一种薏仁醇溶蛋白降糖肽及其制备方法与应用

1.本发明属于食品加工领域，特别是涉及一种薏仁醇溶蛋白降糖肽及其制备方法与应用。


背景技术：

2.糖尿病是一种常见的慢性代谢疾病，以高血糖和血脂异常为主要患病特征，主要以ii型糖尿病(t2dm)为主。目前，对t2dm的防治主要途径包括抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、dpp iv酶活力，促进glp-1分泌，抑制人胰岛淀粉样多肽的纤维化聚集等。其中α-葡萄糖苷酶(ec 3.2.1.20)属于肠道内消化酶，位于小肠刷状缘处，可以将食物碳水化合物裂解为游离葡萄糖分子以便机体吸收转运，因此阻断α-葡萄糖苷酶的功能活性能有效降低淀粉类食物对t2dm患者餐后血糖水平的影响。
3.薏仁蛋白是一种富含谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸等降血糖氨基酸的优质谷物蛋白，具有开发成降血糖活性成分应用于健康食品、保健品或功能饮料等食品的巨大潜力，但常作为生产薏仁油、薏仁多糖的副产物而废弃，导致利用率不高，造成极大资源浪费。
4.薏仁蛋白含量约占籽粒重量的14.17％，其中薏仁醇溶蛋白是其主要贮藏蛋白，约占总蛋白含量的44.74％，且具有丰富的必需氨基酸如leu、phe和val等，是一种重要的膳食蛋白来源。
5.研究已经证实薏仁蛋白具有显著的抗ii型糖尿病的生理作用，这主要归因为薏仁蛋白的序列中带有降血糖药理活性的生物活性肽片段。在这些薏仁蛋白质序列中具有降血糖片段，尤其是具有抑制ii型糖尿病靶标—α-葡萄糖苷酶活性的降糖肽片段。因此，提供一种合理、高效且适用性强的技术把薏仁醇溶蛋白的高降血糖活性的蛋白片段释放出来将有利于下游薏仁蛋白衍生产品的开发，但是目前未有资料系统报道过薏仁醇溶蛋白源高活性降糖肽的制备工艺。
6.受限于薏仁醇溶蛋白紧凑的蛋白结构，导致通过酶解作用将肽段释放的过程较为缓慢，且肽转化率不高，降血糖效果不能最大程度地发挥。目前对蛋白预处理采用单一的加热预处理方法居多，还有一些专利报道了加热联合新型技术预处理的方法，新型技术比如超声波处理、高压均质等。专利cn111549086a中，以玉米蛋白粉为原料，先对蛋白粉进行90-120℃的加热预处理，然后加入一定配比的复合酶(碱性蛋白酶/中性蛋白酶/风味蛋白酶)水解得到玉米蛋白肽。专利cn108130354a中，以玉米蛋白为原料，超声波联合加热预处理蛋白，并用碱性蛋白酶酶解，获得低苦味，分子量更小的玉米蛋白肽。上述预处理手段中的单一处理会导致蛋白变性程度不够或者变性效果不利于目标肽段的生成，而现报道的联合蛋白预处理方式又以加热联合处理居多，在能源的绿色开发和节能环保方面不占优势，且在热敏性食品加工领域有一定局限性。


技术实现要素：

7.超声波和脉冲电场都属于绿色的非热加工技术，被广泛应用在食源性蛋白的改性
设计中，均能显著提高蛋白食品的营养和功能特性。但是，目前尚未有专利或论文介绍过将超声波和脉冲电场两种技术联合并辅助食源蛋白酶解的研究，尤其是在降糖肽的开发及应用上更是没有报道。
8.有鉴于此，本发明提供了一种薏仁醇溶蛋白降糖肽及其制备方法与应用，通过超声波联合脉冲电场辅助酶解的技术制备一种具有降血糖特性并且能用作健康食品添加剂的薏仁醇溶蛋白降糖肽，所得薏仁醇溶蛋白降糖肽不仅可以解决现阶段薏仁蛋白衍生产品开发力度不足的难题，也为降糖类健康食品功能组分的构建提供更多选择，满足不同人群的消费需求。
9.本发明提供如下方案：
10.一种薏仁醇溶蛋白降糖肽的制备方法，以薏仁醇溶蛋白为原料，利用超声波联合脉冲电场处理，再经过酶解处理得到薏仁醇溶蛋白降糖肽。
11.其中，薏仁醇溶蛋白的制备方法如下：将脱脂处理后的薏仁粉烘干得到脱脂薏仁粉，将脱脂薏仁粉与提取液混合超声处理以辅助提取蛋白，完成后将混合溶液离心，将上清液与等体积去离子水混合以析出薏仁醇溶蛋白。
12.进一步地，所述超声波联合脉冲电场处理为首先对薏仁醇溶蛋白溶液进行超声处理，然后对超声处理后的薏仁醇溶蛋白溶液进行脉冲电场处理。
