基，混匀后离心去掉上清，加入5ml新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入6cm培养皿，放培养箱中培养。
15.aav包装：扩增构建好的paav-zsgreen-wfdown载体、包装质粒和辅助质粒，使用qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量抽提。aav-293细胞传代当天记为第一天，若第二天进行转染。转染当天观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。转染前无需换培养基。用lipofiter tm转染试剂，使用说明参考lipofitertm说明书。将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中。分离细胞和上清，将上清另外存放，细胞用1ml pbs重悬；将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37℃水浴中反复转移，冻融四次。每次融解后稍加震荡。
16.aav浓缩：然后，离心去除细胞碎片，将两次收集的上消混合在一起，用0.45um滤器过滤除杂质。加入1/2体积的1m nacl，10％peg8000浴液，混合均匀，4度过夜。离心，弃上清，病毒沉淀用适量的pbs溶液溶解，用0.22um滤器过滤除菌。去除残留的质粒dna，浓缩的aav病毒。向病毒浓缩液中添加固体cscl直到密度为1.41g/ml(折射率为1.372)。取样进行消度测定。将浓缩的病毒-80℃保存
17.(3)乳腺癌细胞培养
18.乳腺癌sum159细胞，用10％fbs rpmi-1640培养基，在37℃5％co2的培养箱里进行
培养。
19.(4)mtt实验
20.sum159细胞种在96孔板里，每孔1
×
104个细胞。包装好的病毒感染细胞，每孔加10μl mtt，培养4h后，去除孔里的液体加150μl dmso，酶标仪检测细胞在570nm处的吸光度值。结果发现，paav-zsgreen-wfdown病毒苗处理后，能够抑制乳腺癌细胞增殖。
21.(5)cck8实验
22.sum159细胞种在96孔板里，每孔1
×
104个细胞。用上述病毒感染细胞后，向每个孔中添加10μl cck。培养1-4小时。酶标仪检测细胞在450nm处测量吸光度。结果发现，实验组paav-zsgreen-wfdown病毒苗处理后，细胞生长受到明显抑制，实验组细胞stat3及p-stat3表达明显减少。
23.(6)癌细胞异种移植
24.将2
×
106个sum159细胞皮下注射balb/c-nu裸鼠背部。小鼠后肢皮下注射1
×
109(v.g./只)。用游标卡尺每天对原发肿瘤进行评估。结果发现，实验组paav-zsgreen-wfdown病毒苗注射后，与对照处理相比，小鼠体内肿瘤嫁接体的重量、体积明显减少，肿瘤内stat3及p-stat3表达明显减少。
25.(7)对乳腺癌小鼠模型肿瘤生长抑制作用分析
26.多瘤中间t抗原(pymt)小鼠模型是研究乳腺癌进展的理想模型。在该模型中，乳腺增生最早可在4周内观察到。为了研究瘤苗对小鼠乳腺癌生长的影响，将瘤苗病毒皮下注射到mmtv-pymt小鼠的四个内侧肢体位置。结果表明，与对照组相比，瘤苗病毒处理的mmtv-pymt小鼠，在肿瘤数量、体积、重量方面明显抑制了乳腺癌的进展。
27.(8)transwell细胞迁移
28.取600μl加入transwell小室的下室内，将转染48h后的各组细胞消化并计数，100μl细胞悬液加入transwell小室内，每组设置三个平行孔，在培养箱内继续培养24h。将transwell小室取出，取200μl移液枪将上室内剩余液体吸净，然后置于1ml 1xpbs漂洗2次。每孔加入600μl 4％多聚甲醛进行固定，每孔加入600μl 0.1％结晶紫染液进行染色，漂洗至多余的结晶紫染液洗脱干净，置于室温通风处晾干，倒置显微镜下观察，采图并计数。结果发现，paav-zsgreen-wfdown病毒苗处理组，能明显抑制细胞迁移，模型组小鼠几乎不长肿瘤。
29.下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步具体说明。
附图说明
30.图1：mtt检测瘤苗对乳腺癌细胞生长抑制图；
31.图2：cck8检测瘤苗对乳腺癌细胞增殖影响；
32.图3：病毒苗对裸鼠体内肿瘤生长的影响；
33.图4：病毒苗对pymt乳腺癌模型小鼠肿瘤生长的影响；
34.图5：病毒苗对乳腺癌细胞迁移的影响。
具体实施方式
35.以设计的aav苗及特异性核酸为例，说明其对乳腺癌细胞生长的抑制及对乳腺癌
模型的治疗作用。
36.(1)所需要材料