13.本发明首先对薏仁醇溶蛋白进行超声波处理，当以水为介质时，超声波能够引起介质的空化效应，即液体分子在拉力和压力快速变化的作用下产生空穴，空化效应所造成的瞬时高压和局部高温可以使蛋白质空间结构部分舒展，降低了蛋白质分子间的作用力，超声过程中所产生的局部高温加剧了蛋白质分子的运动和相互之间的反应，促使部分肽键断裂；然后，本发明又施加脉冲电场，在脉冲电场的作用下，水分子配位能力增大，同时，当脉冲电场作用于蛋白质分子时，蛋白质分子表面的离子会受到电场作用力，诱导蛋白质表面氨基酸分子极化，破坏维持蛋白质分子结构的疏水相互作用和静电相互作用，促使蛋白质分子翻转，分子内部的极性氨基酸暴露，同时较高场强诱导疏水性氨基酸分子极化，影响二硫键和其他键型，最后使蛋白质空间结构和亚基组成发生改变。经过超声波联合脉冲电场处理的薏仁醇溶蛋白在酶的作用下能够快速且充分地进行酶切反应，更大概率释放大量具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的生物活性肽片段，最终得到小分子的薏仁醇溶蛋白肽。
14.更进一步地，超声功率为300-500w，超声频率为40-60khz，超声温度为25-40℃，超声时间为20min-40min。
15.更进一步地，所述脉冲电场处理的条件为：电位差为7000-8000v，脉冲宽度为20-40μs，脉冲频率为10-20hz，脉冲数为100，脉冲时间为20-40min。
16.进一步地，所述酶解处理中的酶为碱性蛋白酶。
17.更进一步地，所述酶解处理中底物的质量浓度为4％，所述碱性蛋白酶的添加量为8000u/g，酶解的反应温度为50℃，反应ph为9.0，反应时间为2h。
18.本发明还提供了通过上述制备方法得到的一种薏仁醇溶蛋白降糖肽，以及该薏仁醇溶蛋白降糖肽作为降糖类食品功能组分的应用。
19.本发明的有益效果：
20.(1)本发明采用超声波联合脉冲电场辅助酶解的技术，以薏仁醇溶蛋白为原料制备得到了具有降血糖活性的薏仁醇溶蛋白肽。其中超声波联合脉冲电场对薏仁醇溶蛋白的
预处理有助于打开薏仁醇溶蛋白紧凑的结构，促进后续酶解反应发生，更大概率释放大量具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的生物活性肽片段。
21.(2)本发明提供的一种薏仁醇溶蛋白降糖肽制备方法是一种非热加工、绿色、高效、易于推广的辅助酶解技术，操作过程不涉及任何对人体有毒有害物质，原料来源广泛，工艺简单，反应可控，耗能低，是一种易于推广，操作性强，可用于工业化大规模生产的薏仁蛋白肽制备工艺。
22.(3)本发明还检验了该联合技术在降糖肽高品质生产上的优势，本发明制备得到的薏仁醇溶蛋白降糖肽的降糖效果明显，本发明提供的薏仁醇溶蛋白降糖肽在各种常见的食品加工环境或不同食品体系中均能保持良好的降血糖活性，适合于作为一种具有降血糖食物组分加入到健康食品体系中，充分发挥其降糖功效，最终产品以短肽组分为主，易于人体消化利用，营养价值较高，同时该薏仁醇溶蛋白降糖肽能有效抵抗消化酶的侵扰，具有良好的生物利用度。
23.(4)本发明将利用率低但具备潜在抗ii型糖尿病的薏仁醇溶蛋白开发成薏仁醇溶蛋白降糖肽，不仅促进了薏仁蛋白资源的整合和更大程度的合理利用，而且填补了国内外对薏仁蛋白源降糖肽高效开发及利用上的空白，具有显著社会和经济效益。
24.(5)本发明采用的超声波联合脉冲电场辅助酶解的技术可作为一种高效制备降血糖活性蛋白肽的高效技术，该技术可以适用于其他与薏仁醇溶蛋白具有相似结构的谷物蛋白如小麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白、玉米醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白等，这些谷物蛋白可在生产降糖肽时直接进行技术套用，降低相关研发成本。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1为实施例1的制备工艺流程图；
27.图2对照例1-8和实施例1-3所得薏仁醇溶蛋白降糖肽的水解度比较图；
28.图3为对照例1-8和实施例1-3的多肽得率比较图；
29.图4为对照例1-8和实施例1-3所得薏仁醇溶蛋白降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性比较图；
30.图5为实施例2所得薏仁醇溶蛋白降糖肽在不同温度下α-葡萄糖苷酶抑制活性比较图；
31.图6为实施例2所得薏仁醇溶蛋白降糖肽在不同ph下α-葡萄糖苷酶抑制活性比较图。
具体实施方式
32.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
33.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发
明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
34.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
35.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
36.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
37.本发明的室温指的是25
±
2℃。
38.本发明提供了一种薏仁醇溶蛋白降糖肽的制备方法，以薏仁醇溶蛋白为原料，利用超声波联合脉冲电场处理，再经过酶解得到薏仁醇溶蛋白降糖肽。
39.本发明的一些优选实施例中制备薏仁醇溶蛋白的方法为：将薏仁用超微粉碎机处理后过80目筛，将过筛得到的薏仁粉按质量体积比1∶5置于石油醚中进行脱脂，之后烘干得到脱脂薏仁粉。然后，将脱脂薏仁粉与提取液按照料液比1∶6(w/v)的比例进行蛋白的提取，期间施加超声处理(功率250w、频率40khz、温度40℃)30min以辅助提取，完成后将混合溶液离心(4000rpm，20min)，并将上清液与等体积的去离子水混合以析出薏仁醇溶蛋白。其中，提取液用80％乙醇溶液、1mg/ml二硫苏糖醇溶液、3mol/ml乙酸钠溶液按照体积比100:1:1配置而成。
40.本发明的一些优选实施例中，超声波联合脉冲电场对薏仁醇溶蛋白的预处理：取薏仁醇溶蛋白溶于去离子水中，使用磁力搅拌器500rpm搅拌30min，接着将混合溶液转移到超声波清洗器中进行超声波处理，完成后取出，然后将样品置于脉冲电场反应器中进行脉冲电场处理。
41.超声功率过高易引发薏仁醇溶蛋白的聚集效应，掩盖酶切位点，同时也会对粒径、溶解性等特性造成负面影响；超声功率过低易导致薏仁醇溶蛋白的改性效果不显著，蛋白展开程度不足以实现良好水解效果，因此本发明一些优先实施例将超声功率设定为300
ꢀ‑
500w。
42.超声频率过高会导致超声波产生空化效应所对应的空化核尺寸变小，最终空化作用偏小；超声频率过低会空化核的固有频率未能与超声波频率同步，缩减空化效果，总之，适当的超声频率有助于合理调控空化核的频率，使其达到与超声频率相接近以实现最佳能量耦合，保证最佳改性效果。因此本发明一些优先实施例将超声频率设定为40
ꢀ‑
60khz。
43.超声温度过高会导致薏仁醇溶蛋白出现热聚集作用，形成大尺寸的蛋白聚集体，影响功能特性的同时也会降低酶解效率；超声温度过低会出现超声波作用受阻的情况，低温不仅影响薏仁醇溶蛋白在溶液中的自由流动，减少该体系下分子间的碰撞频次，更不利
于空化效应的大限度释放，从而导致改性效果不佳，因此本发明一些优先实施例将超声温度设定为25-40℃。
44.超声时间过长会导致薏仁醇溶蛋白改性程度过高，打断一些活性肽序列，使其活性发挥受阻，同时长时间超声处理会使反应溶液水体发热，间接引起薏仁醇溶蛋白热聚集反应；超声时间过短会出现改性效果不明显的情况，短时间的超声波不利于薏仁醇溶蛋白结构的充分舒展，活性位点暴露不足，最终导致酶解效率不高，因此本发明一些优先实施例将超声时间设定为20min～40min。