37.sum159细胞(上海细胞生物研究所)；rpmi-1640培养基(gibco,grand island,new york,u.s.a.)；胎牛血清(fbs,gibco)；mtt(0.5mg/ml)；lipofiter tm(hb-trlf-50,汉恒生物)；paav、phelper、paav-zsgreen-shrna载体(汉恒生物科技有限公司)；ecor i、bgl ii、bamh i、xho i酶(宝生物工程(大连)有限公司)；transwell培养板(8μm,美国corning costar公司)。
38.(2)aav苗的制备
39.首先，载体构建。选择paav-zsgreen-shrna载体，应用ecor i和bgl ii酶切并补平，重构载体。然后应用bamh i和xho i酶切位点，将核酸序列连接到重构paav-zsgreen-shrna载体上，得到paav-zsgreen-wfdown载体。
40.(3)病毒的包装制备
41.aav-293细胞的冻存：去掉细胞培养上清液，加入pbs洗去残留的培养基；加入0.25％的胰酶，消化1～2min后，待细胞变圆，间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。细胞计数，加入3ml 37℃预热的10％dmem，用10ml移液管进行吹打，取10ul细胞于计数板中计数。细胞离心，1000rpm/min，5min。去掉上清。加入细胞冻存液(70％完全培养基20％fbs+10％dmso)重悬细胞，密度为3x106个/ml。分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。
42.aav-293细胞的传代：消化细胞，方法同细胞冻存。细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。将细胞分到10cm培养皿中，每个培养皿补足到10ml培养基。
43.aav-293细胞的复苏：从液氮罐中取出冻存的细胞，迅速丢入37～42℃水浴锅中并快速晃动；将细胞溶液转移到15ml离心管中，并在其中加上1ml新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm/min，5min。去掉上清，加入5ml新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入6cm培养皿。将培养皿平稳放入37℃、5％co2的培养箱中培养。
44.aav包装：扩增构建好的paav-zsgreen-wfdown载体、包装质粒和辅助质粒，使用qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量抽提。将培养aav-293细胞培养瓶中的培养基吸净，加入2ml 0.25％胰酶，使其均匀覆盖瓶底，于37℃培养箱中3-5min，加入3ml 37℃水浴中预热的10％dmem，移液枪用10ml移液管进行吹打。之后，取10ul细胞于计数板中计数。传代当天记为第一天，若第二天进行转染，每瓶加10ml 10％dmem培养基。转染当天观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。转染前无需换培养基。质粒转染量如下：paav-zsgreen-wfdown质粒5ul(1.0ug/ul)、包装质粒5ul(1.0ug/ul)、辅助质粒5ul(1.0ug/ul)，用lipofiter tm转染试剂，使用说明参考lipofiter tm说明书。将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中。收集细胞时，将培养盘倾斜一定角度将细胞刮到培养基中；1000rpm/min，离心3分钟，分离细胞和上清，将上清另外存放，细胞用1ml pbs重悬；将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37℃水浴中反复转移，冻融四次。每次融解后稍加震荡。注意：每次凝固和解冻大概需要十分钟的时间。
45.aav浓缩：然后，10,000g离心去除细胞碎片，将离心上请转移到一个新离心管中。将两次收集的上消混合在一起，用0.45um滤器过滤除杂质。加入1/2体积的1m nacl，10％peg8000浴液，混合均匀，4度过夜。12,000rp1n离心2h，弃上清，病毒沉淀用适量的pbs溶液
溶解，后用0.22um滤器过滤除菌。加入benzonase核酸酶消化去除残留的质粒dna(终浓度为50u/ml)。在37℃水浴孵育30分钟，用0.45μm过滤头过滤，取滤出液，为浓缩的aav病毒。向病毒浓缩液中添加固体cscl直到密度为1.41g/ml(折射率为1.372)。将样品加入到超速离心管中，用预先配好的l.41g/ml csci溶液将离心管剩余空间填满，在175,000g离心24小时，以形成密度梯度。按顺序分步收集不同密度的样品，取样进行消度测定。收集富集有aav颗粒的组分；重复上述过程一次。将病毒装入100kda的透析袋，4度透析脱盐过夜。将浓缩的病毒-80℃保存。
46.(4)乳腺癌细胞培养
47.乳腺癌sum159细胞，用10％fbs rpmi-1640培养基，在37℃5％co2的培养箱里进行培养。