45.由于脉冲电场处理相关参数的过高或过低均会最终影响产物的肽得率和体外降血糖活力，对产品功能产生负面影响，本发明通过调试各参数范围，使其能达到优异的薏仁醇溶蛋白改性效果，因此，本发明一些优先实施例将脉冲电场处理的条件设定为：电位差为7000-8000v，脉冲宽度为20-40μs，脉冲频率为10-20hz，脉冲数为100，脉冲时间为20-40min。
46.本发明一些优选实施例中的酶解处理中的酶为碱性蛋白酶，选择碱性蛋白酶的依据为一是碱性蛋白酶是一种广谱蛋白酶，特异性切割疏水性氨基酸侧链，有利于释放高活性α-葡萄糖抑制肽；二是本发明发现碱性蛋白酶得到的薏仁醇溶蛋白肽的水解度和α-葡萄糖抑制率最优，适合薏仁醇溶蛋白降糖肽的生产，酶解处理中底物的质量浓度为4％(w/v)，碱性蛋白酶的添加量为8000u/g，酶解处理的反应温度为50℃，反应ph为9.0，反应时间为2h。
47.本发明实施例中所用碱性蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司，货号为s10154-500g。
48.本发明还提供了通过如上制备方法得到的一种薏仁醇溶蛋白降糖肽，以及该薏仁醇溶蛋白降糖肽作为降糖类食品功能组分的应用。
49.实施例1一种薏仁醇溶蛋白降糖肽的制备方法
50.步骤一：将薏仁用超微粉碎机处理后过80目筛，与石油醚1∶5(w/v)混合脱脂，获得脱脂薏仁粉。薏仁醇溶蛋白提取采用醇溶水沉法：将80％乙醇溶液、1mg/ml二硫苏糖醇溶液和3mol/l乙酸钠溶液按体积比100∶1∶1制成蛋白提取液，并与脱脂薏仁粉混合，总料液比为1∶6(w/v)。将混合溶液超声处理(功率250w、频率40khz、温度40℃)30min以辅助提取，完成后将混合溶液离心(4000rpm，20min)，并将上清液与等体积的去离子水混合以析出薏仁醇溶蛋白，最后将样品置于4℃条件下透析24h并冻干备用，薏仁醇溶蛋白提取率为32.88
±
1.07％，纯度为83.78
±
1.95％。
51.步骤二：先将2g薏仁醇溶蛋白与50ml去离子水混合以配置成4％(wt％)的蛋白溶液，使用磁力搅拌器搅拌(500rpm，30min)；然后利用超声波清洗器对蛋白溶液进行超声处理(300w，40khz，25℃，20min)，完成后使用脉冲电场反应器对样品进行脉冲电场处理(电位差7000v，脉冲宽度20μs，脉冲频率10hz，脉冲数为100，反应时间为20min)。
52.步骤三：向步骤二处理后的样品加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解反应条件为蛋白底物浓度4％(w/v)、酶添加量为8000u/g、ph为9.0、反应温度为50℃，反应时间为2h，期间添加1mol/ml的氢氧化钠溶液维持反应所需ph值，酶解完成后，沸水浴灭酶10min，然后流动水冷却。将上述酶解液离心处理后进行旋转蒸发以浓缩多肽溶液，待浓缩后体积到达原体积五分之一时取出，冷冻干燥后获得薏仁醇溶蛋白降糖肽。图1为本实施例制备工艺流程图。
53.实施例2一种薏仁醇溶蛋白降糖肽的制备方法
54.同实施例1，不同之处在于步骤二中的超声时间为30min，脉冲电场处理时间为30min。
55.实施例3一种薏仁醇溶蛋白降糖肽的制备方法
56.同实施例1，不同之处在于步骤二中的超声时间为40min，脉冲电场处理时间为40min。
57.对照例1
58.同实施例1，不同之处在于为将2g薏仁醇溶蛋白直接酶解处理。
59.对照例2
60.同实施例1，不同之处在于将步骤一所得薏仁醇溶蛋白进行超声波处理后直接酶解处理。
61.对照例3
62.同实施例1，不同之处在于将步骤一所得薏仁醇溶蛋白未进行超声波处理，仅进行脉冲电场处理后进行酶解处理。
63.对照例4
64.同实施例1，不同之处在于先进行脉冲电场处理再进行超声波处理。
65.对照例5
66.同实施例1，不同之处在于超声处理时间为50min。
67.对照例6
68.同实施例1，不同之处在于超声处理时间为10min。
69.对照例7
70.同实施例1，不同之处在于脉冲电场处理时间为50min。
71.对照例8
72.同实施例1，不同之处在于脉冲电场处理时间为10min。
73.测试试验
74.对实施例1-3和对照例1-8所获得的薏仁醇溶蛋白降糖肽进行测试，分别测试所得薏仁醇溶蛋白降糖肽的水解度和肽含量，并考察不同加工条件(温度、ph)、不同食品添加剂组分(氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、柠檬酸、柠檬黄、胭脂红)和体外消化对薏仁醇溶蛋白降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响。
75.1.水解度测试
76.本次试验的水解度(degree of hydrolysis，dh)测定采用ph-stat法，水解度是蛋白质分子中由于酶法水解而断裂的肽键占蛋白质分子中总肽键的比例，可以表征蛋白的水解程度。取用碱性蛋白酶水解过程中所消耗的1mol/l naoh体积来计算各反应阶段的dh，计算公式如下：
[0077][0078]
式中，v：naoh溶液消耗量(ml)；n：naoh溶液浓度(mol/l)；α：0.985，底物蛋白中的α-nh2的平均解离度；η：薏仁醇溶蛋白样品中总蛋白含量(g/g)；m：薏苡仁醇溶蛋白样品质量(g)；h
tot
：单位质量原料薏仁蛋白质中肽键的毫摩尔数，为8.3mmol/g。
[0079]
对照例1-8和实施例1-3所得薏仁醇溶蛋白降糖肽的水解度比较图如图2所示。由图2可知，与对照例1相比，经过单独脉冲电场处理(对照例3)和单独超声(对照例2)所获得的酶解物的水解度要明显高于未预处理组(对照例1)，这主要是因为超声波或脉冲电场预处理导致薏仁醇溶蛋白的有序结构展开，无序程度上升，底物蛋白中与碱性蛋白酶结合的特异性位点得以暴露，酶切频率提升，最终水解程度提高。
[0080]
同时，在实施例1-3中，水解度较对照例1-3有了更高程度的提高，并且实施例2(超声波联合脉冲电场预处理薏仁醇溶蛋白30min)的水解度最高，较单独超声波处理30min(对照例2)和单独脉冲电场处理30min(对照例3)处理组上升幅度较大，这表明联合预处理能够进一步放大薏仁醇溶蛋白的展开程度，使得蛋白的水解程度较高，这同时也意味着实施例1-3获得的薏仁醇溶蛋白降糖肽以小肽段为主，小肽段有助于发挥更强的降血糖效果和更便于机体的吸收利用。
[0081]
同实施例1相比(水解度为33.03
±
0.82％)，对照例4先进行脉冲电场处理再进行超声波处理，造成水解度降低(26.99
±
2.39％)，降低了6.04％，表明先超声波处理再进行脉冲电场处理的这种预处理方式更合适获得水解度更高的薏仁醇溶蛋白肽。
[0082]
同实施例1相比，对照例5-8调整了处理时间，造成水解度降低，证明本发明提供的处理时间的范围更有利于薏仁醇溶蛋白的定向改性程度，使得碱性蛋白酶更易于进入展开的分子口袋，识别并切割肽段。
[0083]
2.肽含量及肽得率测试
[0084]
肽含量的测定采用三氯乙酸沉淀法。通过向酶解液中加入三氯乙酸溶液，可以沉淀未被酶解的薏仁醇溶蛋白，且将酶解液的小分子肽段完整保留下来。具体实施操作是：酶解结束后，取一定量酶解液，加入等体积的15％(wt％)的三氯乙酸来沉淀未水解的薏仁醇溶蛋白，之后进行沸水浴灭酶15min，冷却后离心(10000rpm，10min)取上清液，采用凯式定氮法测定上清液的多肽含量，并经过计算得到多肽得率，对照例1-8和实施例1-3的肽得率比较结果图见图3。
[0085]
由图3可知，实施例1-3的多肽得率要远高于对照例1-8，多肽得率在84.02～86.12％范围内，其中实施例2最高，达到86.12
±