48.(5)mtt实验
49.sum159细胞种在96孔板里，每孔1
×
104个细胞。用约1
×
105(v.g./cell)感染细胞，48h后，每孔加10μl mtt，培养4h后，去除孔里的液体加150μl dmso，酶标仪检测细胞在570nm处的吸光度值。结果发现，paav-zsgreen-wfdown病毒苗处理后，能够抑制乳腺癌细胞增殖(图1)。
50.(6)cck8实验
51.sum159细胞种在96孔板里，每孔1
×
104个细胞。用约1
×
105(v.g./cell)感染细胞后，向每个孔中添加10μl cck。培养皿在培养箱中培养1-4小时。酶标仪检测细胞在450nm处测量吸光度。结果发现，实验组paav-zsgreen-wfdown病毒苗处理后，细胞生长受到明显抑制(图2a)。与对照组相比，实验组细胞stat3及p-stat3表达明显减少(图2b)。
52.(7)癌细胞异种移植
53.将2
×
106个sum159细胞皮下注射到6-8周龄的balb/c-nu裸鼠背部(购自中国北京hfk生物科技有限公司)。小鼠后肢皮下注射1
×
109(v.g./只)，每周1次，连续2周。用游标卡尺每天对原发肿瘤进行评估。一个月后，通过腹腔注射巴比妥类药物对小鼠实施安乐死。结果发现，实验组paav-zsgreen-wfdown病毒苗注射后，与对照处理相比，小鼠体内肿瘤嫁接体的大小及重量(图3a,b)、体积明显减少(图3c)，肿瘤内stat3及p-stat3表达明显减少(图3d)。
54.(8)对乳腺癌小鼠模型肿瘤生长抑制作用分析
55.多瘤中间t抗原(pymt)小鼠模型是研究乳腺癌进展的理想模型。在该模型中，乳腺增生最早可在4周内观察到。为了研究瘤苗对小鼠乳腺癌生长的影响，将瘤苗病毒皮下注射到mmtv-pymt小鼠的四个内侧肢体位置(每个位置注射2.5
×
108(v.g./点)，每周一次，共3周)。结果表明，与对照组相比，瘤苗病毒处理的mmtv-pymt小鼠，在肿瘤数量、体积、重量(图4)方面明显抑制了乳腺癌的进展，处理组几乎不长肿瘤。
56.(9)transwell细胞迁移
57.将提前配制好的含30％胎牛血清的细胞培养基，取600μl加入transwell小室的下室内，轻轻将transwell小室放入含培养基的孔内，避免小室下表面与下室培养基间产生气泡，致使迁移效果不佳。将转染48h后的各组细胞消化并计数，使用含有10％胎牛血清的细胞培养基，加入细胞使其终浓度为5
×
105/ml。100μl细胞悬液加入transwell小室内，每组设置三个平行孔，在培养箱内继续培养24h。将transwell小室取出，先将棉签头部按压平
整，取200μl移液枪将上室内剩余液体吸净，再用棉签头部轻旋擦拭上室接种细胞面，均匀用力避免损伤滤膜，然后置于1ml1xpbs漂洗2次。每孔加入600μl 4％多聚甲醛进行固定，时间不少于30min。每孔加入600μl 0.1％结晶紫染液进行染色，时间不可超过30min，避免不易漂洗，产生高背景。用自来水进行漂洗至多余的结晶紫染液洗脱干净，棉签轻轻拭干水分，置于室温通风处晾干，倒置显微镜下观察，采图并计数。结果发现，paav-zsgreen-wfdown瘤苗处理组，能明显抑制细胞迁移(图5)。该瘤苗也能明显抑制肺癌细胞的增殖和迁移。

技术特征：
1.一种预防和治疗乳腺癌生长的aav苗，其特征在于，这种aav苗能够明显抑制乳腺癌细胞在体内和体外增殖，aav苗还能抑制乳腺癌细胞的迁移，对乳腺癌动物模型也有明显的预防和治疗作用。2.根据权利要求1所述的一种aav苗的特异性核酸，其特征在于，设计的aav苗核酸序列：5
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gatcccggatgaagagttatcttaaggttc aagagaccttaagataactcttcatcctttttggaaac-3
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。3.根据权利要求1、2所述的一种aav苗，在乳腺癌、肺癌预防和治疗中的作用，及其抑制肿瘤细胞生长的应用。4.根据权利要求2所述的aav苗的特异性核酸核心序列在治疗肿瘤中的应用，其特征是，应用这种aav能有效抑制乳腺癌、肺癌等肿瘤细胞在体内、体外增殖及迁移，对肿瘤细胞生长具有明显的杀伤作用。

技术总结
本发明属于生物技术和医学技术领域，提供了一种自主设计的、有效抑制乳腺癌生长的AAV苗。本发明提供的疫苗明显抑制乳腺癌细胞在体内和体外增殖，有效控制模型小鼠肿瘤生长。对乳腺癌动物模型也有明显的预防和治疗作用，为乳腺癌的预防和治疗提供了新思路。乳腺癌的预防和治疗提供了新思路。乳腺癌的预防和治疗提供了新思路。


技术研发人员：谢书阳 梁东敏 李有杰 张家祥 王萍玉 许森
受保护的技术使用者：滨州医学院
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/8/9