1.33％，说明在这种酶解工艺下，有86.12％的薏仁醇溶蛋白转化为多肽，结果与水解度的分析相一致。超声波联合脉冲电场的蛋白预处理方式与单一处理相比，更能有利于薏仁醇溶蛋白暴露酶解位点，酶切频率增加同时蛋白参与反应的程度更高，并且更多大分子肽段被切割为小分子肽段。这种超声波联合脉冲电场辅助酶解的技术(实施例1-3)不仅提升了薏仁醇溶蛋白肽的转化率，更为大量小分子肽的获得提供了技术优势。
[0086]
对照例4先进行脉冲电场处理再进行超声波处理，其多肽得率为73.22
±
3.83％，低于实施例1(先超声波处理后脉冲电场处理)，原因在于脉冲电场主要是对维持薏仁醇溶蛋白的非共价键(氢键、疏水相互作用力)和共价键(二硫键)进行破坏，从而展开分子结构，在此基础上进一步超声处理(空化)极有可能引起已舒展的分子结构重新折叠，重新掩埋酶解位点，酶解效率下降，肽得率下降。
[0087]
对照例5-8由于调整了处理时间，造成所得肽得率低于实施例1-3，这也表明过度处理时间过长或处理时间不足对薏仁醇溶蛋白肽的获得都是不利的，处理时间过短使得改性效果不明显，薏仁醇溶蛋白结构的展开程度有效，未能暴露足够的酶切位点，处理时间过
长又会使超声波或脉冲电场对已经舒展的分子结构进行破坏，影响酶解效果。
[0088]
3.α-葡萄糖苷酶抑制活性测试
[0089]
用pnpg法进行α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定，具体操作如下：用0.1mol/l，ph6.8的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，pbs)将α-葡萄糖苷酶和pnpg分别配置成0.06u/ml和2.5mmol/l的溶液，吸取50μl样品溶液和50μlα-葡萄糖苷酶溶液于96孔微量滴定板中，混合均匀后置于37℃的恒温培养箱中孵育10min，然后加入50μl pnpg溶液，置于37℃的恒温培养箱继续孵育30min，完成后加入100ml 0.5mol/l的无水na2co3溶液以终止反应。采用酶标仪在405nm波长处测定其吸光度值。试验设置样品组：样品+α-葡萄糖苷酶+pnpg；样品对比组：pbs+α-葡萄糖苷酶+pnpg；空白组：pbs+α-葡萄糖苷酶+pnpg；空白对比组：pbs+pbs+pnpg。计算公式如下：
[0090]
α-葡萄糖苷酶抑制率(％)＝(样品组吸光度值-样品对比组吸光度值)/(空白组吸光度值-空白对比组吸光度值)
×
100％
[0091]
为评价各对照例和实施例所得薏仁醇溶蛋白降糖肽对α-葡萄糖苷酶的抑制能力，将冻干的薏仁醇溶蛋白降糖肽配制成1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、50mg/ml的6个浓度梯度，按活性测试方法测定各肽浓度下的α-葡萄糖苷酶抑制率，以计算薏仁醇溶蛋白降糖肽的半抑制浓度(ic
50
值)，对照例1-8和实施例1-3所得薏仁醇溶蛋白降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性比较结果见图4。
[0092]
如图4所示，对照例1-3的ic
50
值分别为15.30
±
0.68mg/ml、12.44
±
0.64mg/ml、10.17
±
0.35mg/ml，对照例4的ic
50
值分别为11.23
±
0.32mg/ml，对照例5-8的ic
50
值分别为10.28
±
0.13mg/ml、12.82
±
0.73mg/ml、10.29
±
0.21mg/ml、10.02
±
0.23mg/ml，实施例1-3的ic
50
值分别为9.31
±
0.62mg/ml、7.12
±
0.33mg/ml、8.02
±
0.91mg/ml。
[0093]
结果显示，经过超声波联合脉冲电场处理的薏仁醇溶蛋白所制得的酶解物(实施例1-3)的α-葡萄糖苷酶的抑制活力要强于空白组或单一处理组(对照例1～3)，这主要是因为联合预处理下所制得的酶解物中肽段丰富度更高，具有更多带有抑制α-葡萄糖苷酶的小分子肽段。其中，实施例2的抑制效果最好，这样侧面表明适度预处理(超声波30min+脉冲电场30min)是制备高降糖活性薏仁醇溶蛋白肽的关键，对照例5和7处理时间过长，过度处理反而会因为酶解效率的过度提高破坏原有带高α-葡萄糖苷酶抑制活性的肽段，导致负面影响。对照例6和8处理时间过短，造成薏仁醇溶蛋白改性不彻底，水解程度不高，未能充分释放高活性α-葡萄糖苷酶抑制肽。
[0094]
综合以上测试，我们得知实施例2在水解度、多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制活性与实施例1和实施例3相比具处于优势水平，效果更明显。因此，接下来我们重点考察了实施例2制备的薏仁醇溶蛋白降糖肽的降血糖活性受温度、ph、食品添加剂的影响，充分验证了其作为食品组分的可能性。
[0095]
4.温度和ph对薏仁醇溶蛋白降糖肽的降血糖活性的影响
[0096]
将2mg/ml的实施例2制备的薏仁醇溶蛋白降糖肽溶液分别放置在25、40、55、70、85、100℃的水浴中保持2h，取样后冷却至室温并进行α-葡萄糖苷酶抑制活性测试，结果见图5实施例2所得薏仁醇溶蛋白降糖肽在不同温度下α-葡萄糖苷酶抑制活性比较图。
[0097]
如图5所示，薏仁醇溶蛋白降糖肽在25、40、55、70、85、100℃的环境下α-葡萄糖苷酶抑制活性没有显著变化，表明薏仁醇溶蛋白降糖肽可以经受食品加工中的多变温度条
件，从而保证其优异的降血糖活性。
[0098]
配制2mg/ml的实施例2制备的薏仁醇溶蛋白降糖肽溶液，用1mol/ml hcl或naoh溶液调整ph至2、4、6、8、10、12，每个ph条件下样品静置2h，完成后调节ph至6.8，并α-葡萄糖苷酶抑制活性测试，结果见图6实施例2所得薏仁醇溶蛋白降糖肽在不同ph下α-葡萄糖苷酶抑制活性比较图。
[0099]
如图6所示，薏仁醇溶蛋白降糖肽在中性ph环境下(ph6-8)α-葡萄糖苷酶抑制活性良好，但在酸性(ph 2-4)和碱性(ph 10-12)环境下活性有部分丧失，但仍能保持在最好状态的66.67％-87.92％，这表明薏仁醇溶蛋白降糖肽适合加入到各种酸碱环境的口服液或饮料等食品体系中，并在该体系中发挥足够的降血糖活性。
[0100]
5.食品添加剂对薏仁醇溶蛋白降糖肽的降血糖活性的影响
[0101]
向2mg/ml的实施例2制备的薏仁醇溶蛋白降糖肽溶液中添加氯化钠，保证氯化钠浓度为2、4、6、8、10g/100ml，静置2h后测α-葡萄糖苷酶抑制活性，以上实验重复3次，结果取平均值，结果见表1。
[0102]
表1
[0103][0104]
向2mg/ml的实施例2制备的薏仁醇溶蛋白降糖肽溶液中添加柠檬酸、苯甲酸钠、山梨酸钾，保证柠檬酸、苯甲酸钠和山梨酸钾溶液浓度为0.04、0.08、0.12、0.16、0.2g/100ml，静置2h后测α-葡萄糖苷酶抑制活性，以上实验重复3次，结果取平均值，结果见表2。
[0105]
表2
[0106][0107]
向2mg/ml的实施例2制备的薏仁醇溶蛋白降糖肽溶液中添加柠檬黄、胭脂红。保证柠檬黄和胭脂红溶液浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/ml，静置2h后测α-葡萄糖苷酶
抑制活性，以上实验重复3次，结果取平均值，结果见表3。
[0108]
表3
[0109][0110][0111]
如表1、表2和表3所示，薏仁醇溶蛋白降糖肽在不同浓度的食用盐、不同浓度防腐剂(柠檬酸、苯甲酸钠和山梨酸钾)、不同浓度食用色素(柠檬黄和胭脂红)的条件下，其α-葡萄糖苷酶抑制率均能保持良好，活性没有因为各类食品添加剂的加入而受到影响，这表明本发明提供的薏仁醇溶蛋白降糖肽能够适应复杂食品体系的环境，能与食用盐、防腐剂和食用色素等食品添加剂共存，反映了薏仁醇溶蛋白肽作为降血糖食品组分的巨大潜力。
[0112]
6.薏仁醇溶蛋白降糖肽的消化特性
[0113]
将40mg的冻干的实施例2制备的薏仁醇溶蛋白降糖肽装入消化瓶中，并于37℃、200rpm水浴摇床中进行消化试验。首先加入10ml ph6.8的人工唾液至消化体系中，消化反应5min以模拟口腔消化阶段，完成后迅速沸水浴灭酶15min，冷却后用1mol/ml hcl调整ph至3.0；然后加入10ml ph3.0的人工胃液，消化反应2h来模拟胃消化阶段，完成后沸水浴灭酶15min，冷却后用1mol/ml naoh溶液将消化体系的ph调至7.0；最后在该消化体系中加入15ml ph 7.0的人工小肠液，并反应3h来模拟小肠消化阶段，完成后沸水浴灭酶15min，在体外模拟消化的各阶段测定消化液的薏仁醇溶蛋白降糖肽含量和α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果见表4。
[0114]
表4
[0115][0116][0117]
如表4所示，本发明实施例2制备的薏仁醇溶蛋白降糖肽在经过口腔-胃-小肠的连续消化后，肽含量和α-葡萄糖苷酶抑制活性分别维持在起始原料的76.86％、78.86％。表明薏仁醇溶蛋白降糖肽作为食品经口摄入后，能有效抵御机体内消化系统的消化酶干扰，能在机体内有效且完整地发挥降血糖功效，具有良好的生物利用度。
[0118]
如上测试试验证明了本发明设计了一种超声波联合脉冲电场辅助酶解的非热绿
色加工技术用于薏仁醇溶蛋白降糖肽的生产，极大地改善了薏仁醇溶蛋白降糖肽的转化率，并获得了优异的α-葡萄糖苷酶抑制活性，这项技术为薏仁醇溶蛋白降糖肽赋值，让其保证优良营养属性的同时兼具降血糖活性，并在为其作为一类以降血糖为特征的功能性食品添加剂的开发提供前期技术支持。
[0119]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种薏仁醇溶蛋白降糖肽的制备方法，其特征在于，以薏仁醇溶蛋白为原料，利用超声波联合脉冲电场处理，再经过酶解处理得到薏仁醇溶蛋白降糖肽。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超声波联合脉冲电场处理为首先对薏仁醇溶蛋白溶液进行超声处理，然后对超声处理后的薏仁醇溶蛋白溶液进行脉冲电场处理。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，超声功率为300-500w，超声频率为40-60khz，超声温度为25-40℃，超声时间为20min-40min。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述脉冲电场处理的条件为：电位差为7000-8000v，脉冲宽度为20-40μs，脉冲频率为10-20hz，脉冲数为100，脉冲时间为20-40min。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解处理中的酶为碱性蛋白酶。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述酶解处理中底物的浓度为4％(w/v)，所述碱性蛋白酶的添加量为8000u/g，所述酶解处理的反应温度为50℃，反应ph为9.0，反应时间为2h。7.一种薏仁醇溶蛋白降糖肽，其特征在于，通过权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到。8.一种薏仁醇溶蛋白降糖肽作为降糖类食品功能组分的应用。

技术总结
本发明公开了一种薏仁醇溶蛋白降糖肽及其制备方法与应用，属于食品加工领域，本发明以薏仁醇溶蛋白为原料，利用超声波联合脉冲电场处理，再经过酶解处理得到薏仁醇溶蛋白降糖肽，不仅解决了现阶段薏仁蛋白衍生产品开发力度不足的难题，也为降糖类健康食品功能组分的构建提供了更多选择。构建提供了更多选择。构建提供了更多选择。


技术研发人员：张东杰 李志明 张舒 宋雪健 孟维洪 张家瑜
受保护的技术使用者：黑龙江八一农垦大学
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/8/9